CN115960913A - 一种茎瘤芥BjuA017664基因在提高植物抗干旱胁迫中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种茎瘤芥BjuA017664基因在提高植物抗干旱胁迫中的应用，所述BjuA017664基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明首次报道了茎瘤芥BjuA017664基因在增强植物干旱抗性中的应用。通过构建BjuA017664基因过表达载体，使其在茎瘤芥中过量表达，并进行干旱胁迫处理，研究发现经干旱胁迫处理后恢复正常生长条件，可使转基因拟南芥大量恢复正常生长，转基因株系的存活率达到75％及以上，明显高于野生型。表明茎瘤芥BjuA017664基因的过量表达可以显著提高植物的干旱胁迫抗性的功能。这为作物抗旱遗传改良提供了新的基因靶点和资源，可广泛应用于植物遗传育种、种质资源改良和培育，对于促进作物稳产具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，特别的涉及一种茎瘤芥BjuA017664基因在提高植物抗干旱胁迫中的应用。
背景技术
近年来，随着全球气候变暖和人类活动的加剧，干旱、洪涝、高温和霜冻等极端天气发生的频率和数量逐渐增加，其对农业生产的威胁日趋严峻。目前干旱、高温被认为是导致农作物减产和绝产的两大主要非生物胁迫因子。外界空气过干或土壤含水量过低均可导致植物因缺水而形成干旱胁迫，其对植物的生长和发育具有严重的抑制作用。
干旱作为植物生长过程中的主要制约因素之一，会阻碍植物的呼吸作用、光合作用和气孔运动，进而影响植物的生长发育和生理代谢。因此，挖掘抗干旱相关基因，探究其抗干旱机理，培育抗干旱新品种，对保障我国作物稳定安全具有重要意义。近年来，人们从生理、生化、代谢、生态、以及遗传、进化等角度对植物响应干旱等逆境胁迫的机制进行了大量研究，由于植物抗旱性状的复杂性，采用传统的育种方法提高植物的抗旱性十分困难。随着分子生物学的发展，人们能够在基因组成、表达调控及信号传导等分子水平上认识植物对干旱胁迫的抗逆性机理，为利用基因工程手段改良植物的抗胁迫性能开拓了新的途径。目前植物遗传转化研究已取得一些进展，因此可以通过转基因方法提高植物的抗干旱性。转基因是植物在胁迫条件下通过分子手段来控制其蛋白成分的重要手段。这种方法具有选育速度快，易于获得抗性植株，且具有较好的遗传稳定性等优点，已成为获得抗性植株的主要手段。因此利用基因工程手段改良作物的抗旱能力，提高农作物和经济作物对逆境的适应能力是新品种培育亟需解决的关键问题和重大问题，但高效抗旱基因的分离成为限制植物抗逆基因工程的主要因素。
茎瘤芥(Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee)，又称青菜头，是十字花科芸薹属植物，为榨菜的主要原料，是我国重庆、四川、浙江等地区主要的经济作物之一。多年来，茎瘤芥的相关研究主要集中在遗传育种、良种繁育、栽培技术、品质安全等领域，近年才陆续有生物学方面研究的报道。前人研究表明，茎瘤芥对非生物胁迫具有较强的抗性，目前已经从茎瘤芥中获得多个逆境胁迫相关基因。但是到目前为止，获得的抗干旱基因还是太少，还不能满足改良植株产量和品质分子设计的需要，所以茎瘤芥抗干旱基因工程在农业生产和商业上的应用受到很大限制。因此，仍亟需在茎瘤芥中获得高效、广谱的抗干旱基因。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种茎瘤芥BjuA017664基因在提高植物抗干旱胁迫中的应用，为作物抗干旱品种改良提供了新的基因靶点，丰富了基因库。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种茎瘤芥BjuA017664基因在提高植物抗干旱胁迫中的应用，所述BjuA017664基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的核苷酸序列。
进一步，所述BjuA017664基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示或具有如SEQID NO.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的氨基酸序列。
本发明的另一个目的在于，还提供了一种含有所述茎瘤芥BjuA017664基因的生物材料，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。
本发明的另一个目的在于，还提供了所述生物材料在提高植物抗干旱胁迫中的应用。
进一步，所述植物为双子叶植物或单子叶植物，优选为茎瘤芥、拟南芥、白菜、烟草或油菜。
本发明的另一个目的在于，还提供了一种提高植物抗干旱胁迫的方法，包括：提高植物中BjuA017664蛋白的表达量和/或活性；所述BjuA017664蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示或具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的氨基酸序列。
进一步，所述植物为双子叶植物或单子叶植物，优选为茎瘤芥、拟南芥、白菜、烟草或油菜。
