CN115927508A - 昆布多糖降解酶OUC-ScLam39在制备昆布寡糖中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了昆布多糖降解酶OUC‑ScLam39在降解昆布多糖/制备昆布寡糖中的应用，所述昆布多糖降解酶OUC‑ScLam39的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述昆布寡糖为昆布五糖。本发明还公开了一种制备昆布寡糖的方法。本发明利用昆布多糖降解酶OUC‑ScLam39降解昆布多糖，可以得到具有特定聚合度的昆布寡糖——昆布五糖，对于后续的工业化应用以及研究特定聚合度寡糖的活性具有重要的意义。本发明的昆布多糖降解酶OUC‑ScLam39具有较高的活性和稳定性，且效率高、纯度高、产量高，具有实现工业化利用的潜力。
Description
技术领域
本发明涉及昆布多糖降解酶OUC-ScLam39在制备昆布寡糖中的应用，以及一种制备昆布寡糖的方法，属于功能酶技术领域。
背景技术
褐藻是重要的海洋藻类之一，在世界海洋中广泛分布，种类繁多。昆布多糖（Laminarin，又称laminaran）是从褐藻中提取的一种重要的海藻多糖，其含量与褐藻种类、生长季节和采收时间有关。昆布多糖主要由大约25个葡萄糖残基组成，这些残基通过β-1,3-糖苷键连接，还有部分分支的β-1,6-糖苷键连接。昆布寡糖（LOSs）是昆布多糖降解的产物，研究表明，具有低分子量和较高生物利用度的昆布寡糖比昆布多糖具有更广泛的生物学功能，包括抗氧化、抗凝血、抗癌、抗糖尿病、调节肠道菌群等。昆布寡糖的生物学功能与其聚合度息息相关，不同聚合度的昆布寡糖的功能差异是研究热点之一。
目前制备昆布寡糖的方法主要是利用昆布多糖酶酶解昆布多糖以获得昆布寡糖，但现有技术中的昆布多糖酶酶解昆布多糖后得到的是多种聚合度的昆布寡糖，无法得到具有特定聚合度的昆布寡糖，比如：中国发明专利CN 111334488 A公开了昆布多糖酶OUC-L1，其水解昆布多糖所得到的主要产物为三部分寡糖；中国发明专利CN 114196655 A公开了耐热性昆布多糖降解酶OUC-SaLam66，其水解昆布多糖所得到的昆布寡糖的聚合度为2～6。因此，挖掘能特异性制备特定聚合度昆布寡糖的生物技术工具具有重要意义。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种可降解昆布多糖制备特定聚合度昆布寡糖的昆布多糖酶——昆布多糖降解酶OUC-ScLam39，本发明还提供了该酶制备昆布寡糖中的应用，以及一种制备昆布寡糖的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
昆布多糖降解酶OUC-ScLam39，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述昆布多糖降解酶OUC-ScLam39在降解昆布多糖/制备昆布寡糖中的应用。
进一步地，所述昆布寡糖为昆布五糖。
一种制备昆布寡糖的方法：利用昆布多糖降解酶OUC-ScLam39降解昆布多糖，制备得到昆布寡糖。
进一步地，所述昆布寡糖为昆布五糖。
进一步地，所述制备昆布寡糖的方法为：将昆布多糖降解酶OUC-ScLam39加入到昆布多糖溶液中，在25～60℃、pH 3.0～10.0条件下降解得到降解产物，即为昆布寡糖。
进一步地，所述昆布多糖溶液中昆布多糖的浓度为0.2%～10%（质量体积比，单位g/ml），优选0.2%～0.4%或0.5%～2%，更优选0.2%或1.0%。
进一步地，所述降解的温度为25～45℃，优选35℃。
进一步地，所述降解的pH值为5.0～7.0，更优选6.0。
进一步地，所述降解的时间为10分钟～72小时，优选30分钟～24小时，更优选12小时。
进一步地，所述昆布多糖降解酶OUC-ScLam39以酶液的形式加入到昆布多糖溶液中，酶液中昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的浓度为0.1～1.0 mg/mL，优选0.24 mg/mL；酶液与昆布多糖溶液的体积比为1:1～10，优选1:4。
进一步地，所述制备昆布寡糖的方法具体为：将含有昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的酶液加入到昆布多糖溶液中，在35℃条件下降解12小时，得到降解产物昆布五糖；所述酶液中昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的浓度为0.24 mg/mL；所述昆布多糖溶液中昆布多糖的浓度为0.2%或1.0%；所述酶液与昆布多糖溶液的体积比为1:4；所述昆布多糖溶液是向pH6.0的磷酸盐缓冲液中加入昆布多糖配制而成的。
本发明利用昆布多糖降解酶OUC-ScLam39降解昆布多糖，可以得到具有特定聚合度的昆布寡糖——昆布五糖，对于后续的工业化应用以及研究特定聚合度寡糖的活性具有重要的意义。
