CN115960908A - 一种黑鲷cirbp基因dsRNA及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明适用于分子生物学领域,提供了一种黑鲷cirbp基因dsRNA及其制备方法和应用,其中,黑鲷cirbp基因的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述黑鲷cirbp基因dsRNA是以黑鲷的cirbp干扰基因片段为模板进行体外转录获得;黑鲷的cirbp干扰基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。该黑鲷cirbp基因dsRNA可以有效地干扰低温胁迫下黑鲷的细胞凋亡。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域,尤其涉及一种黑鲷cirbp基因dsRNA及其制备方法和应用。
背景技术
黑鲷作为我国沿海的重要海洋经济鱼类,其在功能基因上的研究进展较慢,主要原因是缺乏适用于长期动物研究所需要的、具有高效干扰效果的活体RNA干扰沉默技术。目前,常用的小RNA(si RNA)干扰技术由于其转染效率的限制,难以在活体鱼类上维持较高的干扰效率,而且动物试验中siRNA需要量大,成本较高。外源或内源性RNA(double-strandedRNA,dsRNA)在细胞内诱导同源序列的基因表达受抑制的现象称为RNA干扰。目前,dsRNA干扰技术已经广泛应用于植物、细菌、昆虫和虾蟹等物种的基因功能研究上,并且取得一系列研究成果。近年来,该技术开始在斑马鱼胚胎的基因功能研究中使用。但是,在鱼类活体上的使用鲜有发明内容。
冷诱导RNA结合蛋白(cold-inducible RNA-binding protein,CIRBP)是哺乳动物体内发现的第一个冷诱导结合蛋白。这种蛋白质在机体内各个组织与器官中均广泛表达,并在正常生理状态或应激条件下,广泛参与多个生物学过程,例如细胞增殖、发展、凋亡、分化和生物节律调节等多个方面。随着研究的深入,发现CIRBP具有一些新的功能,例如在一些炎症和肿瘤的发生过程中,起到促进作用与作为新一代的原癌基因等。冷应激会引起多细胞生物体产生细胞凋亡现象,将不需要的或受损的细胞进行调控移除,这种现象由生物体为适应环境而自主进行的调控。CIRBP在应激条件下,特别是低温诱导的情况下,在细胞中过表达能够发挥抗细胞凋亡的作用。目前,细胞凋亡途径中内在的线粒体途径是国内外研究的较为精确的一条途径,此途径是由线粒体中细胞色素c(Cyto-c)的释放引发。在此途径中,apoptotic protease activating factor-1基因(apaf-1基因)是凋亡酶激活因子,可以激活细胞凋亡相关酶;促凋亡bcl-associated x基因(bax基因)与抗凋亡b-celllymphoma-2基因(bcl-2基因)可以调控线粒体中Cyt o-c等凋亡因子的释放参与凋亡途径。Smac/Diablo蛋白定位于线粒体,与连锁凋亡抑制蛋白家族结合后,抑制抗凋亡活性从而实现增强凋亡;cysteinyl aspartate specific proteinase-3基因(capase-3基因)是在线粒体凋亡途径中执行最后步骤的凋亡基因。cysteinyl aspartate specific proteinase-1基因(capase-1基因)是介导炎症反应的主要基因,通过招募凋亡相关斑点样蛋白与Capase-1前体蛋白结合,形成炎性体复合物进而激活细胞炎症反应。这些基因均是参与细胞凋亡途径的重要基因,其表达水平的动态变化可以说明机体是否发生细胞凋亡。
有关鱼类CIRBP基因的相关研究内容少见报道,深入研究CIRBP的有关作用机制,将有助于进一步探究黑鲷在低温下肝脏的细胞凋亡机制。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种黑鲷cirbp基因dsRNA,旨在解决背景技术中提出的问题。
