CN116024198B - λ-卡拉胶酶CglA-FFWV33在制备λ-卡拉胶寡糖中的应用 - Google Patents
λ-卡拉胶酶CglA-FFWV33在制备λ-卡拉胶寡糖中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了λ‑卡拉胶酶CglA‑FFWV33在降解卡拉胶或制备λ‑卡拉胶寡糖中的应用，属于功能酶技术领域。所述λ‑卡拉胶酶CglA‑FFWV33的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还公开了降解卡拉胶或制备λ‑卡拉胶寡糖的方法。本发明的λ‑卡拉胶酶CglA‑FFWV33可特异性降解λ‑卡拉胶，特异性强，具有极高的酶活，在30℃、pH 8.0的条件下比酶活高达987.7 U/mg，可高效制备λ‑卡拉胶寡糖。本发明的λ‑卡拉胶酶CglA‑FFWV33在酶法制备λ‑卡拉胶寡糖中具有重要的工业应用价值以及经济价值。
Description
技术领域
本发明涉及λ-卡拉胶酶CglA-FFWV33在制备λ-卡拉胶寡糖中的应用，属于功能酶技术领域。
背景技术
卡拉胶（Carrageenan）是自红藻中提取的一种酸性多糖，具有重复的α-1，4-D-半乳吡喃糖和β-1，3-D-半乳吡喃糖（或3，6-内醚-D-半乳吡喃糖）二糖单元骨架结构。卡拉胶寡糖是卡拉胶的降解产物，根据硫酸盐的结合形式不同，卡拉胶寡糖可分为十种不同的理想化重复双糖，它们是α-、β-、λ-、δ-、κ-、μ-、θ-、δ-、I-,ⅴ-卡拉胶寡糖，它们的区别主要在于它们的硫酸化程度和是否存在3，6-脱水半乳糖残基。
λ-卡拉胶寡糖具备抗凝、抗血栓、抗炎、抗病毒、抗肿瘤等多种功效。近年来经研究证实，λ-卡拉胶寡糖在生物体抗氧化、自由基的清除方面也发挥着重要的作用。因此如何高效制备λ-卡拉胶寡糖日益成为人们研究的热点问题。
制备λ-卡拉胶寡糖的方法包括物理法、化学法和酶解法，其中，物理法主要是指超声、微波等物理学手段降解λ-卡拉胶的方法；化学法主要包括酸水解和氧化法降解；目前最为常见的降解方法是酸水解与酶水解，酶解法相比于酸解法具有反应温和、产物单一、易于分离等优点，但λ-卡拉胶酶在文献中记载的并不多。因此，发掘新的λ-卡拉胶酶并构建新的工程菌具有重大意义。
发明内容
针对上述现有技术，本发明通过挖掘，发现了一种可以降解卡拉胶并产生λ-卡拉胶寡糖的新型降解酶——λ-卡拉胶酶CglA-FFWV33。
本发明是通过以下技术方案实现的：
λ-卡拉胶酶CglA-FFWV33，其氨基酸序列如下所示，如SEQ ID NO.1所示。
λ-卡拉胶酶CglA-FFWV33的氨基酸序列（SEQ ID NO.1）（下划线所示为信号肽）：
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所述λ-卡拉胶酶CglA-FFWV33的编码基因，其核苷酸序列如下所示，如SEQ IDNO.2所示。
λ-卡拉胶酶CglA-FFWV33的编码基因的核苷酸序列（SEQ ID NO.2）（方向5’-3’）：
CTATAAATTATCTTCTAACTCAATATCGATAAAACGAAATCCTCCCAATGGAATGTCAATTTCAACTGTAGAATTTGCAGTTCCTTTAAACTCTTCATTATTCAAAATATCTTTCATCTTCTTCACTTTGATATTATTGATTTTCACAATTGCTTTGGCATTATTTGGATTGATATATCCATTTTCAACCAATGTTAAACGCAATTGTTTTGGACCAACTTGTGCTACAACCCAACCTACATTTCCAGAAACCGTAATCGGAATCAAGGCAGCACTTTTCTTAATATCGTCTTCAATCACTTTGTAATACTCATTTGGCGCATAAGTCGTTTTTCCGTCAGCAGAAAAATAGTTTTTACCATCCGAATAATATTCTTTAGTGATGTTTTTGTACCAAGGATGAATATTATCGACCAATGGTTTTCTAAAAGCGGTTTTATCTGCAAAAACACCAAATTGTGGTGGCGTAATCAAAACCATCCCGTTACTGTATTTCGGAATAAAATTCAATCTTCTTTCGGTTGCACCGGCAGCATATCTAGAAAAATCCCATTCAGTTAACGGCGCTCCTGGCCATGTTCCGTTTAATCGACTGAAAGCAAAAGGTTCCTTGTCTTTTTTGTCTTTATCAAAAAACGTTAACCACTTTACATTACTGGCATCGTTTAGATAGTCTTCATTTGGATTAGCAATGCTTAAATGTACCGGTGAAAAACTTAAAATATCAGCACGGTTTGGCACATAAATAGCGCCTTCGGCTATTAGATCCCATAGCAAACTCATGTATTCCTGATCTACAGGGAAATTATCAATATACTGTGCTCCACTAGCAATAGAATACACCATTGTTCGTAGAAAATGGTTCGGTAAGGTTTGGTTCGAATGCTGACGCAAACGATCAAAACTAGTATTGTCTCTAGCGCAACGTGCTCCAAAACTATCTACTGAACCAGCTGCCCAAAGTCCTAATCGAGCAGTAAAACTCAGTTCCATAGATTTATCGGTGGTTTCTTCCATGGCAGGTACAAATACACTGGCGTATTTTCCAGAAACCAATGGTTTCCATTTGTCCATATACACGCTCGACTGCCAAAACAAATGCTTGTTACGCAAGTACAAACTACCATTTTTGGTTTTTGCATATTCTGCCAAGGGCAACATTAAGTCGTTCATCACAAAATTAAAGGCCTCCGAATGGTCTTCGACCTCAGGATAGATGATTACCGTTTTATTTCCGTTCGCTAAATCCAATCCTTTTTTGGTTGTTTCTACTTGGTACATATAAGGATCGTTACCATGTCCTCCCCAATAAGAAATTCCTTTTCCGTTGGATTCTTTATGTTTTTTAGCAAGGATATCTAAGACTTGTTCTTGTGATAATACGTATTTCATTCTGCCATCGCGTTTGTTTTTGTACACTTCGCTGGGCATGGCAGAACGGTCCCAATTTTCCTTATCAAAACTACCTCCGTTTAAGAAAACAGGATTTTTATACTTAGCCTCAATTCGGTCTATTGCTTCAGCAGCACCGTCTTTTTTTCGACTTTCGGACATAAAATAAACCGTCGCCGATTCTTTTTGGTAAGAAGGTTTTTCAAACTTCTTTAAATTGTCTTTTATGTTTTTTGTATTTGCAAGTATGTCTTGTATTTTTCCTGGAGGCATTAAGTTTTCAAAATCTTTTCTCCATTTTTTATCATCAAAATCAATAATATGAATGGCACTACCCCCACTTTGAGCACTTGCTAAAATAAGTTTATTCGAATTTGGATCCTTACACATATCATTGAAAGAAAATCTAGTTGGAACCACTTCTCCATCCGCATCTTTTTCACCGACATTGTTAATTATTATGTCACTCCCAAAAAGCGACACATAAGCACGTTTGCCATTATTATTGAACACCTCTGTTTGAATCACACGATACATCCCTCTACTGAGTGACGCCTTATTTTTTACATTTTTAAAATCAACCTGTGTCAATTTCTTAGGGTTTTCAATCTCAATTTTTATATAGCTCATTCCTTTTGCTTGTGCGCCGGTGCGTCCCATTAACACTTCACTTTTTCCGTCTAAATCTACATCGGTAATTTTTAAATCACCATAAGGACCATTCTTTTTTATGACTATTGTTTCATAAGGTAATTTGTCTAATGGGTTGAAAAAATAAACCGAACCATTACCACTCATACTGTTTTGAACTCCATGAACTACCACTATTTCTTTTCCGTTGGCTAGTTTTGCAGGTCTCAAAAAATTGGTAATGTGCAATCCGCTAGGTGGCAACTCCTTTGCCGCCTTGCTAGAAGCTTTTTCTACTGAATACGTTTTGGATGCTATTTCGCTTACCAACACTCCTTTTGGAGATACATAATAAAAACTATTGTCATAACCGCCACAGACCACATACGCCTTACCGTCTTTGTTAACCACACAAACTGAGTACATAGGTGCCTCATTTTGTTGGAACTTCCACAGTAATTTTCCTTTGCTATTCAAACAATAAACAGCACCATCTGCATTAGCAGCAAAAATTTCGTCAACGCCATCATTATCGATATCGCCAGTCCATAAATCATGGTTCATAAAACCAGACAAGGCATTTTTCCACAGAATTTTACCCTCATAGGAAACTCCCATAACTGTTCCTTCATAACTACTAGCAACAATAAATGATTCTTTTTTGTTGAGTGCCGTCCGTACTTTGGTGATGGTGTAACCAGTTTCTATGCTCAAAACTGCCTTGGGAGGAGCGGTAGAAACTTCTTTTGCGTTTAAGGAAGACCCTTGTAAAACCCCTACTAACACTAGTAAAAACAGACTGTAATTGATTTTCAT。
所述λ-卡拉胶酶CglA-FFWV33在降解卡拉胶或制备λ-卡拉胶寡糖中的应用。
一种降解卡拉胶或制备λ-卡拉胶寡糖的方法：采用上述λ-卡拉胶酶CglA-FFWV33降解卡拉胶，得到λ-卡拉胶寡糖，λ-卡拉胶寡糖的聚合度为2～8，主要为二糖、四糖、六糖。
进一步地，所述制备λ-卡拉胶寡糖的方法具体为：将λ-卡拉胶酶CglA-FFWV33加入到λ-卡拉胶溶液中，在25～35℃、pH 6.0～8.0条件下酶解0.5～10小时，得到λ-卡拉胶寡糖。
进一步地，所述λ-卡拉胶溶液的浓度为1～5 mg/mL，优选3 mg/mL。
进一步地，所述λ-卡拉胶酶CglA-FFWV33的加酶量为：每1 ml的λ-卡拉胶溶液加200～500 U的酶，优选300 U。
进一步地，所述降解的温度为30℃。
进一步地，所述降解的pH值为8.0。
进一步地，所述降解的时间为0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10小时。
一种酶制剂，包括上述λ-卡拉胶酶CglA-FFWV33。
所述酶制剂在降解卡拉胶/制备λ-卡拉胶寡糖中的应用。
本发明挖掘到了可以降解卡拉胶并产生λ-卡拉胶寡糖的新型降解酶——λ-卡拉胶酶CglA-FFWV33，首次构建重组表达载体，并表达、纯化得到了λ-卡拉胶酶CglA-FFWV33，经实验研究发现，该酶可特异性降解λ-卡拉胶并得到λ-卡拉胶寡糖，特异性强，具有极高的酶活，在30℃、pH 8.0的条件下比酶活高达987.7 U/mg，可高效制备λ-卡拉胶寡糖。
本发明的λ-卡拉胶酶CglA-FFWV33可作用低粘度的λ-卡拉胶底物，终产物λ-卡拉胶寡糖聚合度为2～8。本发明的λ-卡拉胶酶具有优良的酶学性质和特异性，在酶法制备λ-卡拉胶寡糖中具有重要的工业应用价值以及经济价值。目前还未有市售的λ-卡拉胶寡糖，发展潜力巨大。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
附图说明
图1：λ-卡拉胶酶的SDS-PAGE电泳图，其中，M为标准蛋白Marker；1为浓缩冻干后的λ-卡拉胶酶；2为用100 mM咪唑缓冲液洗脱后的酶液；3为用40 mM咪唑缓冲液洗脱后的酶液；4为粗酶蛋白。
图2：温度变化对相对酶活的影响示意图。
图3：pH变化对相对酶活的影响示意图。
图4：λ-卡拉胶酶的酶解产物的液相图。
图5：λ-卡拉胶酶的酶解产物的质谱图，其中a是LC-MS测定的总离子质谱图；b是图a中峰1的质谱图，c是图a中峰2的质谱图，d是图a中峰3的质谱图，e是图a中峰4的质谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法。
本发明所用的λ-卡拉胶（CAS RN：9064-57-7，产品编码：C2871），粘度为10 mPa·s(0.3%, H2O,25℃)，购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司。
实施例1 λ-卡拉胶酶CglA-FFWV33基因的克隆