本发明的昆布多糖降解酶OUC-ScLam39来源于天蓝色链霉菌
Streptomyces
coelicolor A3(2)，经鉴定属于糖苷水解酶GH64家族。本发明构建了含昆布多糖酶基因的重组载体，实现了在大肠杆菌中的异源表达，同时为该酶的工业化生产和应用提供了良好的基础。该酶在35℃和pH 6.0条件下具有较高的催化活性，经过镍柱纯化后的比酶活可达3.64 U/mg。该酶能够高效水解昆布多糖，水解产物为昆布五糖。本发明的昆布多糖降解酶OUC-ScLam39，具有较高的活性和稳定性（在25～45℃下放置36小时，酶活仍可保留50%以上；在pH 5.0～7.0的缓冲液中保留36小时，酶活也能保留50%以上），且效率高、纯度高、产量高，制备的昆布寡糖（昆布五糖）可用于免疫调节、抗氧化、抗糖尿病等方面的研究，具有实现工业化利用的潜力。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
附图说明
图1：昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的SDS-PAGE电泳图，其中，M为标准蛋白Marker；1为粗酶蛋白；2为纯化后的昆布多糖酶蛋白。
图2：温度和pH变化对相对酶活的影响示意图，其中，a：温度对相对酶活的影响；b：在不同温度下放置72 h对相对酶活的影响；c：pH对相对酶活的影响；d：在不同pH下放置72h对相对酶活的影响。
图3：金属离子和化学试剂对相对酶活的影响示意图。
图4：底物特异性对相对酶活的影响示意图。
图5：昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的酶解产物的TLC图。
图6：昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的酶解产物的质谱图。
图7：昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的酶解产物分离纯化后的TLC图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法。
实施例1 昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的编码基因的获得
本发明的昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的编码基因，来源于天蓝色链霉菌
Streptomyces coelicolor A3(2)（购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号4.7168），序列号为CAC16439.1。该基因片段包含了1197个碱基，如SEQ ID NO.2所示，编码398个氨基酸，如SEQ ID NO.1所示。根据序列比对和进化树分析，其与来自
Streptomyces matensis的β-1,3-glucanase同源性最高，预测蛋白序列相似值为76.31%，该昆布多糖酶OUC-ScLam39属于糖苷水解酶第64家族（GH64）。本发明首次将该酶表达、纯化并进行制备相关研究。
昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的氨基酸序列（SEQ ID NO.1）：
MLSRLRHRLLAVAAAAGLTGALLSFGAAPPADAAVPATIPLKITNNSARGDAVHIYNLGTSLTTGQQGWADENGTFHAWPAGGNPPTPAPDASIPGPAAGQTKTIRIPKLSGRIYFSYGQKLDFRLTTGGLVQPAVQNPSDPNRNILFNWSEYTLNDGGLWLNSTQVDMFSAPYTVGVQRADGGVTSAGQLKAGGYRGVFDALRAQPGWGGLIQTRPDGTVLRALAPLYGVETGALPASVMDDYINRVWQKYTTTTLTVTPFGDRPDTKYFGRVSGNVMNFTNTSGAVVTSFQKPDASSVFGCHRLLDAPNDQVRGPISRTLCAGFNRSTLLSNPNQPDPSAANFYRDPVTNHYARIIHERMADGKAYAFAFDDVGNHESLVHDGNPAEARLTLAPLD。
昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的编码基因的核苷酸序列（SEQ ID NO.2）：