本发明实施例是这样实现的,一种黑鲷cirbp基因dsRNA,其cDNA核苷酸序列如SEQID NO.1所示;所述黑鲷cirbp基因dsRNA是以黑鲷的cirbp干扰基因片段为模板进行体外转录获得;黑鲷的cirbp干扰基因片段的核苷酸序列如SE Q ID NO.3所示。
本发明实施例的另一目的在于提供一种冷诱导RNA结合蛋白,所述冷诱导RNA结合蛋白由上述的黑鲷cirbp基因dsRNA编码得到,其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的黑鲷cirbp基因dsRNA的制备方法,其包括以下步骤:
以所述黑鲷cirbp基因的cDNA为模板,采用特异性引物进行PCR扩增,得到目的片段;
以目的片段为模板,合成所述黑鲷cirbp基因dsRNA。
作为本发明实施例的一种优选方案,所述特异性引物包括核苷酸序列如SE Q IDNO.4所示的正向引物以及核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的反向引物。
本发明实施例的另一目的在于提供一种黑鲷的cirbp干扰基因片段、上述的黑鲷cirbp基因dsRNA或上述的冷诱导RNA结合蛋白在制备用于干扰低温胁迫下黑鲷肝脏的细胞凋亡相关基因的生物抑制制剂或试剂盒中的应用。
本发明实施例的另一目的在于提供一种黑鲷的cirbp干扰基因片段、上述的黑鲷cirbp基因dsRNA或上述的冷诱导RNA结合蛋白在制备用于抑制cirbp基因的转录表达的生物抑制制剂或试剂盒中的应用。
本发明实施例的另一目的在于提供一种黑鲷的cirbp干扰基因片段、上述的黑鲷cirbp基因dsRNA或上述的冷诱导RNA结合蛋白在黑鲷养殖中的应用。
本发明实施例的另一目的在于提供一种用于抑制cirbp基因的转录表达或干扰低温胁迫下黑鲷肝脏的细胞凋亡相关基因的生物抑制制剂,其包括上述的黑鲷cirbp基因dsRNA或上述的冷诱导RNA结合蛋白。
本发明实施例的另一目的在于提供一种用于抑制cirbp基因的转录表达或干扰低温胁迫下黑鲷肝脏的细胞凋亡相关基因的试剂盒,其包括上述的黑鲷cirbp基因dsRNA、上述的冷诱导RNA结合蛋白或上述的生物抑制制剂。
本发明实施例提供的一种黑鲷cirbp基因dsRNA,进行RNA活体干扰具有高效的干扰效率,可以有效的实现目的基因的干扰效果。该黑鲷cirbp基因dsRN A可以有效地干扰低温胁迫下黑鲷的细胞凋亡,可用于黑鲷的养殖以及制备抑制cirbp基因的转录表达、干扰低温下黑鲷肝脏的细胞凋亡机制的产品。
附图说明
图1为注射不同引物组合成的dsRNA对黑鲷肝脏中cirbp基因表达的影响结果图。
图2为冷应激下两组抑制率较好的dsRNA对黑鲷的肝脏中cirbp基因表达的影响结果图。
图3为注射cirbp-dsRNA后对黑鲷肝脏中细胞凋亡相关基因表达量的影响结果图。
图4为注射cirbp-dsRNA后黑鲷肝脏细胞内线粒体凋亡途径中受影响的基因示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
在本发明的一个实施例中,提供了一种黑鲷cirbp基因dsRNA,其cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述黑鲷cirbp基因dsRNA是以黑鲷的cirbp干扰基因片段为模板进行体外转录获得;黑鲷的cirbp干扰基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的另一个实施例中,还提供了一种冷诱导RNA结合蛋白,其是由上述的黑鲷cirbp基因dsRNA编码得到,其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
其中,黑鲷的cirbp基因或黑鲷的冷诱导RNA结合蛋白作为靶标序列可以应用于干扰低温下黑鲷肝脏的细胞凋亡相关基因。
