CN115927498A - 一种提高l-异亮氨酸发酵产酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于氨基酸生产技术领域，公开了一种提高L‑异亮氨酸发酵产酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将黄色短杆菌种子液以5‑10%接种量接种到发酵培养基中，控制发酵温度27‑32℃，发酵至64h停止，得到L‑异亮氨酸发酵液。本发明提高了L‑异亮氨酸发酵产率，降低了发酵成本。
Description
技术领域
本发明属于氨基酸发酵领域，具体涉及一种提高L-异亮氨酸发酵产酸的方法。
背景技术
异亮氨酸（Isoleucine，Ile），又称“异白氨酸”，系统命名为“α-氨基-β-甲基戊酸”，化学式C6H13NO2，属脂肪族中性氨基酸的一种。是人与动物自身不能合成而必须依赖外源供给的八种必须氨基酸之一，具有多种生理功能，被广泛应用于医药、食品、饲料和化妆品等领域。特别是在医药领域，异亮氨酸可用于与其他必需氨基酸配制成复合氨基酸输液，尤其是高支链氨基酸输液及口服液，不仅可以提高人体免疫力，还能促进病人康复及手术后复原。此外，其还应用于血脑屏障、肝昏迷、慢性肝硬化及肾功能衰竭的治疗，先天性代谢缺陷病的膳食治疗，败血症及术后糖尿病患者的治疗，肿瘤患者的营养支持治疗等。
L-异亮氨酸生产方法主要有化学合成法、提取法和发酵法，其中，提取法和化学合成法由于存在原料来源受限制、生产成本高、污染环境等缺陷而难以实现工业化生产。微生物发酵法具有原料成本低、反应条件温和、容易实现大规模生产等优点。微生物发酵法生产L-异亮氨酸包括微生物转化和直接发酵两种方式，其中前者使用葡萄糖作为碳源，在添加特异性前体的基础上通过微生物作用将其转化为异亮氨酸，而后者是借助微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通过选育营养缺陷型突变株以解除代谢调节中的反馈抑制和反馈阻遏作用，从而达到积累异亮氨酸的目的。
随着对L-异亮氨酸发酵法的深入研究，微生物发酵法已成为生产L-异亮氨酸最主要的方法，发酵水平的高低是决定产品成本的主要因素。但是，现有的L-异亮氨酸发酵法仍存在产酸率低、糖酸转化率低的问题。因此，筛选一株适合工业化生产、性能稳定的优良高产菌株，同时匹配该菌株的最佳发酵工艺条件和控制手段是至关重要的。
中国专利CN112725391A，采用新疆阜丰生物科技有限公司菌种研究室保存的菌种作为出发菌株；将原始出发菌种通过活化、稀释，涂在适合细菌生长的培养基上；经分离后即为各种纯种菌株；采用亚硝基胍进行诱变处理，再进行筛选培养，获得一株能够高效利用甘油、L-异亮氨酸产率高的黄色短杆菌V1906-27，保藏号为CGMCC No.18060。需要进一步研究该菌株的产酸性能，以提高发酵产酸效率。优先权申请号2022105119774，申请日2022.05.12。
发明内容
本发明的目的是解决L-异亮氨酸发酵产酸低、生产成本高的问题，本发明提供一种提高L-异亮氨酸产酸的方法，通过优化发酵培养基组分，使L-异亮氨酸的产酸有较大提高，适合工业化生产。
本发明是通过如下技术方案来实现的。
一种提高L-异亮氨酸发酵产酸的方法，其包括如下步骤：
将黄色短杆菌CGMCC No.18060种子液接入到发酵培养基中，得到L-异亮氨酸发酵液；所述发酵培养基是在常规发酵培养基的基础上添加盐。
优选地，
所述盐为氯化钠。
优选地，
所述常规发酵培养基的组分为：
蔗糖19.8g/L，甘油20g/L，酵母粉4.8g/L，硫酸铵4.0g/L，磷酸二氢钾3.5g/L，磷酸氢二钾8.5g/L，硫酸镁4.8g/L，硫酸亚铁0.02g/L，硫酸锰12.9mg/L,硫酸锌0.27mg/L，硫酸铜0.48mg/L。
优选地，
所述氯化钠的添加量为：
1-8g/L。
具体地，
所述发酵培养基的组分为：蔗糖19.8g/L，甘油20g/L，酵母粉4.8g/L，硫酸铵4.0g/L，磷酸二氢钾3.5g/L，磷酸氢二钾8.5g/L，硫酸镁4.8g/L，硫酸亚铁0.02g/L，硫酸锰12.9mg/L,硫酸锌0.27mg/L，硫酸铜0.48mg/L，氯化钠1-8g/L。
进一步地，
所述方法包括如下步骤：