进一步，所述方法具体包括以下步骤：将制备的或提供的含有所述的BjuA017664基因的表达载体转化农杆菌，得到农杆菌工程菌，再将所述农杆菌工程菌浸染茎瘤芥外植体，采用下胚轴遗传转化技术，使BjuA017664基因过表达，即得到抗干旱胁迫的转基因植物。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、本发明首次报道了茎瘤芥BjuA017664基因在增强植物干旱抗性中的应用。通过构建BjuA017664基因过表达载体，使其在茎瘤芥中过量表达，并进行干旱胁迫处理，研究发现经干旱胁迫处理后恢复正常生长条件，可使转基因拟南芥大量恢复正常生长，转基因株系的存活率达到75％及以上，明显高于野生型。表明可通过转基因等生物学手段将茎瘤芥BjuA017664基因导入农作物中并过量表达可以显著提高植物的干旱胁迫抗性的功能，是培育抗旱作物品种的优质候选基因。
2、本发明的茎瘤芥BjuA017664基因可显著增强植物抗旱性，有利于在干旱逆境条件下保持作物产量，可减少干旱逆境对经济作物带来的损失，具有显著的经济价值。另外，本发明也为作物抗旱遗传改良提供了新的基因靶点和资源，可广泛应用于植物遗传育种、种质资源改良和培育，对于促进作物稳产具有重要意义。
附图说明
图1为茎瘤芥BjuA017664基因在过表达转基因株系中的半定量表达分析图；WT为野生型茎瘤芥植株，#2、#3、#4和#5分别是转基因茎瘤芥植株。
图2为过表达BjuA017664的转基因株系在干旱胁迫过程中的表型图；WT为野生型茎瘤芥株系，#2、#3、#4和#5分别是转基因茎瘤芥株系。
图3为过表达BjuA017664的转基因株系的干旱胁迫后的存活率；WT为野生型茎瘤芥株系，#2、#3、#4和#5分别是转基因茎瘤芥株系。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。实施例中所述原料如无特殊说明，即为普通市售产品。实施例中所述的实验方法无特别说明，即按常规分子生物学实验方法操作。
实施例1克隆茎瘤芥BjuA017664基因序列
为了验证茎瘤芥BjuA017664全长基因，设计特异性引物SEQ ID NO.3(BjuA017664-F)和SEQ ID NO.4(BjuA017664-R)进行PCR扩增分析。
取现蕾期茎瘤芥叶片组织为材料，采用TRIzolTM Plus RNA Purification Kit(12183555，InvitrogenTM)，按说明书步骤提取总RNA，利用DNase I(18047019，InvitrogenTM)去除残余的微量DNA，并用分光光度计测定RNA的浓度，备用。
取约2.0μg茎瘤芥叶片总RNA，按照PrimeScript II first-strand cDNAsynthesis kit(6210A,Takara)说明书步骤合成第一链cDNA。
PCR扩增体系为高保真扩增酶Prime STAR HS(R010A,TaKaRa)0.25μL，5×PrimeSTAR Buffer(Mg2+Plus)5μL，正向引物(Bju-F,10μM)0.5μL，反向引物(Bju-R,10μM)0.5μL，模板(DNA)1μL，dNTP(2.5mM)2μL，无菌ddH2O补足至25μL。
正向引物和反向引物的序列如下所示：
BjuA017664-F：ATGGCTACCGGAGAGGAGAAACCTG
BjuA017664-R：TCAGTGCTTGATCTTAGGCTTCTTC
PCR反应程序为：预变性95℃，5min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，30s，35个循环；72℃，10min。
获得PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分析，在紫外光照射下，在500bp左右可以观察到一条特异性的扩增条带。按照胶回收试剂盒(9672，Takara)纯化后备用。
利用平末端加A试剂将纯化的DNA片段加A，通过TA克隆将其与pMD20-T vector(6019，Takara)相连，连接产物转化大肠杆菌DH5a，从含有氨苄霉素(100mg/L)的LB培养板上挑取阳性克隆测序进行测序分析，结果表明，茎瘤芥BjuA017664基因的CDS序列如SEQ IDNO.1所示，含有489bp的开放阅读框，其编码蛋白质含有162个氨基酸(如SEQ ID NO.2序列所示)。
实施例2重组表达载体pTF101-BjuA017664-GFP构建及转化
(1)构建pTF101-BjuA017664-GFP表达载体
根据茎瘤芥BjuA017664全长基因序列SEQ ID NO.1，设计引物Bju-gfp-F和Bju-gfp-R，引物中引入酶切位点序列。以实施例1中TA连接的阳性克隆质粒为模板，以Bju-gfp-F(正向引物)和Bju-gfp-R(反向引物)为引物进行基因BjuA017664的特异性扩增。
所述引物序列如下：
Bju-gfp-F：CCCGGGATGGCTACCGGAGAGGAGAAACCTG
Bju-gfp-R：GGATCCTCAGTGCTTGATCTTAGGCTTCTTC
其中，Bju-gfp-F的下划线序列为SmaI酶切位点，Bju-gfp-R的下划线序列为BamHI酶切位点。