在本发明的另一个实施例中,还提供了一种上述的黑鲷cirbp基因dsRNA的制备方法,其包括以下步骤:
以所述黑鲷cirbp基因的cDNA为模板,采用特异性引物进行PCR扩增,得到目的片段;
以目的片段为模板,合成所述黑鲷cirbp基因dsRNA。
具体的,所述特异性引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的正向引物以及核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的反向引物;具体的,正向引物的序列为:5’-TAATACGACTCAC TATAGGGGGCTATGCTGCACACGAGTA-3';反向引物的序列为:5'-TAATACGACTCACTATAGGGTGGACAGTAAGTCGACAGCG-3';其中下划线部分为T7启动子序列。
在本发明的另一个实施例中,还提供了一种黑鲷的cirbp干扰基因片段、上述的黑鲷cirbp基因dsRNA或上述的冷诱导RNA结合蛋白在制备用于干扰低温胁迫下黑鲷肝脏的细胞凋亡相关基因的生物抑制制剂或试剂盒中的应用。
在本发明的另一个实施例中,还提供了一种黑鲷的cirbp干扰基因片段、上述的黑鲷cirbp基因dsRNA或上述的冷诱导RNA结合蛋白在制备用于抑制cirbp基因的转录表达的生物抑制制剂或试剂盒中的应用。
在实际应用中,可以通过将黑鲷cirbp基因dsRNA或者生物抑制制剂注射至黑鲷活体腹腔内,以达到抑制cirbp基因或者干扰低温胁迫下黑鲷肝脏的细胞凋亡相关基因的目的;其中,黑鲷cirbp基因dsRNA或生物制剂的注射剂量为2-8μg/g。
上述提供的黑鲷cirbp基因dsRNA进行RNA活体干扰具有高效的干扰效率,可以有效的实现目的基因的干扰效果。其中,RNA干扰效率检测方法如下:在dsRNA腹腔注射后的1h、12h、24h、36h、48h分别采集黑鲷肝脏组织,采用实时荧光定量方法检测cirbp基因表达水平,检测干扰效率,并确定以cirbp基因为靶基因制作的dsRNA在低温下具有调控黑鲷肝脏细胞凋亡的功能。
在本发明的另一个实施例中,还提供了一种黑鲷的cirbp干扰基因片段、上述的黑鲷cirbp基因dsRNA或上述的冷诱导RNA结合蛋白在黑鲷养殖中的应用。
具体的,黑鲷鱼苗的饲养方法如下:将黑鲷鱼苗饲养在循环水养殖系统中,投喂鲤鱼配合饲料,每天投喂3次,换水体积为1/2,24h不间断充氧;dsRNA的活体注射:试验组对黑鲷腹腔注射以浓度/鱼体重计为2-8μg/g的浓度进行干扰,对照组注射等量DEPC水。
在本发明的另一个实施例中,还提供了一种用于抑制cirbp基因的转录表达或干扰低温胁迫下黑鲷肝脏的细胞凋亡相关基因的生物抑制制剂,其包括上述的黑鲷cirbp基因dsRNA或上述的冷诱导RNA结合蛋白。需要说明的是,生物抑制制剂还可以包括生物学上可接受的载体。
在本发明的另一个实施例中,还提供了一种用于抑制cirbp基因的转录表达或干扰低温胁迫下黑鲷肝脏的细胞凋亡相关基因的试剂盒,其包括上述的黑鲷ci rbp基因dsRNA、上述的冷诱导RNA结合蛋白或上述的生物抑制制剂。需要说明的是,试剂盒还可以包括其他用于干扰低温胁迫下黑鲷肝脏的细胞凋亡相关基因的试剂和设备仪器。
下面结合具体的实施例以及实验对本发明的技术方案作进一步说明,但不构成对本发明的限制。
实施例1
该实施例提供了一种黑鲷cirbp基因dsRNA的制备方法,其是利用黑鲷cirb p基因核酸序列制备dsRNA,具体包括以下步骤:
S1、黑鲷肝脏组织RNA提取:采集黑鲷肝脏组织,采用上海生物工程有限公司总RNA提取试剂盒说明书进行RNA提取,通过1.2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量,利用超微量分光光度计测定RNA浓度,并保存于-80℃,备用。
