CN115961036A - 用于原发性肝癌早期复发分子诊断的标志物、试剂和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学与生物医药技术领域，提供用于原发性肝癌早期复发分子诊断的标志物、试剂和试剂盒，所述标志物为HAND2‑AS1基因或者lncBC200基因或者HAND2‑AS1基因与lncBC200基因的组合，所述HAND2‑AS1基因和lncBC200基因的序列参见SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。试剂和试剂盒中含有定量检测HAND2‑AS1基因或者lncBC200基因的PCR引物对。本发明的试剂盒可大幅提高原发性肝癌早期复发诊断的敏感度和特异性，为肝癌的检测提供了一种可靠的方法。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤分子生物学及生物检测技术领域，具体涉及用于原发性肝癌早期复发分子诊断的标志物、试剂和试剂盒。
背景技术
肝癌是全球第六大高发病，是癌症死亡相关第三大恶性肿瘤，其发病率和死亡率近年来呈显著上升趋势。肝癌的复发、转移是临床病人死亡的主要原因，五年存活率只有9％。肿瘤标志物在肿瘤普查、诊断、判断预后、评价治疗疗效和高危人群随访等方面都具有较大的实用价值，是目前肿瘤学研究的关键问题之一。尽管目前有一些肝癌标志物，但常用血清诊断标志物甲胎蛋白(AFP)其敏感性仅在60％左右，特异性为80％。敏感性和特异性均不高，所以到目前为止迫切需要筛选和发现新的早期诊断及预测肝癌预后的分子诊断标志物。
长非编码RNA(lncRNA)是一类新的非编码RNA(>200个核苷酸)，近年来的研究表明，lncRNA参与了X染色体沉默，基因组印记以及染色质修饰，转录激活，转录干扰，核内运输等多种重要的调控过程，lncRNA的这些调控作用已经引起人们广泛的关注。越来越多的肿瘤相关的lncRNAs被发现，这些lncRNAs通过影响肿瘤细胞的生长、凋亡、浸润与转移等成为新的肿瘤标志物和药物靶标的重要来源。lncRNAHULC、lncRNA PVT1、lncRNA ATB、lncRNADANCR、lncRNA HEIH等先后被报道在原发性肝癌组织中差异表达，与肝癌发生发展密切相关，可作为肝癌生物学标志物、预后判断的参考指标。
然而，目前还没有以HAND2-AS1基因、lncBC200基因为标志物进行原发性肝癌早期复发分子诊断的相关报道。
发明内容
本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供用于原发性肝癌早期复发分子诊断的标志物、试剂和试剂盒，通过以HAND2-AS1基因和/或lncBC200基因为标志物，可大幅提高原发性肝癌早期复发的敏感度和特异性，为肝癌的检测提供了一种可靠的方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
用于原发性肝癌早期复发分子诊断的标志物，所述标志物为HAND2-AS1基因或者lncBC200基因或者HAND2-AS1基因与lncBC200基因的组合，所述HAND2-AS1基因和lncBC200基因的序列参见SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
本发明还提供上述标志物在制备原发性肝癌早期复发分子诊断试剂或试剂盒中的应用。
本发明还提供用于原发性肝癌早期复发分子诊断的试剂，所述试剂是指检测权利要求1所述标志物的表达量的试剂。
进一步地，所述试剂包含标志物基因引物、内参GAPDH基因引物、DNA/RNA标准品、RNA抽提体系、RNA逆转录反应体系和Real-Time PCR反应体系；所述基因引物为HAND2-AS1基因引物或/和lncRNA-BC200基因引物。
进一步地，所述HAND2-AS1基因、lncRNA-BC200基因和内参GAPDH基因的引物序列如下：
HAND2-AS1正向引物：5'-TTGGGCGATTTTGAAGTGCG-3'(SEQ ID NO.4)
HAND2-AS1反向引物：5'-GGTGGAGAGGACTGGTTTCG-3'(SEQ ID NO.5)
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GAPDH正向引物：5'-AGCCACATCGCTCAGACA-3'(SEQ ID NO.8)
GAPDH反向引物：5'-GCCCAATACGACCAAATCC-3'(SEQ ID NO.9)。