PCR反应体系：高保真扩增酶PrimeSTAR HS(R010A,TaKaRa)0.5μL，5xPrimeSTARBuffer(Mg2+Plus)10μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板(50倍稀释的质粒)1μL，dNTP(2.5mM)4μL，无菌ddH2O补足至50μL。
PCR反应条件：预变性95℃，5min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，30s，35个循环；72℃,10min。
将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。扩增得到的目的片段与预期片段大小相同，按照胶回收试剂盒(9672，Takara)的说明书步骤回收纯化，即获得目的基因片段。
用SmaI和BamHI双酶切处理pTF101-GFP表达载体。酶切体系为：pTF101-GFPvector 5μL；SmaI 0.5μL；BamHI 0.5μL；Buffer 10XK 2μL；无菌ddH2O补足至20μL；37℃反应3h。酶切结束后，根据Takara琼脂糖凝胶回收试剂盒回收pTF101-GFP载体片段。
利用T4 DNA Ligase(FL101，Trans)构建pTF101-BjuA017664-GFP表达载体。
连接反应体系为：
Purifed PCR fragment(回收的BjuA017664目的片段)50ng；Linearized vector(pTF101-GFP载体)100ng；5x T4 DNA Ligase Buffer 2μL；T4 DNA Ligase 0.5μL；无菌ddH2O补足至10μL；25℃反应30min。按照分子克隆实验指南将上述重组反应体系转化大肠杆菌DH5a，并涂布于含有壮观霉素抗性(75mg/L)的筛选培养板上，通过阳性克隆测序，获得正确的含BjuA017664基因片段的重组表达载体pTF101-BjuA017664-GFP。重组表达载体中报告基因GFP与目的基因BjuA017664的5’端融合后，位于组成型启动子P35S下游，形成融合表达；BjuA017664的3’端组装有NOS终止子，可以有效终止融合基因的转录。报告基因GFP经过蓝光激发，无需辅助因子和底物就能发出绿色荧光，作为报告基因可以检测目的基因表达情况。
(2)农杆菌介导的茎瘤芥遗传转化
通过常规冻融法将构建的重组表达载体pTF101-BjuA017664-GFP转入农杆菌菌株GV3101中，通过PCR筛选阳性克隆。然后采用茎瘤芥下胚轴稳定遗传转化技术将携带pTF101-BjuA017664-GFP载体的农杆菌导入茎瘤芥中。通过半定量RT-PCR鉴定得到表现型良好的过表达BjuA017664的转基因株系(#2、#3、#4和#5)与野生型中BjuA017664基因的表达水平。采用Trizol试剂(InvitrogenTM)，按说明书步骤提取茎瘤芥叶片总RNA，利用DNaseI(InvitrogenTM)去除残余DNA，采用cDNA反转录试剂(Takara)并按照说明书步骤合成第一链cDNA。
检测目的基因引物为：
BjuA017664-F：ATGGCTACCGGAGAGGAGAAACCTG
BjuA017664-R：TCAGTGCTTGATCTTAGGCTTCTTC
拟南芥内参引物为：
RT-AtACTIN3-F：GGCTACTCTTTCACCACGAC
RT-AtACTIN3-R：GGATACCAGCATTCTCCATAC
结果如图1所示，在4个转基因株系(#2、#3、#4和#5)中目的基因茎瘤芥BjuA017664均上调表达，而野生型植株(WT)中几乎检测不到BjuA017664的表达(表达量太低)，表明BjuA017664已经导入茎瘤芥基因组并成功转录表达。
实施例3转基因茎瘤芥的表型观察与分析
分别将野生型WT种子和获得的转基因型株系#2、#3、#4和#5的种子经消毒、灭菌和春化处理后在浸湿水的滤纸上萌发，将萌发后4天的幼苗转移到吸水至饱和的含有培养基质花盆中(蛭石：营养土＝3:1)，放置于植物培养室中培养，培养室光周期为白天：黑夜＝16h:8h，温度为22℃。待幼苗植株均生长至3对叶时期，分别对茎瘤芥转基因植株和野生型茎瘤芥植株进行干旱胁迫(即不浇水)处理8天，观察植株生长状态，分析表型，然后浇水对植株进行复水处理，2天后观察并统计各组恢复正常生长的株数，计算存活率。其中转基因植株和野生型植株各进行3次重复试验，每个试验组取25株植株进行胁迫处理，结果如图2和图3所示。
结果显示，在进行干旱处理前，过表达BjuA017664的转基因株系和野生型均正常生长，未出现明显差异(图2a)。在进行干旱处理后，野生型茎完全无法直立，过表达BjuA017664的转基因株系叶片虽有萎蔫但仍大部分能够保持直立(图2b)。复水后野生型仅有极少量植株恢复正常，而转基因材料大部分植株恢复正常(图2c)，经计算，约75％及以上的转BjuA017664基因的茎瘤芥株系恢复正常生长，其中，转基因型#3株系均恢复正常生长，存活率约为100％；而野生型茎瘤芥只有约25％的植株存活(图3)。该结果表明茎瘤芥BjuA017664基因的过量表达可以显著提高植物的抗旱能力。
以上实施例中所述的序列具体如下所示：
序列1：SEQ ID NO.1BjuA017664核苷酸序列，长489bp
