CN115948300B - 一株副干酪乳杆菌及其在发酵甲壳动物及昆虫外壳提取甲壳素中的应用 - Google Patents
一株副干酪乳杆菌及其在发酵甲壳动物及昆虫外壳提取甲壳素中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株副干酪乳杆菌及其在发酵甲壳动物及昆虫外壳提取甲壳素中的应用。该菌株名称为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)M‑1，保藏编号为CCTCC NO：M20221886，该菌株于2022年12月6日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。本发明中筛选得到的副干酪乳杆菌M‑1营养要求低，能够利用经过水解清洗的甲壳动物及昆虫外壳中残留的少量蛋白质生长，并发酵原料获得甲壳素。因此，采用该副干酪乳杆菌M‑1不仅避免了原料中各种成分对发酵的不利影响，提高了发酵的稳定性，而且能够回收利用发酵液中的蛋白质，还可以节省葡萄糖等碳源的用量，降低发酵成本。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵法提取甲壳素领域，特别涉及一株副干酪乳杆菌及其在发酵甲壳动物及昆虫外壳提取甲壳素中的应用。
背景技术
目前生产甲壳素的原料主要是各种甲壳动物的外壳，常见的包括各种虾壳、蟹壳、龙虾壳等；而昆虫(例如黑水虻、黄粉虫、蚕蛹等)外壳中也含有大量甲壳素，也可作为生产甲壳素的原料。目前工业上主要采用化学法提取甲壳素，即采用盐酸和氢氧化钠交替处理虾、蟹壳，脱除矿物质和蛋白质、脂质等杂质，得到甲壳素。化学法在生产中产生大量含有高浓度有机质的碱性废水，污染严重，因此，亟待开发绿色环保的新型甲壳素生产技术取代旧技术。
在此背景下，国内外开始研究采用乳酸菌发酵法提取虾、蟹壳中甲壳素，这种方法主要是利用各种乳酸菌或其他产酸菌将葡萄糖等转化为乳酸等有机酸，从而将原料中碳酸钙等矿物质溶解脱除；同时利用原料自身含有的蛋白酶，或添加的蛋白酶，或再经产蛋白酶的微生物发酵，将原料中的大部分蛋白质脱除，得到甲壳素。
目前发现的适于上述发酵过程的乳酸菌的营养要求均较高，一般需要利用虾壳、蟹壳等原料本身丰富的营养成分，有些菌种甚至还需额外添加酵母膏、蛋白胨等营养成分。例如，王琪鑫[1](2021)采用嗜热链球菌和花椒芽孢杆菌发酵虾壳提取甲壳素，发酵过程中需额外添加酵母浸粉、蛋白胨等高成本成分，且在最优条件下矿物质脱除率仅为83.80％，蛋白质脱除率仅为68.89％。辛荣玉[2](2020)采用嗜酸乳杆菌以及深海微小杆菌通过二步连续发酵虾壳提取甲壳素，其原料是未经水解的虾壳，发酵后矿物质脱除率为99.84％，蛋白质脱除率为91.60％。姜启兴等[3](2015)采用植物乳杆菌发酵经机械采肉后的南极磷虾壳提取甲壳素，脱钙率仅为84.6％。黄璠[4](2012)分别采用鼠李糖乳杆菌脱除虾壳中的钙盐，采用枯草芽孢杆菌脱除虾壳中的蛋白质，获得甲壳素，其原料为未经水解的虾壳，发酵中还添加了蛋白胨、酵母膏等高成本成分，如果先用鼠李糖乳杆菌发酵脱钙，再用枯草芽孢杆菌发酵脱蛋白，脱钙率为98.98％，脱蛋白率为85.45％；如果先用枯草芽孢杆菌发酵脱蛋白，再用鼠李糖乳杆菌发酵脱钙，则脱钙率大幅降低至88.24％，脱蛋白率为88.15％。可见，其所用鼠李糖乳杆菌在脱除了蛋白质的虾壳中产酸脱钙的效率显著下降，即使添加了酵母膏也不行。中国专利专利号为201110061309.8，名称为“一种利用嗜酸乳杆菌从虾头和虾壳中提取蛋白质和甲壳素的方法”以及专利号为200910040121.8，名称为“一种从虾头和虾壳中提取蛋白质和甲壳素的方法”中公开提取蛋白质和甲壳素的方法，但这两份专利中均须采用未经水解的虾壳。Duan等[5](2012)、段杉等[6](2009)、李磊等[7](2011)以及刘斯雅等[8](2011)发表的关于发酵法提取甲壳素的论文中所采用的乳酸菌也只能发酵未经水解的营养丰富的虾壳。