S2、黑鲷cirbp基因dsRNA的制备:根据黑鲷cirbp基因的cDNA序列(如SEQ ID NO.1所示)设计用于制备dsRNA的特异性引物共计3对,特异性引物序列及扩增条件和目的片段大小如表1所示。用上述三对引物,以黑鲷肝脏总RNA反转录合成的cDNA为模板,通过PCR扩增获得目的片段,再以该片段为模板采用T7 RNAi Transcription Kit试剂盒合成黑鲷cirbp基因dsRNA。
表1合成dsRNA所用引物
表1中,序列的下划线部分为T7启动子序列。
实施例2
该实施例提供了上述实施例1合成的黑鲷cirbp基因dsRNA用于黑鲷活体干扰的方法,其具体包括如下步骤:
S1、黑鲷的饲养:将1龄黑鲷(平均体重:151.3±1.3g)饲养在循环水养殖系统中,泡沫箱的规格为长90cm,高80cm,宽50cm;水温为22℃,自然光光照;每天适量投喂饵料,全天充氧。
S2、黑鲷cirbp基因dsRNA的活体注射:
最佳引物筛选:将合成的黑鲷cirbp基因dsRNA稀释成150μg/mL,按照5μg/g(浓度/鱼体重)的注射剂量进行黑鲷活体腹腔注射。实验分为4组(n=10):CIR-dsRNA-1组、CIR-dsRNA-2组、CIR-dsRNA-3组和对照组,每组3个重复,注射后1h、12h、24h、36h、48h后检测死亡率和干扰效率,排除引物CIR-dsRN A-1,再结合低温下引物CIR-dsRNA-2以及引物CIR-dsRNA-3的抑制效率,从而确定最佳引物序列为CIR-dsRNA-3引物组。
S3、RNA干扰cirbp基因后对黑鲷肝脏组织的细胞凋亡通路的影响:根据上述引物筛选结果进行注射,实验分为两组(n=20)。实验组按最佳引物进行注射,对照组注射等量的DEPC水,分别进行冷应激实验。在15℃、10℃、5℃三个温度点保持24h后分别取肝脏的样品(n=3),通过RNA的提取及RT-qPCR检测确定此引物在低温下仍有抑制作用,且对细胞凋亡通路的关键基因产生了显著影响。
实验结果:实验组与对照组相比,实验组中的目的基因表达量显著低于对照组。在对黑鲷腹腔注射黑鲷cirbp基因dsRNA后48h内,对cirbp基因的mRNA表达量的抑制率最高可达93.54%(当黑鲷注射dsRNA后48h,以对照组肝脏中cirbp基因的表达量为1,实验组cirbp基因的相对表达量为0.0642)。利用本方法进行的RNA活体干扰具有高效的干扰效率,可以有效的实现目的基因的干扰效果。
实施例3
该实施例提供了黑鲷cirbp基因dsRNA的具体制备方法以及黑鲷cirbp基因dsRNA的干扰实验方法,具体包括以下步骤:
S1、黑鲷肝脏组织RNA提取:采集黑鲷肝脏组织,采用上海生物工程有限公司的动物组织总RNA提取试剂盒说明书进行RNA提取,通过1.2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量,利用超微量分光光度计测定RNA浓度,并保存于-80℃,备用。
S2、dsRNA引物设计:提供黑鲷cirbp基因的cDNA序列,使用在线软件SnapDragon-dsRNA Design(https://www.flyrnai.org/snapdragon)设计用于制备双链RNA(dsRNA)的特异性引物。每对引物的5’端加上一段T7启动子序列:TAATACGACTCACTATAGGG。
S3、黑鲷cirbp基因dsRNA的合成:
采用设计合成的dsRNA引物,以黑鲷肝脏的cDNA为模板,按照T7 RNAiTranscription Kit试剂盒说明书,用上表1的引物序列进行PCR扩增,制备了高纯度的合成模板。将产物送上海生物工程有限公司测序,确保其序列正确。再以该段片段为模板,利用市售的T7 RNAi Transcription Kit试剂盒合成dsRNA,具体反应体系如表2所示:
表2反应体系
组分 | 体积 |
NTPMix | 8μL |
10×TranscriptionBuffer | 2μL |
T7EnzymeMix | 2μL |
DNA模板 | 4μL |