ATGGCTACCGGAGAGGAGAAACCTGTTATGGTCGTCGGTATGGACGAAAGCGAGCAGAGCACTTACGCCTTGGAGTGGACCCTCGATCGTTTCTTCGCTCCTTACGCTCCTAATTTTCCTTTCAAGCTCTTCATCGTCCACGCCAAACCTAACGCCGTCTCTGCCGTTGGTCTTGCTGGTCCCGGAGCTGCGGAGGTTCTGCCGTATGTTGATACCGATTTGAAGCATATTGCTGCCAGGGTTATCGAGATGGCTAAAGGTATCTGTCAGAGCAAATCGGTTGATGGCGCTATGTTCGAAGTTTTTGAAGGTGATGCAAGAAGTATACTGTGCGATGTTGTGGATAAACACCATGCTTCTCTTCTTGTCGTGGGAAGCCATGGTTATGGAGCTATCAAGAGGGCGGTTCTAGGGAGCGTGAGCGACTACTGTGCTCATCATGCTCATTGCTCGGTGATGATCGTGAAGAAGCCTAAGATCAAGCACTGA
序列2：SEQ ID NO.2蛋白BjuA017664氨基酸序列，长162个氨基酸
MATGEEKPVMVVGMDESEQSTYALEWTLDRFFAPYAPNFPFKLFIVHAKPNAVSAVGLAGPGAAEVLPYVDTDLKHIAARVIEMAKGICQSKSVDGAMFEVFEGDARSILCDVVDKHHASLLVVGSHGYGAIKRAVLGSVSDYCAHHAHCSVMIVKKPKIKH*
序列3：SEQ ID NO.3BjuA017664-F核苷酸序列，长25bp
ATGGCTACCGGAGAGGAGAAACCTG
序列4：SEQ ID NO.4BjuA017664-R核苷酸序列，长25bp
TCAGTGCTTGATCTTAGGCTTCTTC
序列5：SEQ ID NO.5RT-AtACTIN3-F核苷酸序列，长20bp
GGCTACTCTTTCACCACGAC
序列6：SEQ ID NO.6RT-AtACTIN3-R核苷酸序列，长21bp
GGATACCAGCATTCTCCATAC
序列7：SEQ ID NO.7Bju-gfp-F核苷酸序列，长31bp
CCCGGGATGGCTACCGGAGAGGAGAAACCTG
序列8：SEQ ID NO.8Bju-gfp-R核苷酸序列，长31bp
GGATCCTCAGTGCTTGATCTTAGGCTTCTTC
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种茎瘤芥BjuA017664基因在提高植物抗干旱胁迫中的应用，所述BjuA017664基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述BjuA017664基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示或具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的氨基酸序列。
3.一种含有权利要求1所述茎瘤芥BjuA017664基因的生物材料，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。
4.根据权利要求3所述生物材料在提高植物抗干旱胁迫中的应用。
5.根据权利要求1、2或4所述的应用，其特征在于，所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述植物为茎瘤芥、拟南芥、白菜、烟草或油菜。
7.一种提高植物抗干旱胁迫的方法，其特征在于，包括：提高植物中BjuA017664蛋白的表达量和/或活性；所述BjuA017664蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示或具有如SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的氨基酸序列。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述植物为茎瘤芥、拟南芥、白菜、烟草或油菜。
10.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：将制备的或提供的含有如权利要求1所述的BjuA017664基因的表达载体转化农杆菌，得到农杆菌工程菌，再将所述农杆菌工程菌浸染植物，使BjuA017664基因过表达，即得到抗干旱胁迫的转基因植物。
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| NCBI: "PREDICTED: Brassica rapa universal stress protein PHOS34 (LOC103866351), mRNA", Retrieved from the Internet <URL:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/XM_009144259.3> * |
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