国外相关研究也均采用了未经水解的虾壳，例如Pacheco等[9](2009)研究了利用植物乳杆菌发酵虾壳、虾头回收虾青素和甲壳素；Cira等[10](2002)利用乳杆菌发酵未经水解的虾壳、虾头，采用蔗糖作碳源，发酵96小时后体系pH仅降低至4.2～4.3。此外，还有大量文献，如Pallin[11](2016)，Slizewska[12](2020)，Wang[13](2020)Ledesma[14](1977)，Morishita[15](1981)等，均表明乳杆菌属细菌(包括副干酪乳杆菌)的营养要求均较高，因为乳杆菌属细菌合成氨基酸和维生素的能力不强，需要从环境中摄取。
然而，目前发酵法提取甲壳素的技术尚不完善，存在几个问题：第一、发酵稳定性差，难以实现工业化生产。如前所述，目前用于发酵提取甲壳素的乳酸菌一般营养要求较高，需要较丰富的氨基酸、维生素等营养因子，因此发酵中需要利用原料中丰富的蛋白质等营养成分，这导致发酵稳定性较差，原因如下：1、原料中添加或污染的成分差别很大，在对虾等动物养殖过程中，可能使用各种抗生素、激素、药物等；养殖环境及饲料中也存在各种污染物和添加剂；在储运、加工过程中为达到防腐、护色等目的可能超量超范围使用添加剂(例如亚硫酸盐等)，甚至使用各种非法添加物等，这些成分大部分残留在上述动物外骨骼所包含的内脏、体液及少量肌肉组织中，显著抑制微生物的生长。2、原料固有成分不稳定，甲壳动物及昆虫外壳不同部位(例如头胸甲和腹甲)、批次、品种、季节等因素均会造成原料中各种成分的显著波动。3、原料在贮藏过程中可产生多种对微生物有害的成分，甲壳动物及昆虫外壳在贮藏过程中原料可能发生霉变、细菌性腐败、生虫、脂肪氧化及水解、褐变等变化，这些变化中产生的真菌毒素、细菌毒素、虫便、脂肪氧化产物、游离脂肪酸、单甘脂、褐变产物等均对微生物有害。上述原因导致乳酸菌发酵提取甲壳素的效果很不稳定，甚至失败，难以实现工业化生产。第二、发酵液中的蛋白质不易回收利用。未脱蛋白质的虾、蟹、龙虾壳及昆虫壳在发酵过程中蛋白质被蛋白酶(包括原料内源蛋白酶、外加蛋白酶，或微生物产生的蛋白酶)水解进入发酵液中；同时，原料中的矿物质被转化为乳酸钙等可溶性盐类也进入发酵液；发酵液中还有大量乳酸。蛋白质与大量盐类、乳酸等混合在一起，不易回收利用。第三、发酵成本较高，其原因为：(1)葡萄糖消耗量较大，发酵中葡萄糖不仅用于维持菌体生长；还转化为乳酸溶解碳酸钙等矿物质；此外，还需大量乳酸维持发酵体系足够低的pH。其中前二个方面的消耗是必须的，但第三方面的消耗则与发酵体系中蛋白质的浓度有很大关系，由于蛋白质具有较强的缓冲作用，蛋白质浓度越高则必须有更多乳酸才能维持足够低的pH值，这就导致葡萄糖的消耗量增加。(2)发酵中乳酸菌须利用原料中丰富的蛋白质等营养成分，甚至需要额外添加酵母膏、蛋白胨等高成本成分。因此，采用目前的乳酸菌菌种和方法不仅难以回收原料中的蛋白质，甚至还增加了酵母膏、蛋白胨等成分的成本。上述几个问题导致发酵法生产甲壳素的技术难以实现稳定的、规模化的工业化生产。
针对上述问题，一个可行的解决方案就是先采用蛋白酶水解去除原料中危害微生物发酵的成分和绝大部分蛋白质等，然后再发酵提取甲壳素。然而，经过水解和清洗的原料营养贫乏，绝大多数乳酸菌无法在其中大量生长，因此，只有找到能够在上述营养贫乏的原料中大量生长的乳酸菌才能实现上述方案。但迄今为止，未见报道能够发酵经过水解去除了大部分蛋白质等成分的虾壳、蟹壳、昆虫壳等原料提取甲壳素的乳酸菌菌种。
参考文献：
[1]王琪鑫，2021，生物发酵法制备甲壳素的研究，青岛科技大学硕士学位论文.
[2]辛荣玉，2020，基于微生物法建立虾壳中甲壳素绿色制备技术研究，青岛科技大学硕士学位论文.