为寻找λ-卡拉胶酶，本发明在Flavobacterium faecale WV33（粪便黄杆菌WV33）中挖掘到一个含有2838 bp的新基因（如SEQ ID NO.2所示），该基因编码的λ-卡拉胶酶是一种理论分子量为945个氨基酸残基的糖苷水解酶，其GenBank登录号为AWG23292.1，如SEQID NO.1所示。在去除23个氨基酸的信号肽后，由GIB（中国北京）用His标签在N末端合成编码基因，然后克隆到pET-28a（+）载体中。根据进化树比对，发现该λ-卡拉胶酶属于多糖水解酶第150家族（GH150），将其命名为λ-卡拉胶酶CglA-FFWV33。经对比，λ-卡拉胶酶CglA-FFWV33，与来自Maribacter vaceletii的λ-卡拉胶酶OUC CglA（WP_121067947.1）、来自Planctomycetes bacterium CA13的λ卡拉胶酶前体（TWT80797.1）、来自Rhodopirellulasp.SWK7的前-λ-卡拉胶酶CglA（WP_009093899.1）、来自Pontiella desulfatans CglA的λ卡拉胶酶（VGO17426.1）、来自Pontiella sulfatireligans的λ卡拉胶酶（VGO18532.1）、来自Pseudoalteromonascarrageenovora的前-λ-卡拉胶酶CglA （CAL37005.1）和来自Pseudoalteromonas sp. CL19的λ-卡拉胶酶CglA （BAF35571.1）的相似性分别为53.90%、51.27%、49.52%、49.95%、49.1%、48.10%和47.99%。
以合成的基因片段为模板，在λ-卡拉胶酶基因的上、下游设计用于无缝连接的引物，进行PCR扩增得到CglA-FFWV33基因片段。
扩增所用的特异性引物的核苷酸序列如下所示：
上游引物：5’-CATATGGCTAGCCTATAAATTATC-3’，如SEQ ID NO.3所示；
下游引物：5’-GCTCGAGTAAAGAAGTTTCTACC-3’，如SEQ ID NO.4所示。
PCR反应体系为：2×PCR Buffer 25μl，dNTP 10μl，引物各1.5μl，模板1μl，KOD Fx酶1μl，无菌水10μl，总体系50μl。
PCR的反应条件为：94℃预变性5 min，95℃变性20 s，60℃退火30 s，72℃延伸60s，反应30个循环，72℃后延伸10 min。
琼脂糖凝胶电泳后回收2769 Kb的PCR产物片段。
实施例2 含λ-卡拉胶酶编码基因的表达载体的构建
基因片段与pET-28a克隆载体采用无缝克隆技术进行连接，将连接产物转入E.coli DH5α感受态细胞，涂布于LB培养基固体平板（含有50 μg/m L卡那霉素）上，37℃温箱中培养16小时后，挑取单克隆至含有50 μg/m L卡那霉素LB液体培养基中，在转速为220rpm的37℃摇床培养12小时。将单克隆进行阳性验证后测序，并命名为pET28a-CglA-FFWV33。质粒保存在-18℃，备用。
实施例3 重组工程菌的构建
将实施例2中抽提的质粒转化至宿主E.coli BL21感受态细胞中，构建好的工程菌在硫酸卡那霉素抗性平板上长出，得到重组表达菌株。
实施例4 λ-卡拉胶酶的制备
大肠杆菌重组表达菌株经在5 ml LB液体培养基（含有50 μg/mL卡那霉素）中活化后，按1%的接种量接入含有硫酸卡那霉素（100 mg/mL）的LB培养基中，37℃，200 rpm培养6h，菌液OD（600）值为0.6时，加入1%IPTG（100 mM/L），18℃低温诱导20 h，表达λ-卡拉胶酶。
发酵结束后，菌液8000 g离心10分钟收集菌体，细胞重悬于50 mM的pH=8.0的Tirs-HCl缓冲液中，然后于冰水浴中超声破碎30 min（200 W，3 s开，3 s关），然后8000 g再次离心15 min，收集上清液，即为粗酶液。基于His标签融合的蛋白，粗酶液使用Ni-NTA柱进行亲和层析纯化，使用低浓度的10 mM咪唑溶液（10 mM咪唑，300 mM NaCl，50 mM Tris-HCl）平衡柱子，然后分别用40 mM咪唑溶液（40 mM咪唑，300 mM NaCl，50 mM Tris-HCl）和100 mM咪唑溶液（100 mM咪唑，300 mM NaCl，50 mM Tris-HCl）洗脱目的蛋白，收集此部分的缓冲液洗脱成分，得到纯化的λ-卡拉胶酶溶液，100 mM咪唑缓冲液洗脱后的酶液的浓度为3 mg/mL，作为酶液用于下述各实施例的研究，浓缩冻干。经SDS-PAGE检测蛋白纯度和分子量（结果如图1所示），结果显示重组蛋白经亲和柱纯化可得电泳纯蛋白，分子量大小约为106 KDa。
