CN115960275A

CN115960275A - 一种具有多种药理活性的茯苓多糖铁制备方法

Info

Publication number: CN115960275A
Application number: CN202111189890.1A
Authority: CN
Inventors: 彭代银; 陈卫东; 张越; 王妍妍; 孙明杰; 何瑞曦; 季兆洁
Original assignee: Anhui University of Traditional Chinese Medicine AHUTCM
Current assignee: Anhui University of Traditional Chinese Medicine AHUTCM
Priority date: 2021-10-13
Filing date: 2021-10-13
Publication date: 2023-04-14

Abstract

本发明涉及一种具有多种药理活性的茯苓多糖铁制备方法。是通过对茯苓进行水提醇沉法、Sevage法除蛋白及透析过凝胶柱分离，最后得到的中性茯苓多糖PCP‑1C产物，首次将其与氯化铁在碱性条件下反应生成稳定的茯苓多糖铁复合物，可具有多种药理活性的作用。其特点是本发明提供以铁为螯合剂与茯苓多糖合成茯苓多糖铁复合物，多糖具备多重生物活性供机体吸收利用,作为补铁剂具有双效作用。此外，本研究增加了补铁剂药物的稳定性、减少了副作用并且稳定性强。

Description

一种具有多种药理活性的茯苓多糖铁制备方法

技术领域

本发明涉及药物制剂领域，优化了茯苓多糖铁的制备工艺，更具体地说，是一种具有抗氧化、补铁、增强免疫活性的茯苓多糖铁制备方法。

背景技术

铁是人体所必须的微量元素之一，对铁元素摄入不足易导致缺铁性贫血，并伴随着头晕耳鸣、注意力不集中、记忆力减退等症状，严重者还可出现精神失常或意识不清等。铁缺乏是发展中国家最主要的公共营养问题之一，也是我国主要的营养缺乏病。现临床上常以FeSO₄的形式补充铁的摄入不足，但Fe²⁺易产生内源性自由基, 导致细胞膜脂质过氧化而损伤细胞膜。现有的口服铁补充剂常会引起上腹部疼痛、腹泻和便秘等副作用，对于铁补充剂的制备方案仍需研究。

茯苓为多孔菌科真菌茯苓 Poria cocos (Schw.) Wolf的干燥菌核，茯苓多糖是其主要成分之一。现代药理学研究已证实了茯苓多糖能够抗氧化、抗病毒、降血脂等作用，副作用小且能够提高机体免疫力。因茯苓多糖易被修饰从而改变其理化性质，是目前极具有开发意义的保健食品、新药品材料以及发展潜力的载体之一。但目前对茯苓多糖修饰后的各种生物特性的研究较少，针对口服铁补充剂的不足可通过对茯苓多糖的修饰改造去解决。

我们通过对茯苓进行提取分离得到了中性茯苓多糖PCP-1C产物，以铁为螯合剂，促进茯苓多糖与多聚铁核发生络合反应, 形成稳定的多糖铁复合物，使游离的Fe³⁺变得极少，改善了单纯性口服补铁剂带来的副作用。所制备的茯苓多糖铁能够抗氧化、补铁、增强免疫活性，且具备疗效好、稳定性强和副作用少等优点。

发明内容

本发明第一个目的是，针对以上反应的口服补铁剂的不足，以茯苓多糖为模型药物，结合其本身的药理优势，本发明提供了一种新的茯苓多糖铁的制备方法。

本发明第二个目的是，对茯苓多糖铁的工艺进行优化选择，使其抗氧化能力强、铁含量高、免疫活性强。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：提供一种制备抗氧化、补铁、增强免疫活性的茯苓多糖铁的方法，所述的制备方法包括如下步骤：

（1）通过对茯苓进行水提醇沉法、Sevage法除蛋白及透析过凝胶柱分离得茯苓多糖。

（2）将步骤（1）中茯苓多糖置于锥形瓶中，加入柠檬酸三钠溶解在超纯水中。

（3）将步骤（2）中溶液放入水浴锅中加热，加入碳酸钠溶液。

（4）将步骤（3）中边搅拌边加入FeCl₃溶液和NaOH溶液。

（5）将步骤（4）中反应液进行离心，收集上层红棕色液体。

（6）将步骤（5）中收集的液体加入乙醇摇匀后置于4 ℃冰箱中过夜，离心收集沉淀，用适量的无水乙醇洗涤，再离心；将收集到的沉淀冷冻干燥，即得到茯苓多糖铁。

优选地，步骤（1）中醇沉中乙醇浓度应为95%~100%，最后取中性茯苓多糖PCP-1C产物。

优选地，步骤（2）中茯苓多糖与柠檬酸三钠的比例是4:1~2:1，配置成20~30 mg/mL的溶液。

优选地，步骤（3）中水浴加热到60℃~75℃时加入8%~10%的碳酸钠溶液。

优选地，步骤（4）中一边搅拌一边交替滴加FeCl₃溶液和NaOH溶液3~5mL。FeCl₃溶液浓度为1%~3% moL·L^-1，NaOH溶液浓度为4%~6% moL·L^-1，反应液的pH控制在8～9，继续保持水浴温度为60℃~75℃，加热1~1.5 h。