5’-GTGCTCTCCCGACTCAGACACCGTCTGCTCGCCGTGGCCGCGGCCGCAGGCCTGACCGGCGCCCTGCTCTCGTTCGGCGCCGCACCGCCCGCGGACGCCGCGGTGCCCGCCACCATCCCCCTGAAGATCACCAACAACTCCGCTCGTGGCGACGCCGTCCACATCTACAACCTGGGCACCTCGCTGACGACCGGTCAGCAGGGCTGGGCGGACGAGAACGGAACCTTCCACGCCTGGCCCGCCGGCGGCAATCCCCCCACTCCCGCACCGGACGCGTCCATCCCTGGACCGGCCGCGGGACAGACCAAGACCATCCGGATCCCGAAGCTGTCGGGACGCATCTACTTCTCCTACGGCCAGAAGCTGGACTTCCGGCTCACCACCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGCCGTGCAGAACCCCAGCGACCCCAACCGCAACATCCTCTTCAACTGGTCCGAGTACACGCTCAACGACGGCGGGCTGTGGCTGAACAGCACCCAGGTCGACATGTTCTCCGCGCCCTACACGGTCGGCGTGCAGCGCGCCGACGGCGGCGTGACCAGCGCCGGACAGCTCAAGGCCGGTGGCTACCGCGGGGTGTTCGACGCGCTGCGGGCCCAGCCGGGCTGGGGCGGGCTGATCCAGACCCGGCCCGACGGCACCGTACTGCGGGCGCTGGCGCCGCTGTACGGGGTGGAGACCGGGGCGCTGCCCGCGTCGGTCATGGACGACTACATCAACCGGGTCTGGCAGAAGTACACGACGACCACGCTCACCGTCACGCCCTTCGGCGACCGTCCGGACACCAAGTACTTCGGACGCGTCTCGGGCAACGTCATGAACTTCACCAACACCTCCGGCGCGGTCGTCACCAGCTTCCAGAAGCCGGACGCCTCCAGCGTCTTCGGCTGCCACCGGCTCCTGGACGCGCCCAACGACCAGGTGCGCGGGCCGATCTCGCGCACGCTGTGCGCCGGCTTCAACCGCTCGACGCTGCTGAGCAACCCCAACCAGCCCGATCCCTCGGCGGCGAACTTCTACCGGGACCCGGTGACCAACCACTACGCCCGGATCATCCACGAGCGCATGGCCGACGGGAAGGCGTACGCGTTCGCCTTCGACGACGTCGGCAACCACGAGTCGCTGGTGCACGACGGCAACCCGGCCGAGGCGAGGCTCACGCTCGCCCCGCTCGACTGA-3’。
从
Streptomyces coelicolor A3(2)中提取得目的基因片段。对该基因片段进行PCR扩增，扩增所用特异性引物如下所示。
正向引物：5’-gatccgaattcgagctcgtgcccgccaccatccccctg- 3’，如SEQ ID NO.3所示。
反向引物：5’-gtggtggtgctcgaggtcgagcggggcgagcgtg- 3’，如SEQ ID NO.4所示。
PCR反应体系为：2×PCR Buffer 25μl，dNTPs 10μl，引物各1.5μl，模板1μl，KODFx酶1μl，无菌水8μl，PCR Enhancer 2μl，总体系50 μl。
PCR反应条件为：95℃预变性5 min，98℃变性20 s，65℃退火30 s，72℃延伸90 s，反应30个循环，72℃后延伸10 min。
琼脂糖凝胶电泳后回收1197 bp的PCR产物片段。
实施例2 重组表达载体的构建
将实施例1中扩增后的基因片段与线性化的pET-28a克隆载体采用无缝克隆技术进行连接，将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含有50μg/m L卡那霉素的LB固体抗性平板上，37℃培养箱中培养16小时后，挑取单克隆至含有50μg/m L卡那霉素LB液体培养基中，在转速为220 rpm的37℃摇床培养12小时进行阳性克隆验证。将条带大小正确的单克隆送至测序公司测序。序列比对完全正确后将验证成功的重组质粒提取出来并命名为pET28a-OUC-ScLam39，将其保存在-20℃备用。
实施例3 重组工程菌的构建
将实施例2中抽提的携带昆布多糖降解酶OUC-ScLam39编码基因的重组表达载体pET28a-OUC-ScLam39转化至宿主大肠杆菌BL21感受态细胞中，构建好的工程菌在硫酸卡那霉素抗性平板上长出，得到重组表达菌株。将重组表达菌株于液体LB培养基（含50μg/m L卡那霉素）中培养12小时。保藏菌液于10%甘油溶液中，于-80℃保存备用。
实施例4 昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的制备
重组表达菌株在5 ml的LB液体培养基（含有50μg/m L卡那霉素）中活化12 h后，按1%的接种量接入含有硫酸卡那霉素（50μg/m L）的ZYP-5052培养基中，20℃、200 rpm低温培养48 h，自诱导表达昆布多糖降解酶OUC-ScLam39。