[3]姜启兴，陈雪姣，许兆滨等，2015，植物乳杆菌L-45发酵南极磷虾壳的影响因素研究，食品工业科技，36(14):212-215.
[4]黄璠，2012，微生物发酵虾壳制备甲壳素的研究，湖北工业大学硕士学位论文.
[5]Duan S.,Li L.,Zhuang Z.J.,et al.,2012,Improved Production ofChitin from Shrimp Waste by Fermentation with Epiphytic Lactic Acid Bacteria，Carbohydrate polymers，891283–1288
[6]段杉，张影霞，陆婷婷等，2009，利用乳酸菌发酵协同自溶作用回收虾头、虾壳中的蛋白质，食品与发酵工业，35(2):80～83.
[7]李磊，庄泽娟，段杉，2011，以共附生乳酸菌发酵虾头、虾壳的研究，食品与发酵工业,37(6),82～86.
[8]刘斯雅，林瑞君，庄泽娟等，2011，植物乳杆菌发酵虾头、虾壳回收蛋白质和甲壳素的研究，现代食品科技,27(4):408～411.
[9]Pacheco N.,Garnica-González M.,Ramírez-Hernández J.Y.,et al.2009,Effect of temperature on chitin and astaxanthin recoveries from shrimp wasteusing lactic acid bacteria.Bioresource Technology,100:2849～2854.
[10]Cira L.A.,Huerta S.,Hall G.M.,et al.2002,Pilot scale lactic acidfermentation of shrimp wastes for chitin recovery.Process Biochemistry,37:1359～1366.
[11]Pallin A.,Agback P.,Jonsson H.et al.2016,Evaluation of growth,metabolism and production of potentially bioactive components duringfermentation of barley with Lactobacillus reuteri.Food Microbiology.57:159-171.
[12]Slizewska K.,Chlebicz-Wójcik A.2020,Growth Kinetics of ProbioticLactobacillus Strains in the Alternative,Cost-Effcient Semi-SolidFermentation Medium.Biology.9:423.
[13]Wang T.,Lu Y.Y.,Yan H.,et al.2020,Fermentation optimization andkinetic model for high cell density culture of a probiotic microorganism:Lactobacillus rhamnosus LS-8.Bioprocess and Biosystems Engineering.43:515–528.https://doi.org/10.1007/s00449-019-02246-y.
[14]Ledesma OV.,Holgado APDR.,Oliver G.1977,A synthetic medium forcomparative nutritional studies of lactobacilli[J].Journal of AppliedBacteriology.42:123-133.