优选地，步骤（5）中反应结束后，反应液需冷却至室温，在2500~3000 r·min^-1离心10~15 min，收集上层红棕色液体。

优选地，步骤（6）中收集的液体按1:1~1:1.2比例加入无水乙醇，摇匀后在2500~3000 r·min^-1离心10~15 min后收集沉淀，用1:1~1:1.2比例加入无水乙醇洗涤，在2500~3000 r·min^-1再次离心10~15 min。将收集到的沉淀放入冷冻干燥箱中充分干燥即得深红棕色茯苓多糖铁粉末。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：以多糖含量、铁含量以及铁的稳定性等为考察指标，采用了单因素实验和正交实验选取最适反应条件。所制备的茯苓多糖铁以邻菲啰啉紫外分光光度法测定复合物中的铁含量；以苯酚-硫酸法测得复合物中多糖的含量；以茯苓多糖铁中铁离子的稳定性为评价指标；以抗羟基自由基活性作用为抗氧化指标。从中选取最优的茯苓多糖铁制备方法。

本发明的优点在于

1、本发明提供了一种新型补铁剂，不仅克服了传统口服补铁剂带来的副作用，而且药效稳定，安全性高。

2、本发明以茯苓多糖为载体，通过对茯苓多糖的结构修饰，与铁离子发生螯合反应，在其原有的药理作用基础上增加了新的疗效。

3、本发明采用单因素实验和正交实验，从多种可能影响制备工艺的因素出发，选取了最适制备方案，优化了茯苓多糖铁的制备工艺。

4、本发明通过对其多糖含量、铁含量以及铁的稳定性测量，给茯苓多糖铁发挥抗氧化、补铁、提高免疫活性提供了用药依据。

附图说明

图1 PCP-1C的均一性和分子量：（A）PCP-1C的HPLC图;(B) PCP-1C的LS和RI图。

图2 PCP-1C的离子色谱图（A）和标准单糖的离子色谱图（B）。

图3： a：茯苓多糖铁扫描电镜图；b:茯苓多糖铁能谱分析图；c:茯苓多糖铁的元素分布图。

具体实施方案

下面结合实例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实例1 茯苓多糖铁的制备

精密称取1.0 g中性茯苓多糖PCP-1C产物粉末于150 mL锥形瓶中，依次加入40 mL超纯水和500 mg柠檬酸三钠将锥形瓶放入温度设定为70 ℃的集热式磁力搅拌器中，待瓶中物质充分溶解后加入1.0 mL10%的碳酸钠溶液；向锥形瓶中交替滴加4 mL 2.0 moL/L三氯化铁溶液和6.0 moL/L氢氧化钠溶液，控制瓶中溶液始终为碱性（PH=8）；当瓶中出现红棕色不溶性沉淀时，滴加停止，继续水浴加热1.0 h；将所得溶液离心，弃去沉淀，保留上清液；将上清液以1:1的比例加入乙醇，再次离心，所得沉淀即为茯苓多糖铁。

实例2茯苓多糖铁的制备

精密称取1.0 g中性茯苓多糖PCP-1C产物粉末于150 mL锥形瓶中，依次加入40 mL超纯水和250 mg柠檬酸三钠将锥形瓶放入温度设定为60 ℃的集热式磁力搅拌器中，待瓶中物质充分溶解后加入1.0 mL 8%的碳酸钠溶液；向锥形瓶中交替滴加3 mL 2.5 moL/L三氯化铁溶液和5.0 moL/L氢氧化钠溶液，控制瓶中溶液始终为碱性（PH=9）；当瓶中出现红棕色不溶性沉淀时，滴加停止，继续水浴加热1.5 h；将所得溶液离心，弃去沉淀，保留上清液；将上清液以1:1.2的比例加入乙醇，再次离心，所得沉淀即为茯苓多糖铁。

实例3茯苓多糖铁的制备

精密称取1.0 g中性茯苓多糖PCP-1C产物粉末于150 mL锥形瓶中，依次加入40 mL超纯水和400 mg柠檬酸三钠将锥形瓶放入温度设定为75 ℃的集热式磁力搅拌器中，待瓶中物质充分溶解后加入1.0 mL 9%的碳酸钠溶液；向锥形瓶中交替滴加5 mL 1.0 moL/L三氯化铁溶液和4.0 moL/L氢氧化钠溶液，控制瓶中溶液始终为碱性（PH=9）；当瓶中出现红棕色不溶性沉淀时，滴加停止，继续水浴加热1.0 h；将所得溶液离心，弃去沉淀，保留上清液；将上清液以1:1.2的比例加入乙醇，再次离心，所得沉淀即为茯苓多糖铁。