发酵结束后，菌液在4℃、8000 g条件下离心10分钟，收集菌体，重悬于50 mM的pH7.0的Tirs-HCl缓冲液中，并且用相同缓冲液进行三次置换，然后置于冰水浴中超声破碎30min（40%功率，3 s开，3 s关），然后在4℃、8000 g条件下再次离心10分钟，收集上清液，即为粗酶液。
所表达的目的基因含有6个His纯化标签，粗酶液使用Ni-NTA柱进行亲和层析纯化：首先使用平衡缓冲溶液（500 mM NaCl，50 mM Tris-HCl）平衡柱子，然后用20 mM咪唑溶液（20 mM咪唑，500 mM NaCl，50 mM Tris-HCl）洗脱结合力较差的杂蛋白，100 mM咪唑溶液（100 mM咪唑，500 mM NaCl，50 mM Tris-HCl）洗脱目的蛋白，收集此部分的缓冲液洗脱成分，得到纯化的重组昆布多糖降解酶溶液（蛋白含量为0.24 mg/mL），作为酶液用于下述实施例5。经SDS-PAGE检测蛋白纯度和分子量，验证条带是否单一，大小是否准确，结果如图1所示。结果显示重组蛋白分子量约为48 KDa，与预测结果保持一致，即获得了目的蛋白。
实施例5 昆布多糖降解酶OUC-ScLam39比酶活的测定
昆布多糖降解酶OUC-ScLam39活性的标准测定方法为：250μL的反应体系中包含50μL酶液、200μL pH 6.0的磷酸盐缓冲液配制的0.2%（m/v，g/ml）的昆布多糖溶液，在35℃下反应10 min，沸水浴10 min对酶灭活后12000 rpm离心1 min。取出180μL上清液，与270μL的DNS试剂混合，并在沸水浴中煮沸5 min进行显色。12000 rpm离心1 min，在540 nm处测定吸光值。
酶活力定义为：在标准条件下每min产生1μM还原糖所需要的酶量。
经测定，纯化后的昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的纯酶活力可达3.64 U/mg。相比而言，来自产酶溶杆菌
Lysobacter enzymogenes Strain N4-7的昆布多糖酶GluB的酶活为3.2 U/mg，来自香菇子实体
Lentinula edodes的内切型昆布多糖酶GLU1的酶活为1.85 U/mg。此外，有关来源于GH64家族的昆布多糖酶的报道较少，酶活的信息鲜有报道。本发明的昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的酶活明显更高。在同等的酶解效率下，本发明的酶解速度更快，所需时间更短。
实施例6 昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的最适反应条件和稳定性的测定
将实施例4中得到的纯化昆布多糖降解酶在不同温度和pH下反应，测定温度和pH对酶活力的影响。
选取25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃的温度，按照实施例5的测定方法测定酶活，测定最适温度。
在35℃条件下，选用pH为3.0～10.0的缓冲液作为酶反应的不同测定pH缓冲液，按照实施例5的测定方法测定酶活，测定最适pH。
酶液在25℃～45℃的温度下进行孵育（孵育时间分别为：0、1、2、4、8、12、24、36、48、72小时），在最适条件35℃、pH 6.0下测定其残留酶活，测定其温度稳定性。
酶液分别与不同pH的缓冲液（pH 3.0～8.0）混合，于4℃中孵育（孵育时间分别为：0、12、24、36、48、72小时），在35℃条件下测定其残留酶活，测定其pH稳定性。
以最高酶活力为100%，计算在不同条件下的相对酶活力，结果如图2所示，昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的最适反应温度为35℃，最适pH为6.0。在25～45℃孵育不同时间，酶活均比较高，在25℃～45℃下放置36小时，酶活仍可保留50%以上，酶的温度稳定性较好。在pH 5.0～7.0的缓冲液中保留36小时，酶活也能保留50%以上，酶的pH稳定性较好。
实施例7 金属离子和化学试剂对酶活性的影响
将不同的金属离子（均以盐酸盐的形式加入）及化学试剂SDS和Na2EDTA分别加入酶液中，使其终体系的浓度分别为1 mM和10 mM，在25℃条件下放置1小时。然后分别加入pH6.0的磷酸盐缓冲液配制的0.2%（m/v，g/ml）的昆布多糖溶液，按照实施例5的测定方法测定酶活，结果如图3所示，Mn2+以及大部分的试剂对酶活有一定的促进作用，但是高浓度的Fe3+和Cu2+均抑制酶的活性，两种化学试剂同样会抑制酶的活性。
实施例8 昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的底物选择性研究