[15]Morishita T.,Deguchi Y.,Yajima M.,et al.1981,Multiple nutritionalrequirements of lactobacilli:Genetic lesions affecting amino acidbiosynthetic pathways.Journal of Bacteriology.148:64–71.
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株副干酪乳杆菌。
本发明的另一目的在于提供所述副干酪乳杆菌的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一株副干酪乳杆菌，名称为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)M-1，保藏编号为CCTCC NO：M 20221886，该菌株于2022年12月6日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。
一种培养所述副干酪乳杆菌的方法，具体步骤为：将上述副干酪乳杆菌接种于培养基中，于10℃～45℃条件下进行培养。
所述的培养基为常规细菌培养基，如MRS琼脂培养基等。
所述的培养的温度优选为25℃～40℃；更优选为28℃～37℃。
所述的副干酪乳杆菌在发酵甲壳动物和/或昆虫外壳提取甲壳素中的应用。
所述的副干酪乳杆菌可以在贫营养条件下生长，能够发酵经过蛋白酶水解和清洗脱除了大部分蛋白质等营养成分的甲壳动物及昆虫的外壳，脱除其中的矿物质并进一步脱除蛋白质，获得甲壳素。
一种利用所述副干酪乳杆菌发酵甲壳动物和/或昆虫外壳提取甲壳素的方法，包括如下步骤：
(1)取甲壳动物和/或昆虫外壳原料，加水混匀后再加入蛋白酶或利用原料自身的内源蛋白酶进行水解(水解原料中的蛋白质)，待水解结束后固液分离，并用水清洗沉淀，得到水解后的固体沉淀；
(2)向水解后的固体沉淀中加入水和碳源，并灭菌，冷却后接种上述副干酪乳杆菌，于10～45℃条件下进行发酵，待发酵结束后固液分离发酵液和残渣，并用清水清洗残渣，干燥，得到甲壳素。
步骤(1)中所述的甲壳动物外壳优选为经过粉碎的甲壳动物外壳，其粒径大小为0.5cm以下；优选为0.2～0.5cm。
步骤(1)中所述的昆虫外壳优选为经过粉碎的昆虫外壳，其粒径大小为0.5cm以下；优选为0.2～0.3cm。
步骤(1)中所述的甲壳动物包括虾、蟹和龙虾等中的至少一种。
步骤(1)中所述的昆虫包括黑水虻、蚕蛹和黄粉虫(面包虫)等中的至少一种；优选为黑水虻。
步骤(1)中所述的甲壳动物外壳以及昆虫外壳为所属动物(甲壳纲及昆虫纲动物)的外骨骼，包括头部、胸部、腹部及附肢等部位的外骨骼；所述外壳可为干燥、冻结(冻藏)或新鲜状态的虾壳、蟹壳、龙虾壳、昆虫壳原料，或已经外源蛋白酶或原料内源蛋白酶水解后的状态的虾壳、蟹壳、龙虾壳、昆虫壳原料；如果采用新鲜的或冻藏的原料则可以利用原料自身的内源蛋白酶从而减少或不使用外加的蛋白酶；如利用原料自身的内源蛋白酶，则可适当粉碎原料以破坏组织细胞，有效释放蛋白酶。
步骤(1)中所述的水的用量为原料中干物质质量的5倍以上(水解过程中要保持水分充足，可适当增加水的用量)；优选为原料中干物质质量的7～10倍。
步骤(1)中所述的蛋白酶为外源蛋白酶或原料所含的内源蛋白酶。
所述的外源蛋白酶可根据实际需要进行选择，如从商业途径购买的各种蛋白酶，如木瓜蛋白酶，无花果蛋白酶，菠萝蛋白酶，中性蛋白酶，胰蛋白酶，胃蛋白酶，复合蛋白酶等等。
所述的外源蛋白酶的添加量按实际需要进行添加，一般控制在0.1％～10％之间。
步骤(1)中所述的水解的温度为20℃～65℃，可根据所选的蛋白酶的最适温度或最适温度以下5℃的温度范围内进行水解；如利用木瓜蛋白酶或原料自身的内源蛋白酶，其温度优选为50～55℃。
步骤(1)中，水解液(以及清洗液)的主要成分为蛋白水解物，可根据需要干燥或不干燥，用于配制饲料、肥料等各种用途。
步骤(1)和(2)中所述的固液分离可采用本领域常规方法进行，包括过滤、离心、静置沉淀等方法。