本发明还提供用于原发性肝癌早期复发分子诊断的试剂盒，所述试剂盒包含前述的试剂。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本申请人经过研究发现，长链非编码RNA HAND2-AS1、lnc-BC200在肝癌和旁组织中具有特异性的差异表达，前期我们收集首诊为肝癌(两年内复发或两年内未复发患者)血清，进行基因芯片和测序，将标准化后的数据进行差异基因的筛选，共有107个lncRNAs上调，21个下调；我们挑选出HAND2-AS1、lnc-BC200进行后续实验研究。发现结果是其中lncRNA HAND2-AS1在肝癌组织中低表达，而lncBC200在肝癌组织中高表达。这与测序结果一致，并且通过ROC诊断曲线分析发现HAND2-AS1对于肝癌的诊断具有较高的敏感性和特异性，且lnc-BC200在肝癌组织中的表达水平与患者复发转移呈正相关(P＝0.041)，说明HAND2-AS1、lnc-BC200可以成为肝癌早期复发的一个肿瘤标志物，因此HAND2-AS1、lnc-BC200基因能够应用于制备肝癌早期复发分子诊断试剂盒中，对疾病具有较好诊断价值。
2、本发明试剂盒对临床肝癌患者血清进行分析，利用相对定量Real-timePCR的方法来检测肝癌患者中HAND2-AS1、lnc-BC200基因相对于内参基因的表达量，并据此判断患者预后。本发明的试剂盒需要的检材更少，诊断结果更为快速准确，有助于优化对肿瘤患者的个体化治疗方案，提高治疗效果。本发明的试剂盒还具有灵敏度高、操作简单、成本低等特点。
附图说明
图1是HAND2-AS1在肝癌组织中表达情况；
图2是lnc-BC200在肝癌组织中表达情况；
图3是为HAND2-AS1在肝癌中诊断性ROC曲线；
图4为lnc-BC200在肝癌中诊断性ROC曲线；
图5为HAND2-AS1和lnc-BC200联用在肝癌中诊断性ROC曲线。
具体实施方式
为了更清楚地表达本发明，以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。本发明所涉及的HAND2-AS1、lnc-BC200和内参基因的序列参见SEQ ID NO.1-3。本发明试剂盒的相关设计实施如下：
实施例1HAND2-AS1、lnc-BC200在肝癌组织中特异性表达实验研究
1、实验对象：
从广西医科大学附属肿瘤医院获得47例肝癌及其癌旁组织。将组织储存在-80℃，所有程序均经广西医科大学附属肿瘤医院伦理委员会批准。从每位患者获得签署的知情同意书。采用47例肝癌及其癌旁组织中HAND2-AS1的表达水平进行检测，采用45例对肝癌及其癌旁组织中lnc-BC200的表达水平进行检测。
2、实验方法
2.1组织RNA的提取
(1)称取1mg样品组织，放入已用DEPC水处理过的研钵中，加入适量液氮研磨成粉末状，加入1ml Trzol，充分吹打混匀，使细胞充分裂解，将裂解液转移至1.5ml Rnase freeEP管中，冰上静置5-10min。
(2)向EP管中加入200ul氯仿，剧烈振荡30s，保证裂解液与氯仿充分混匀，冰上静置5-10min。
(3)将EP管放入已预冷至4℃的离心机中，12000g离心15min,取上层水相，转移至另一个新的1.5ml无酶管中。
(4)向EP管加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，冰上静置10min，保证RNA充分沉淀。
(5)12000g离心15min，弃上清。
(6)用预冷的75％无水乙醇洗涤RNA沉淀，12000g离心10min，去上清。重复2次。超净台自然晾干。
(7)加入适量DEPC处理水溶解RNA沉淀。
(8)分光光度计检测RNA浓度和260nm、280nm的吸光值。
(9)利用1％琼脂糖凝胶电泳，110V 20min，用凝胶成像系统观察RNA电泳结果，呈现5sRNA、18sRNA、28sRNA条带即可证明总RNA较完整。
2.2将样本总RNA逆转为cDNA
将提取的总RNA放置于冰上，防止其降解，利用逆转录试剂盒将总RNA转录为cDNA。反应体系为：oligo(dT)18 100μM 120μL、dNTPs 10mM 250μL、5×First-Strand Buffer500μL、RNA酶抑制剂20U/μL 120μL、M-MuLV逆转录酶200U/μL 120μL和Nuclease-FreeWater。
逆转录反应条件：42℃孵育2min，37℃15min，85℃5s灭活逆转录酶活性，最终降温至4℃。
2.3Real-Time PCR检测