实例4茯苓多糖铁制备的优化

通过单因素实验设计了PH值（6、7、8、9）、溶剂用量（30、40、50、60 mL）、反应时间（0.5、1、1.5、2 h）、三氯化铁用量（2、3、4、5 mL）、柠檬酸三钠用量（0、250、500、1000 mg）和反应温度（60、70、80、90 ℃）的影响。通过实验分析最终选择反应条件为PH值为8，溶剂用量为40 mL，三氯化铁用量为40 mL，反应温度为70℃。在单因素实验基础上，选择了四个因素：PH值（因子A）、溶剂用量（因子B）、三氯化铁用量（因子C）和柠檬酸三钠用量（因子D）进行正交实验做进一步的优化，以茯苓多糖铁络合物的铁含量为因变量，按最优制备工艺制备茯苓多糖铁，结果表明茯苓多糖铁中铁含量为28.14%。最终选择的反应条件是PH值为8，溶剂用量为40 mL，三氯化铁用量为4 mL，柠檬酸三钠用量为500 mg。

精密称取1.0 g中性茯苓多糖PCP-1C产物粉末于150 mL锥形瓶中，依次加入40 mL超纯水和500 mg柠檬酸三钠将锥形瓶放入温度设定为70 ℃的集热式磁力搅拌器中，待瓶中物质充分溶解后加入1.0 mL10%的碳酸钠溶液；向锥形瓶中交替滴加4 mL 2.0 moL/L三氯化铁溶液和6.0 mol/L氢氧化钠溶液，控制瓶中溶液pH始终为碱性（PH=8）；当瓶中出现红棕色不溶性沉淀时，滴加停止，继续水浴加热1.0 h；将所得溶液离心，弃去沉淀，保留上清液；将上清液以1:1的比例加入乙醇，再次离心，所得沉淀即为茯苓多糖铁；将所得沉淀放入冷冻干燥箱中充分干燥即得深红棕色茯苓多糖铁粉末。

以葡萄糖为标准品，用苯酚硫酸法测得茯苓多糖铁中多糖含量为34.84%；用邻菲啰啉法测得茯苓多糖铁的平均吸光度为0.4582，将平均吸光度代入线性回归方程得到铁浓度C=0.002814 mg·mL^-1。根据公式算得多糖铁中铁含量为28.14%；用亚铁氰化钾检验茯苓多糖铁溶液，茯苓多糖铁溶液没有出现蓝色沉淀，说明茯苓多糖与铁络合生成稳定的复合物，不含有游离的Fe³⁺；用亚铁氰化钾检测长期放置在空气中的茯苓多糖铁水溶液，结果同样没有表现出Fe³⁺的特殊反应，说明茯苓多糖与Fe³⁺络合生成稳定的复合物；由茯苓铁多糖对羟基自由基的清除作用可知，茯苓多糖与铁结合为茯苓多糖铁配合物后仍保持抗氧化活性。由此，我们得到了一种具有多种药理活性的茯苓多糖铁制备方法。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术，在不脱离本发明方法的前提下，还可做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种具有多种药理活性的茯苓多糖铁，特征在于采用茯苓菌核为原料，所述的制备方法包括如下步骤：

（1）通过对茯苓进行水提醇沉法、Sevage法除蛋白及透析过凝胶柱分离得茯苓多糖；

（2）将步骤（1）中茯苓多糖置于锥形瓶中，加入柠檬酸三钠溶解在超纯水中；

（3）将步骤（2）中溶液放入水浴锅中加热，加入碳酸钠溶液；

（4）将步骤（3）中边搅拌边加入FeCl₃溶液和NaOH溶液；

（5）将步骤（4）中反应液进行离心，收集上层红棕色液体；

（6）将步骤（5）中收集的液体加入乙醇摇匀后离心收集沉淀，用适量的无水乙醇洗涤，再离心；将收集到的沉淀冷冻干燥，即得到茯苓多糖铁。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（1）中醇沉中乙醇浓度应为95%~100%，最后取中性茯苓多糖PCP-1C产物。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（2）中茯苓多糖与柠檬酸三钠的比例是4:1~2:1，配置成20~30 mg/mL的溶液。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（3）中水浴加热到60 ℃~75 ℃时加入8%~10%的碳酸钠溶液。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（4）中一边搅拌一边交替滴加FeCl₃溶液和NaOH溶液3~5mL；eCl₃溶液浓度为1%~3% moL·L^-1，NaOH溶液浓度为4%~6% moL·L^-1，反应液的pH控制在8~9，继续保持水浴温度为60 ℃~75 ℃，继续加热1~1.5 h。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（5）中反应结束后，反应液需冷却至室温，在2500~3000 r·min^-1离心10~15 min，收集上层红棕色液体。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（6）中收集的液体按1:1~1:1.2比例加入无水乙醇，摇匀后放入4 ℃冰箱中过夜；二天在2500~3000 r·min^-1离心10~15 min后收集沉淀，用1:1~1:1.2比例加入无水乙醇洗涤，在2500~3000 r·min^-1再次离心10~15min；收集到的沉淀放入冷冻干燥箱中充分干燥即得深红棕色茯苓多糖铁粉末。

8.根据权利要求1-7任一所述的制备方法制得的茯苓多糖铁具有多种药理活性功能。