实施例5 λ-卡拉胶酶比酶活的测定
λ-卡拉胶酶CglA-FFWV33活性的标准测定方法为：200微升的反应体系中，包含20μL酶液、180μL pH 8的磷酸盐缓冲液溶解的0.3%（质量体积比，单位g/ml）的λ-卡拉胶溶液，在30℃下反应0.5 h，反应样与300μL的DNS试剂混合，并在沸水浴中煮沸5 min进行显色，在540 nm处检测其吸光度。
酶活力定义为在标准条件下每min产生1μM还原糖所需要的酶量。经测定与计算，λ-卡拉胶酶的酶活力为987.7 U/mg，显著高于其他已报道的λ-卡拉胶酶（OUC-CglA、CglA和Cga-L50在其各自最适条件下的活性仅为418.7 U/mg、253 U/mg和105 U/mg）。
实施例6 λ-卡拉胶酶的最适反应条件的测定
将λ-卡拉胶酶在不同温度和pH下反应，测定温度和pH对酶活力的影响。
选取20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、60℃的温度，按照实施例5的测定方法测定最适温度。
在30℃条件下，选用pH为4.0～10.0的缓冲液（分别为pH值为4.0、5.0、6.0的50 mM醋酸钠缓冲液，pH值为6.0、7.0、8.0的50 mM磷酸盐缓冲液和pH值为8.0、9.0、10.0的50 mMTris-HCl缓冲液）作为酶反应的不同测定pH缓冲液，按照实施例5的测定方法测定最适pH。
以最高酶活力为100%，计算在不同条件下的相对酶活力，结果如图2、图3所示，λ-卡拉胶酶的最适反应温度为30℃，最适pH为8。
实施例7 λ-卡拉胶酶的降解产物的测定
将实施例4中的20μL酶液加入到180μL 0.3%的λ-卡拉胶溶液中，在30℃下反应12h，通过高效液相色谱检测产物。结果如图4所示，结果表明产物中明显含有二糖、四糖与六糖。
实施例8 定义λ-卡拉胶酶的降解产物的聚合度组成
将实施例4中的20μL酶液加入到180μL 0.3%的λ-卡拉胶溶液中，在30℃下反应至完全转化，然后通过ESI-MS检测产物。结果如图5所示，结果表明产物中含有的λ-卡拉胶寡糖有二糖、四糖、六糖。
实施例9 酶制剂的制备
实施例4的酶液，用pH 7.0 Tris-HCl 缓冲液置换咪唑，冻干，得纯酶粉，保存。
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。
Claims (8)
1.λ-卡拉胶酶CglA-FFWV33在降解卡拉胶或制备λ-卡拉胶寡糖中的应用，所述λ-卡拉胶酶CglA-FFWV33的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种降解卡拉胶或制备λ-卡拉胶寡糖的方法，其特征在于：采用λ-卡拉胶酶CglA-FFWV33降解卡拉胶，得到λ-卡拉胶寡糖，所述λ-卡拉胶酶CglA-FFWV33的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
3.根据权利要求2所述的降解卡拉胶或制备λ-卡拉胶寡糖的方法，其特征在于：所述λ-卡拉胶寡糖的聚合度为2～8。
4.根据权利要求2所述的降解卡拉胶或制备λ-卡拉胶寡糖的方法，其特征在于，所述制备λ-卡拉胶寡糖的方法具体为：将λ-卡拉胶酶CglA-FFWV33加入到λ-卡拉胶溶液中，在25～35℃、pH 6.0～8.0条件下酶解0.5～10小时，得到λ-卡拉胶寡糖。
5.根据权利要求4所述的降解卡拉胶或制备λ-卡拉胶寡糖的方法，其特征在于：所述λ-卡拉胶溶液的浓度为1～5 mg/mL。
6.根据权利要求5所述的降解卡拉胶或制备λ-卡拉胶寡糖的方法，其特征在于，所述λ-卡拉胶酶CglA-FFWV33的加酶量为：每1 ml的λ-卡拉胶溶液加200～500 U的酶。
7.根据权利要求4所述的降解卡拉胶或制备λ-卡拉胶寡糖的方法，其特征在于：所述降解的温度为30℃。
8.根据权利要求4所述的降解卡拉胶或制备λ-卡拉胶寡糖的方法，其特征在于：所述降解的pH值为8.0。
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