步骤(2)中所述的水的用量为固体沉淀中干物质质量的10倍以上；优选固体沉淀中干物质质量的20～40倍(由于沉淀中含有大量水分，因此，这里以水解后的沉淀中干物质为基准)。
步骤(2)中所述的碳源为葡萄糖、蔗糖、淀粉糖浆、糖蜜、乳糖和麦芽糖等中的一种或多种；优选为葡萄糖。
步骤(2)中所述的碳源的添加量为固体沉淀物中矿物质质量的200％以上，优选为固体沉淀物中矿物质质量的300％～500％；这里固体沉淀物中的干物质包括大量矿物质，主要是由钙、镁离子形成的碳酸盐和磷酸盐，在发酵过程中乳酸菌产生的乳酸将这些矿物质转化为乳酸盐而溶于水，从而被脱除。而乳酸是由葡萄糖等糖类转化来的，所以矿物质含量越高，需要的葡萄糖就越多。
步骤(2)中所述的碳源可根据实际情况，单独灭菌后再与其他成分(水解后的固体沉淀)混合，也可与水解后的固体沉淀一起混合后再灭菌。
步骤(2)中所述的灭菌可采用发酵领域任何一种灭菌方法，例如巴氏灭菌、高压蒸汽灭菌、高温高压灭菌等；优选为：100℃煮沸5分钟。
步骤(2)中所述的冷却为冷却至50℃以下。
步骤(2)中所述的副干酪乳杆菌的接种方法可采用本领域的任何一种接种方法进行接种。
步骤(2)中所述的副干酪乳杆菌优选为生长至对数期的副干酪乳杆菌。
步骤(2)中所述的副干酪乳杆菌的接种量为可根据实际需要加入，优选为发酵体系总体积的0.1％～10％。
步骤(2)中所述的发酵的温度优选为15～45℃；进一步优选为28～38℃；再进一步优选为35～37℃。
步骤(2)中所述的发酵的时间为24h以上；进一步优选为48h以上；再进一步优选为72h以上；更进一步优选为5～7天。
步骤(2)中所述的用清水清洗残渣可采用干净的清水(如自来水等)反复冲洗或浸泡残渣。
步骤(2)中，发酵液中含有大量乳酸钙等盐类以及乳酸和一些蛋白质等，可进一步对其进行利用。
步骤(2)中所述的干燥为采用晒干、风干、烘干、真空干燥和微波干燥等中的至少一种干燥方式进行干燥。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明解决了乳酸菌发酵法生产甲壳素稳定性差的问题：本发明采用蛋白酶(原料自身的蛋白酶或外加的蛋白酶)水解和清洗分离出甲壳动物及昆虫外壳中大部分蛋白质等营养成分，同时去除了危害发酵的各种成分(影响微生物生长)，从而避免了原料对发酵稳定性的影响；然后采用能够在贫营养条件下生长的菌种进行发酵，即向水解后的原料中添加葡萄糖和水后，接种副干酪乳杆菌M-1发酵，可有效脱除原料中的矿物质并进一步脱除残留蛋白质，获得甲壳素。
(2)本发明拓宽了原料范围：由于通过蛋白酶水解和清洗去除了原料中大部分蛋白质等营养成分并去除了影响微生物生长的各种成分，不同原料间的差异基本被消除，因此，本发明菌种和方法适用于发酵各种不同来源、质量、品种及贮藏状态的虾壳、蟹壳、龙虾壳、昆虫壳等原料。
(3)本发明所得蛋白质纯度更高，增加了产出：由于现有菌种不能适应那些经过水解去除了大部分蛋白质和其他营养成分的营养贫乏的虾壳、蟹壳、龙虾壳、昆虫壳等原料，因此只能采用未经水解的原料，这就导致发酵液中蛋白质与大量盐类及乳酸混在一起，干燥所得蛋白质中盐类及乳酸含量很高，不易利用，而本发酵方法在发酵前预先水解分离出原料中的蛋白质，所得蛋白质纯度很高，适于作为饲料蛋白等，增加了产出。
(4)本发明降低了发酵成本：首先，由于本发明菌种的营养要求低，该菌株能够分解利用原料中残留的少量蛋白质，能够在经过上述水解后营养贫乏的原料上生长(产酸)，因此，发酵中可不添加酵母膏、蛋白胨等高成本成分；此外，采用本发明方法可节省葡萄糖等碳源的用量，因为采用经过水解的原料发酵，发酵液中蛋白质浓度大大降低，仅需较少乳酸即可抵消蛋白质的缓冲作用，维持足够低的pH值保证脱除矿物质的效果，因此，葡萄糖消耗量减少，可见本发明的综合发酵成本显著降低。
附图说明
图1是副干酪乳杆菌M-1在MRS琼脂培养基上的生长状态图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
实施例1副干酪乳杆菌M-1的分离、鉴定和保藏