<![CDATA[RNase-freeH<sub>2</sub>O]]> | Upto20μL |
PCR反应条件如下:37℃反应2h。
S4、dsRNA纯化:
向上述合成的产物中加入80μL的RNA Clean Beads,充分混匀后静止8min。将含有前述混合物的PCR管置于磁力架上5min,待溶液澄清后,小心移除上清。在磁力架上加入200μL新配制的80%乙醇,室温孵育30sec,小心移除上清。重复该步骤一次后,开盖干燥磁珠5-10min。将PCR管从磁力架上取下。加入40μL的RNase-free H2O,充分混匀后,室温孵育3min。将PCR管置于磁力架上,待溶液澄清后,小心将上清转移至新的RNase-free EP管中。检测产物的A260吸光值,确定其浓度,并于-20℃条件下保存纯化产物。
S5、dsRNA的活体注射:
筛选最佳引物:将不同引物序列合成的dsRNA稀释成所需浓度,按照5μg/g(浓度/鱼体重)的剂量浓度进行腹腔注射。实验分为4组(n=10):CIR-dsRNA-1组、CIR-dsRNA-2组、CIR-dsRNA-3组和对照组,每组3个重复,注射后1h、12h、24h、36h、48h后检测黑鲷的干扰效率。
S6、荧光定量PCR验证cirbp基因干扰效率:
(1)组织RNA提取及cDNA合成
分别取实验组和对照组黑鲷肝脏组织,使用总RNA抽提纯化试剂盒与RNa se-FreeDNA清除试剂盒将样品进行RNA提取,并使用Nano-drop 2000型核酸分析仪(Thermo Fisher公司)和琼脂糖凝胶电泳对RNA提取质量进行检测,采用M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒(生工生物),将总RNA反转录形成cD NA第一链。
(2)实时荧光定量PCR检测
采用TIANGEN公司生产的SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)试剂盒进行实时荧光定量PCR,以黑鲷β-actin基因做内参,对cirbp基因表达情况进行干扰效率检测。PCR反应条件如下表3所示:
表3荧光定量PCR反应程序
实验结果采用2-ΔΔCT计算基因相对表达量。
S7、对CIR-dsRNA-2组、CIR-dsRNA-3组和对照组进行冷应激实验:
从22℃进行降温,降温速率为2℃/h。分别降至15℃、10℃以及5℃3个温度点,在每个温度点保持24h后,进行取样。结合低温下引物CIR-dsRNA-2以及引物CIR-dsRNA-3的抑制效率,从而确定最佳引物为CIR-dsRNA-3。
S8、注射cirbp-dsRNA后对肝脏中细胞凋亡途径相关基因表达的影响:
荧光定量检测黑鲷cirbp基因以及细胞凋亡相关基因的表达量,同步骤S6。荧光定量PCR所用引物如表4所示:
表4荧光定量引物信息
上述实验结果如图1-图4所示;具体的,如图1所示,在22℃时,从腹腔注射cirbp-dsRNA,以5μg/g剂量进行干扰24小时后,实验组与对照组均无实验鱼死亡。在黑鲷的肝脏组织中,实验组cirbp基因的表达量显著低于对照组(p<0.05),CIR-RNAi-1组与CIR-RNAi-3组24h后表达量均下降到对照组的40%以下。36h后,CIR-RNAi-2组表达量下降到对照组的40%以下。48h后,CIR-RNA i-2组与CIR-RNAi-3组的cirbp基因表达量均下降到对照组的20%以下。以上结果表明在注射dsRNA 36h后,CIR-RNAi-1组、CIR-RNAi-2组与CIR-RNAi-3组所制成的dsRNA均在常温下均对黑鲷肝脏的cirbp基因表达均产生了显著的抑制(p<0.05),CIR-RNAi-2组与CIR-RNAi-3组所制成的dsRNA产生的抑制率高于CIR-RNAi-1组,故可排除CIR-RNAi-1引物组。