上述逆转得到的cDNA为模板，采用本发明试剂盒提供的GAPDH组和HAND2-AS1、lnc-BC200组引物，配制PCR反应体系，每孔体积为20μL，反应体系如下：
所述HAND2-AS1基因、lncRNA-BC200基因和内参GAPDH基因的引物序列如下：
HAND2-AS1正向引物：5'-TTGGGCGATTTTGAAGTGCG-3'(SEQ ID NO.4)
HAND2-AS1反向引物：5'-GGTGGAGAGGACTGGTTTCG-3'(SEQ ID NO.5)
lncBC200正向引物：5'-GCCTGTAATCCCAGCTCTCA-3'(SEQ ID NO.6)
lncBC200反向引物：5'-GTTGCTTTGAGGGAAGTTACGCT-3'(SEQ ID NO.7)
GAPDH正向引物：5'-AGCCACATCGCTCAGACA-3'(SEQ ID NO.8)
GAPDH反向引物：5'-GCCCAATACGACCAAATCC-3'(SEQ ID NO.9)。
反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性15s，57℃退火30s，72℃延伸32s；共40个循环；每样本重复3次；反应结束后，读取每组反应的Ct值。上述试剂由南京诺唯赞生物公司提供。
3、试验结果
测序结果：将上述样本送至联川生物公司进行ceRNA芯片检测。ceRNA芯片检测首先采用QIAGEN exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit提取样本外泌体。采用Trizol(Invitrogen)试剂提取样品Total RNA。样品总RNA利用NanoDrop ND-2000(ThermoScientific)定量并经Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies)检测RNA完整性。Total RNA的纯度会影响探针的标记效率和芯片杂交结果，所以使用QIAGEN RNeasyKit纯化总RNA。取纯化后的Total RNA250ng进行标记和扩增。首先使用AffinityScript-RT试剂盒以及Ptomoter Primer将RNA反转录成cDNA的第一链，再利用Anti-sense Promoter生成cDNA的第二链，加入T7 RNA polymerase，利用cDNA的第二链扩增生成cRNA。随后使用荧光染料Cyanine-3-CTP(Cy3)进行标记，标记后使用QIAGEN RNeasy Kit进行纯化。最后在65℃，17h滚动杂交，洗脱后利用Agilent Scanner G5761A(Agilent Technologies)扫描得到原始图像图。所得序列与circbase数据库进行比对，其序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3，证实PCR扩增产物为目的lncRNAs。
关联分析：用IBM SPSS Statistics 23.0软件对数据进行统计分析。以2-ΔΔCt方法计算
lncRNAs相对表达量。计量资料采用
表示。通过配对样本t检验以及单因素方差分析统计学方法对患者组织中HAND2-AS1、lnc-BC200表达水平与临床病理因素关系进行分析，ROC曲线评判指标诊断价值，P<0.05时认为差异显著具有统计学意义。
附图图1和图2分别为HAND2-AS1、lnc-BC200在肝癌组织中表达情况；其中，图1为HAND2-AS1在肝癌组织中低表达于癌旁组织，图2为lnc-BC200在肝癌组织中高表达于癌旁组织；说明HAND2-AS1、lnc-BC200在肝癌中的表达是特异性的，因此HAND2-AS1、lnc-BC200可以作为肝癌的早期复发肿瘤标志物，HAND2-AS1、lnc-BC200能够应用于制备肝癌早期复发分子诊断试剂盒中。
随后对筛选出的lncRNAs绘制ROC曲线，ROC曲线分析发现HAND2-AS1曲线下面积AUC为0.991(95％CI：0.978-1.000)，最大约登指数为0.933，cut-off值为0.233，敏感度为0.978，特异度0.956，阳性预测值0.957，阴预测值0.977，差异具有统计学意义(P<0.001)，见表1和图3。
表1
| 预测变量 | cut-off值 | 灵敏度 | 特异度 | 阳性预测值 | 阴性预测值 | 约登指数 |
| a | 0.233 | 0.978 | 0.956 | 0.957 | 0.977 | 0.933 |