从泡菜中分离得到多株菌株，将其分别命名为M-1、D-8，D2，B16，经鉴定，均属于副干酪乳杆菌；其中，将副干酪乳杆菌M-1接种到添加了0.5％(w/v)碳酸钙的MRS琼脂培养基(De Man,Rogosa and Sharpe Agar)上，该菌可在此培养基上生长，并形成透明圈，且该菌在MRS琼脂培养基生长的菌落凸起，白色，湿润，如图1所示。所述副干酪乳杆菌M-1经显微镜观察为革兰氏阳性杆菌，在有氧及无氧条件下均可生长，且糖发酵实验表明，该菌可以利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖、麦芽糖、山梨糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖。
所述副干酪乳杆菌M-1经16S rDNA测序鉴定为副干酪乳杆菌，其序列如下：
AACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCTTAAGTGGGGGATAACATTTGG
AAACAGATGCTAATACCGCATAGATCCAAGAACCGCATGGTTCTTGGCTGAAAGATGGCGTAAGCTAT
CGCTTTTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGATGATACG
TAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGC
AGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGC
TTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTGGAGAAGAATGGTCGGCAGAGTAACTGTTGTCGGCGTGACGG
TATCCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTT
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TTCCCCTTCGGGGGCAAAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGT
TAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGACTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAGTAAGACT
GCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTAC
ACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAGACCGCGAGGTCAAGCTAATCTCTTAAAGCCA
TTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAG
CACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACAC
CCGAAGCCGGTGGCGTAACCCTTTTAGGGAGCGAGCCGTCT。
(2)副干酪乳杆菌M-1耐贫营养能力研究
对上述筛选得到的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)M-1进行耐贫营养能力实验，以副干酪乳杆菌KB-6，D-8，D2、B16，以及副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)CICC6234(购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，即类干酪乳酪杆菌Lacticaseibacillus paracasei 6234”)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)CCTCC M 2011035(已在中国专利(专利号为201110061309.8、名称为“一种利用嗜酸乳杆菌从虾头和虾壳中提取蛋白质和甲壳素的方法”中公开，菌株名称为：嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus SW01)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)GIM1.208(可购自广东省微生物菌种保藏中心；或根据参考文献“余奕宏，丁小娟，丁筑红等，嗜酸乳杆菌GIM1.208β-葡萄糖苷酶的异源表达、纯化及酶学性质研究，生物化学与生物物理进展，2021年48卷1期”获得)为对照；具体步骤为：