分别用pH 6.0的磷酸盐缓冲液配制0.2%（w/v，g/ml）的昆布多糖溶液、茯苓多糖溶液、酵母β-葡聚糖溶液、凝胶多糖溶液和琼脂糖溶液。取不同的底物溶液各200 μL，加入50μL的酶液，混合均匀，按照实施例5的测定方法测定酶活，结果如图4所示，昆布多糖降解酶OUC-ScLam26对凝胶多糖的催化活性最强，其次是昆布多糖，酵母β-葡聚糖，对茯苓多糖和琼脂糖没有活性。
实施例9 TLC法鉴定昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的降解产物
将50μL酶液与200μL昆布多糖溶液（pH 6.0的磷酸盐缓冲液配制的，昆布多糖的浓度为1.0%，g/ml）混合混匀，在35℃下反应不同时间（1～24小时）。然后通过薄层色谱层析法（TLC）检测产物，具体方法如下：展开剂（正丁醇:乙酸:水=3:2:2），显色剂为0.2%（w/v）3,5-二羟基甲苯，溶于10%（v/v）H2SO4乙醇溶液中，于90℃条件下显色。以葡萄糖为参照对降解产物进行TLC分析，结果如图5所示，昆布多糖酶OUC-ScLam39的酶解产物为昆布五糖。
实施例10 昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的降解产物的聚合度组成
将50μL酶液与200μL昆布多糖溶液（pH 6.0的磷酸盐缓冲液配制的，昆布多糖的浓度为1.0%，g/ml）混合混匀，在35℃下反应12小时。然后通过ESI-MS检测产物，结果如图6所示，结果表明产物中含有的昆布寡糖为昆布五糖。
实施例11 昆布寡糖的制备
将50μL酶液与200μL昆布多糖溶液（pH 6.0的磷酸盐缓冲液配制的，昆布多糖的浓度为1.0%，g/ml）混合混匀，在35℃下反应12小时。采用聚丙烯酰胺凝胶柱层析进行分离纯化，流动相为超纯水，然后通过TLC检测产物。结果如图7所示，结果表明酶解产物有昆布五糖，成功制备出了单一的昆布五糖，实现了昆布五糖的分离制备。分离纯化后，冻干得昆布五糖，保存。
实施例12 酶制剂的制备
实施例4的酶液，用pH 7.0 Tris-HCl 缓冲液置换咪唑，冻干，得纯酶粉，保存。
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。
Claims (10)
1.昆布多糖降解酶OUC-ScLam39在降解昆布多糖/制备昆布寡糖中的应用，所述昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述昆布寡糖为昆布五糖。
3.一种制备昆布寡糖的方法，其特征在于：利用昆布多糖降解酶OUC-ScLam39降解昆布多糖，制备得到昆布寡糖。
4.根据权利要求3所述的制备昆布寡糖的方法，其特征在于：所述昆布寡糖为昆布五糖。
5.根据权利要求3或4所述的制备昆布寡糖的方法，其特征在于：将昆布多糖降解酶OUC-ScLam39加入到昆布多糖溶液中，在25～60℃、pH 3.0～10.0条件下降解得到降解产物，即为昆布寡糖。
6.根据权利要求5所述的制备昆布寡糖的方法，其特征在于：所述昆布多糖溶液中昆布多糖的浓度为0.2%～10%。
7.根据权利要求5所述的制备昆布寡糖的方法，其特征在于：所述降解的温度为25～45℃；所述降解的pH值为5.0～7.0；所述降解的时间为10分钟～72小时。
8.根据权利要求5所述的制备昆布寡糖的方法，其特征在于：所述昆布多糖降解酶OUC-ScLam39以酶液的形式加入到昆布多糖溶液中，酶液中昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的浓度为0.1～1.0 mg/mL；酶液与昆布多糖溶液的体积比为1:1～10。
9.根据权利要求6～8所述的制备昆布寡糖的方法，其特征在于：所述昆布多糖溶液中昆布多糖的浓度为0.2%～0.4%或0.5%～2%或0.2%或1.0%；
或：所述降解的温度为25～45℃或35℃；
或：所述降解的pH值为5.0～7.0或6.0；
或：所述降解的时间为30分钟～24小时或12小时；
或：所述酶液中昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的浓度为0.24 mg/mL；酶液与昆布多糖溶液的体积比为1:4。
10.根据权利要求3～9中任一项所述的制备昆布寡糖的方法，其特征在于：将含有昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的酶液加入到昆布多糖溶液中，在35℃条件下降解12小时，得到降解产物昆布五糖；所述酶液中昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的浓度为0.24 mg/mL；所述昆布多糖溶液中昆布多糖的浓度为0.2%或1.0%；所述酶液与昆布多糖溶液的体积比为1:4；所述昆布多糖溶液是向pH 6.0的磷酸盐缓冲液中加入昆布多糖配制而成的。
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