ROC曲线分析发现lnc-BC200曲线下面积AUC为0.594(95％CI：0.475-0.713)，敏感度和特异度等指数参见表2，差异具有统计学意义(P<0.001)，见表2和图4。分析BC200的表达水平与其他临床参数关系发现，BC200的表达水平与HCC复发转移、分化程度、肿瘤个数密切相关(P<0.05)见表3。
表2
| 预测变量 | cut-off值 | 灵敏度 | 特异度 | 阳性预测值 | 阴性预测值 | 约登指数 |
| a | 0.662 | 0.822 | 0.378 | 0.569 | 0.680 | 0.200 |
| a | 4.152 | 0.622 | 0.578 | 0.596 | 0.605 | 0.200 |
| a | 4.278 | 0.600 | 0.600 | 0.600 | 0.600 | 0.200 |
表3
当HAND2-AS1和lnc-BC200联用时，曲线下面积AUC为0.993(95％CI：0.982-1.000)，敏感度和特异度等指数参见表3，差异具有统计学意义(P<0.001)，见表4和图5。
表4
| 预测变量 | cut-off值 | 灵敏度 | 特异度 | 阳性预测值 | 阴性预测值 | 约登指数 |
| model | -1.183 | 1.000 | 0.933 | 0.938 | 1.000 | 0.933 |
从表1-4可以看出，HAND2-AS1和lnc-BC200联用时，可以提高肝癌诊断的准确性。
实施例2
由于HAND2-AS1和lnc-BC200与肝癌高度相关，因此可基于此设计特异性引物，再以DNA为模板进行扩展检测。
用于原发性肝癌早期复发分子诊断的试剂，是指用于检测标志物HAND2-AS1和lnc-BC200的表达量的试剂，包含标志物基因引物、内参GAPDH基因引物、DNA/RNA标准品、RNA抽提体系、RNA逆转录反应体系和Real-Time PCR反应体系；所述基因引物为HAND2-AS1基因引物或/和lncRNA-BC200基因引物。
RNA抽提体系具体包括：TRIzol200mL、异丙醇100mL、RNA洗涤液200mL和Nuclease-Free Water 20mL。
RNA逆转录反应体系具体包括：oligo(dT)18 100μM 120μL、dNTPs 10mM 250μL、5×First-Strand Buffer 500μL、RNA酶抑制剂20U/μL 120μL、M-MuLV逆转录酶200U/μL 120μL和Nuclease-Free Water。
Real-Time PCR体系包括2×SYBR Green qPCR Mix 20mL、50×Rox 0.8mL和Nuclease-Free Water 16mL。HAND2-AS1 PCR反应液、LncBC200 PCR反应液。
DNA/RNA标准品包括阳性质控品和阴性质控品，阳性质控品为包含有HAND2-AS1、LncBC200质粒以及正常人基因组；
用于原发性肝癌早期复发分子诊断的试剂盒，该试剂盒可以为单一检测标志物HAND2-AS1表达量的试剂盒，该试剂盒含有定量检测HAND2-AS1的PCR引物对，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，还包含内参GAPDH基因引物、DNA/RNA标准品、RNA抽提体系、RNA逆转录反应体系和Real-Time PCR反应体系。
用于原发性肝癌早期复发分子诊断的试剂盒，该试剂盒可以为单一检测标志物lnc-BC200表达量的试剂盒，该试剂盒含有定量检测lnc-BC200的PCR引物对，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，还包含内参GAPDH基因引物、DNA/RNA标准品、RNA抽提体系、RNA逆转录反应体系和Real-Time PCR反应体系。内参GAPDH基因的引物序列如SEQ ID NO.7和8所示。
用于原发性肝癌早期复发分子诊断的试剂盒，该试剂盒可以为联合检测标志物HAND2-AS1和lnc-BC200表达量的试剂盒。
本发明的试剂盒在使用时，抽取受试者外周血2ml，按照下述方法进行处理，利用本发明的试剂盒进行PCR反应，将反应产物进行测序，将测序结果利用Meglign 7.0和Chromas 2.33软件进行检验和分析。
1、样本总RNA的制备：利用RNA抽提体系提取血清中样本的总RNA；
逆转录为cDNA：使用RNA逆转录反应体系将样本的总RNA逆转录为cDNA；反应条件为42℃孵育60min，70℃5min灭活逆转录酶活性，最终降温至12℃。