以南美白对虾的干虾壳为实验对象，取5.0g干虾壳，另取相同质量的干虾壳经木瓜蛋白酶(5％(w/v)木瓜蛋白酶(13000IU/g，广州远天酶制剂公司)，55℃保温5小时)水解烘干，得3.0g水解干虾壳。向上述干虾壳、水解干虾壳中分别加水，另分别取3g葡萄糖加水溶解，体系总加水量为100mL，虾壳及葡萄糖分别于100煮沸5分钟灭菌，冷却后混合，将下表中各菌种培养至对数期，按发酵体系总体积1％的接种量接种到含未水解的虾壳和水解过的虾壳的发酵体系中，于37℃发酵，在0、24、48、72和96h测定pH变化。如果体系pH显著快速降低，则说明接种的菌株生长正常，将大量葡萄糖转化为乳酸导致pH显著下降；如果pH不变或降低不明显，则说明未生长或生长不良。
结果如表1所示：从表1的结果中可以看出，上述几株乳杆菌在发酵未水解的虾壳时，均生长良好；但在发酵水解过的虾壳时，只有M-1生长良好。
表1几株乳杆菌在水解/未水解的虾壳中的生长情况
我们进一步测试了副干酪乳杆菌M-1、D-8，以及嗜酸乳杆菌CCTCC M 2011035的营养要求，结果如表2所示。从中可以看出，副干酪乳杆菌M-1的必须营养因子只有6种，副干酪乳杆菌D8需要10种，嗜酸乳杆菌CCTCC M 2011035则需要多达24种。
上述表1及表2的数据均说明，副干酪乳杆菌M-1的营养需求低于其他乳杆菌，可在营养贫乏的环境下生长。
表2几株副干酪乳杆菌的必须生长因子的测定结果
注：表中“√”表示必须，“×”表示不必须。
根据上述副干酪乳杆菌M-1的鉴定结果，将其命名为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)M-1，该菌株于2022年12月6日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20221886。
实施例2
本实施例利用副干酪乳杆菌M-1发酵虾壳提取甲壳素，其具体步骤如下：
(1)取500g干虾壳(南美白对虾虾壳)粉碎至粒径大小为0.5cm左右，加入5000mL水，加蛋白酶(5％(w/v)木瓜蛋白酶(13000IU/g，广州远天酶制剂公司))于55℃水解5小时后倒出水解液，并用水清洗沉淀二次。
(2)向上述沉淀中加水8000mL，于100℃煮沸5分钟灭菌；另取300g葡萄糖加水500mL溶解，按上述条件单独灭菌，冷却后倒入灭菌的沉淀中。
(3)冷却后接种90mL生长至对数期的副干酪乳杆菌M-1菌液，于35℃保温发酵5天。
(4)过滤出发酵液，反复用清水清洗残渣，晒干，得150g甲壳素。
实施例3
本实施例利用副干酪乳杆菌M-1发酵冻虾头和虾壳提取甲壳素，其具体步骤如下：
(1)取2000g冻结的南美白对虾的虾头和虾壳的混合物(购自阳江市)，粉碎至粒径大小为0.2～0.3cm左右，然后加1000mL水，然后在50℃水浴中保温5小时，利用虾头中的内源蛋白酶水解蛋白质。然后过滤出水解液，清洗沉淀。
(2)向沉淀中加水至总体积7000mL，搅拌均匀，然后于100℃煮沸5分钟灭菌；另取230g葡萄糖加水250mL溶解，按上述条件单独灭菌，冷却后倒入灭菌后的水解虾头和虾壳中。
(3)接种50mL生长至对数期的副干酪乳杆菌M-1菌液，于37℃保温发酵5天。
(4)发酵结束后，过滤分离发酵液和发酵残渣，发酵残渣用清水漂洗数次，晒干，得甲壳素118g。
实施例4
本实施例利用副干酪乳杆菌M-1发酵蟹壳提取甲壳素，其具体步骤如下：
(1)取200g干蟹壳(梭子蟹的蟹壳，梭子蟹购自广州长湴市场，手工剥壳)，粉碎至粒径大小约为0.2～0.3cm，加1000mL水，加蛋白酶(3％(w/v)木瓜蛋白酶(13000IU/g，广州远天酶制剂公司))55℃水解5小时，过滤出水解液，清洗一次，保留沉淀。