如图2所示,将CIR-RNAi-2组与CIR-RNAi-3组的黑鲷进行冷应激胁迫24h,引物2物组黑鲷肝脏的cirbp基因的mRNA的表达在10℃、5℃均产生了显著的抑制作用(p<0.05),而在15℃时无抑制作用(p>0.05)。CIR-RNAi-3组的cirbp基因的表达在15℃、10℃、5℃时均产生了显著的抑制作用(p<0.05)。结合低温胁迫对不同引物组的干扰效果,通过比较后发现:24h后,CIR-RNAi-3组表达量最低,下降到对照组10%以下,对基因的干扰效果相对最好。因此确定CIR-RNAi-3组的引物为干扰cirbp基因的最佳引物。
如图3、图4所示,与对照组相比:RNA干扰后黑鲷肝脏中的:bax的表达量在低温的胁迫下均无显著变化。10℃组,bcl-2、capase-3、diablo基因在急性低温胁迫过程中与对照组相比均被抑制。5℃组,capase-3、capase-1基因在表达量显著上升,bcl-2基因表达量显著下降。RNA干扰cirbp基因后,显著影响了黑鲷肝脏细胞内的细胞凋亡相关基因的表达即低温下黑鲷肝脏细胞中线粒体凋亡机制受到了调控。因此,以cirbp基因为靶基因制成的dsRNA生物制剂可以显著影响低温胁迫下黑鲷活体的肝脏中细胞凋亡相关机制。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (9)
1.一种黑鲷cirbp基因dsRNA,其特征在于,所述黑鲷cirbp基因的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述黑鲷cirbp基因dsRNA是以黑鲷的cirbp干扰基因片段为模板进行体外转录获得;黑鲷的cirbp干扰基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.一种冷诱导RNA结合蛋白,其特征在于,所述冷诱导RNA结合蛋白由权利要求1所述的黑鲷cirbp基因dsRNA编码得到,其氨基酸序列如SEQ ID N O.2所示。
3.一种如权利要求1所述的黑鲷cirbp基因dsRNA的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
以所述黑鲷cirbp基因的cDNA为模板,采用特异性引物进行PCR扩增,得到目的片段;
以目的片段为模板,合成所述黑鲷cirbp基因dsRNA。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述特异性引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的正向引物以及核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的反向引物。
5.黑鲷的cirbp干扰基因片段、如权利要求1所述的黑鲷cirbp基因dsRNA或如权利要求2所述的冷诱导RNA结合蛋白在制备用于干扰低温胁迫下黑鲷肝脏的细胞凋亡相关基因的生物抑制制剂或试剂盒中的应用。
6.黑鲷的cirbp干扰基因片段、如权利要求1所述的黑鲷cirbp基因dsRNA或如权利要求2所述的冷诱导RNA结合蛋白在制备用于抑制cirbp基因的转录表达的生物抑制制剂或试剂盒中的应用。
7.黑鲷的cirbp干扰基因片段、如权利要求1所述的黑鲷cirbp基因dsRNA或如权利要求2所述的冷诱导RNA结合蛋白在黑鲷养殖中的应用。
8.一种用于抑制cirbp基因的转录表达或干扰低温胁迫下黑鲷肝脏的细胞凋亡相关基因的生物抑制制剂,其特征在于,包括权利要求1所述的黑鲷cirbp基因dsRNA或权利要求2所述的冷诱导RNA结合蛋白。
9.一种用于抑制cirbp基因的转录表达或干扰低温胁迫下黑鲷肝脏的细胞凋亡相关基因的试剂盒,其特征在于,包括权利要求1所述的黑鲷cirbp基因dsRN A、权利要求2所述的冷诱导RNA结合蛋白或权利要求8所述的生物抑制制剂。
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