2、以逆转录获得的cDNA为模板，使用Real-Time PCR反应体系进行实时定量PCR，使用引物为HAND2-AS1及lncRNA-BC200基因引物、内参GAPDH基因引物。
3、把PCR八联管或单个PCR反应管按顺序摆放在PCR管架上(做好标记)，轻轻揭开PCR反应管的管盖。从试剂盒中取出PCR反应预混液，颠倒混匀。各取12.5ul预混液加入相应的PCR反应管，如取12.5ul HAND2-AS1预混液加入标记为1号的PCR反应管，取12.5ul BC200的预混液加入标记为2号的PCR反应管。依次把待测样品加入相应的PCR反应管。
4、分别取混匀的下列试剂加入一新的灭菌EP管中，c样本取22.5ul，Taq DNA聚合酶4.5ul，灭菌纯水85.5ul，颠倒混匀，取12.5ul加入PCR八联管反应条，然后小心盖上八联管反应条管盖(以上按照9人份的量配置)。
5、按步骤3的方法，分别在PCR反应管中加入阴性质控品和阳性质控品，及时盖好封盖。做好标记，瞬时离心后把8联PCR反应管放入仪器。
6、打开仪器设置窗口，按右图设置PCR扩增与信号收集程序。
a)第一阶段：95℃，10分钟，1个循环；
b)第二阶段：95℃，15秒，60℃30秒，10个循环；
c)第三阶段：95℃，15秒，57℃30秒，35个循环；
信号收集：第三阶段57℃时收集FAM和HEX(或VIC)信号。
7、保存文件，运行程序。反应条件为95℃预变形处理5min，95℃变性15s，58℃退火30s，72℃延伸32s，40个循环；
8、数据处理：读取Ct值。
阳性判读值是以某一基因的Ct值与外标管的Ct值之差即△Ct作为判读依据：
△Ct＝【某一基因的Ct】-【内参Ct】
采用本发明的试剂盒，阳性判断的标准如下表5。
表5
| 编号 | 基因 | 阳性判断值(△Ct值) |
| 1 | HAND2-AS1 | ≥8 |
| 2 | lnc-BC200 | ≤10 |
本发明通过以HAND2-AS1基因和/或lncBC200基因为标志物，制作成肝癌早期复发分子诊断试剂盒，可大幅提高原发性肝癌早期复发的敏感度和特异性，为肝癌的检测提供了一种可靠的方法。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。
Claims (6)
1.用于原发性肝癌早期复发分子诊断的标志物，其特征在于：所述标志物为HAND2-AS1基因或者lncBC200基因或者HAND2-AS1基因与lncBC200基因的组合，所述HAND2-AS1基因和lncBC200基因的序列参见SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
2.权利要求1所述的标志物在制备原发性肝癌早期复发分子诊断试剂或试剂盒中的应用。
3.用于原发性肝癌早期复发分子诊断的试剂，其特征在于：所述试剂是指检测权利要求1所述标志物的表达量的试剂。
4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于：所述试剂包含标志物基因引物、内参GAPDH基因引物、DNA/RNA标准品、RNA抽提体系、RNA逆转录反应体系和Real-Time PCR反应体系；所述基因引物为HAND2-AS1基因引物或/和lncRNA-BC200基因引物。
5.根据权利要求4所述的试剂，其特征在于：所述HAND2-AS1基因、lncRNA-BC200基因和内参GAPDH基因的引物序列如下：
HAND2-AS1正向引物：5'-TTGGGCGATTTTGAAGTGCG-3'(SEQ ID NO.4)
HAND2-AS1反向引物：5'-GGTGGAGAGGACTGGTTTCG-3'(SEQ ID NO.5)
lncBC200正向引物：5'-GCCTGTAATCCCAGCTCTCA-3'(SEQ ID NO.6)
lncBC200反向引物：5'-GTTGCTTTGAGGGAAGTTACGCT-3'(SEQ ID NO.7)
GAPDH正向引物：5'-AGCCACATCGCTCAGACA-3'(SEQ ID NO.8)
GAPDH反向引物：5'-GCCCAATACGACCAAATCC-3'(SEQ ID NO.9)。
6.用于原发性肝癌早期复发分子诊断的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含权利要求3～5任一项所述的试剂。
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