(2)向沉淀中加水3300mL，于100℃煮沸5分钟灭菌；另取195g葡萄糖加水400mL水溶解，按上述条件单独灭菌，冷却后倒入灭菌后的水解蟹壳中。
(3)接种50mL生长至对数期的副干酪乳杆菌M-1菌液，于37℃保温发酵7天。
(4)发酵结束后过滤出残渣，用清水漂洗数次，晒干，得甲壳素31.7g。
实施例5
本实施例利用副干酪乳杆菌M-1发酵黑水虻壳提取甲壳素，其具体步骤如下：
(1)取200g黑水虻壳，粉碎至粒径大小约为0.2～0.3cm，加1000mL水，加蛋白酶(3％(w/v)木瓜蛋白酶(13000IU/g，广州远天酶制剂公司))，55℃保温5小时，过滤出水解液，清洗一次，保留沉淀。
(2)向沉淀中加水4500mL，于100℃煮沸5分钟灭菌；另取180g葡萄糖加水450mL水溶解，按上述条件单独灭菌，冷却后倒入灭菌后的水解蟹壳中。
(3)接种50mL生长至对数期的副干酪乳杆菌M-1菌液，于37℃保温发酵7天。
(4)发酵结束后过滤出残渣，用清水漂洗数次，晒干，得甲壳素68g。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一株副干酪乳杆菌，其特征在于：名称为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)M-1，保藏编号为CCTCC NO：M 20221886，该菌株于2022年12月6日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。
2.一种培养权利要求1所述副干酪乳杆菌的方法，其特征在于，具体步骤为：将副干酪乳杆菌接种于培养基中，于10℃～45℃条件下进行培养。
3.权利要求1所述的副干酪乳杆菌在发酵甲壳动物和/或昆虫外壳提取甲壳素中的应用。
4.一种利用权利要求1所述副干酪乳杆菌发酵甲壳动物和/或昆虫外壳提取甲壳素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取甲壳动物和/或昆虫外壳原料，加水混匀后再加入蛋白酶或利用原料自身的内源蛋白酶进行水解，待水解结束后固液分离，并用水清洗沉淀，得到水解后的固体沉淀；
(2)向水解后的固体沉淀中加入水和碳源，并灭菌，冷却后接种权利要求1所述的副干酪乳杆菌，于10～45℃条件下进行发酵，待发酵结束后固液分离发酵液和残渣，并用清水清洗残渣，干燥，得到甲壳素。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的碳源为葡萄糖、蔗糖、淀粉糖浆、糖蜜、乳糖和麦芽糖中的一种或多种。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的水的用量为原料中干物质质量的5倍以上；
步骤(2)中所述的碳源的添加量为固体沉淀物中矿物质质量的200％以上；
步骤(2)中所述的水的用量为固体沉淀中干物质质量的10倍以上。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的水的用量为原料中干物质质量的7～10倍；
步骤(2)中所述的碳源的添加量为固体沉淀物中矿物质质量的300％～500％；
步骤(2)中所述的水的用量为固体沉淀中干物质质量的20～40倍。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的发酵的温度为15～45℃；
步骤(2)中所述的发酵的时间为24h以上。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的甲壳动物包括虾、蟹和龙虾中的至少一种；
步骤(1)中所述的昆虫包括黑水虻、蚕蛹和黄粉虫中的至少一种。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的副干酪乳杆菌的接种量为发酵体系总体积的0.1％～10％。
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