将黄色短杆菌CGMCC No.18060种子液接入到发酵培养基中进行发酵培养，得到L-异亮氨酸发酵液；发酵培养温度为30℃，发酵时间为64小时，风量为800m³/h，压力为0.05Mpa；当糖浓度降至1.0g/L时，通过流加糖维持罐内糖浓度为1.0g/L，直至发酵结束。
更进一步地，
所述发酵罐培养过程中，溶氧：前期（0-16小时）溶氧75%，后期（16小时至放罐前）溶氧35%；pH值：前期6.9，后期7.1。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本发明进行更加清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
一种提高L-异亮氨酸发酵产酸的方法，其包括：
将活化后的L-异亮氨酸生产菌种黄色短杆菌V1906-27（CGMCC No.18060）接种至种子培养基中，作为发酵种子液。将种子罐进行空消、实消、降温处理后接入种子液进行种子培养，培养温度为30℃，罐压0.08Mpa，风量为100m³/h，pH为6.9，控制最终密度为OD600=8。每4小时测定菌体光密度、pH镜检菌体变化情况；种子培养基：蔗糖10g/L，甘油20g/L，酵母膏5g/L，硫酸镁0.8g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸亚铁10mg/L，硫酸锰10mg/L，VH 0.2mg/L；种子罐空消：压力0.15Mpa，时间：60min，温度：128℃；实消：温度125℃，时间：大于30min。
步骤2）发酵培养：将上述种子液以10%的接种量接入发酵培养基中，培养温度为30℃，风量为800m³/h，压力为0.05Mpa，pH为6.9。当糖浓度降至1.0g/L时，通过流加糖维持罐内糖浓度为1.0g/L，直至发酵结束，总发酵时间为64小时，得到L-异亮氨酸发酵液；发酵培养基：蔗糖19.8g/L，甘油20g/L，酵母粉4.8g/L，硫酸铵4.0g/L，磷酸二氢钾3.5g/L，磷酸氢二钾8.5g/L，硫酸镁4.8g/L，硫酸亚铁0.02g/L，硫酸锰12.9mg/L,硫酸锌0.27mg/L，硫酸铜0.48mg/L；发酵罐培养过程中，溶氧：前期（0-16小时）溶氧75%，后期（16至放罐前）溶氧35%；pH值：前期6.9，后期7.1。产酸43.8g/L，糖酸转化率20.1%。
实施例2
盐胁迫对黄色短杆菌V1906-27发酵产酸的影响。
在发酵培养基中设置不同的氯化钠浓度，分别为0,1,2,4,8,16,32单位为g/L，其余同实施例1。具体产酸和糖酸转化率指标见表1：
表1
| 氯化钠浓度 g/L | 产酸g/L | 糖酸转化率% |
| 0 | 43.8 | 20.1 |
| 1 | 44.6 | 20.7 |
| 2 | 46.5 | 21.6 |
| 4 | 47.8 | 22.7 |
| 8 | 48.2 | 22.9 |
| 16 | 45.1 | 21.0 |
| 32 | 42.7 | 19.4 |
随着盐浓度的增加，异亮氨酸产量和糖酸转化率均稳步提升，当增加到16g/L后，糖酸转化率有所下降，异亮氨酸产量也随之下降。可能是低浓度盐胁迫能够激活黄色短杆菌V1906-27中与异亮氨酸合成相关的酶，使得异亮氨酸合成效率提高；高浓度的盐对菌株增殖会有一定的抑制作用，从而导致产酸效率下降。在其他产异亮氨酸的菌株中并未发现该现象。
实施例3
乙醇胁迫对黄色短杆菌V1906-27发酵产酸的影响。
低浓度的乙醇（20ml/L）对黄色短杆菌V1906-27发酵异亮氨酸产量和糖酸转化率没有明显影响，高浓度的乙醇（＞50ml/L）对黄色短杆菌V1906-27发酵异亮氨酸产量和糖酸转化率有一定的抑制作用。
上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了介绍，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，这对本领域技术人员而言应该很明确，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明保护的范围。
Claims (7)
1.一种提高L-异亮氨酸发酵产酸的方法，其包括如下步骤：
将黄色短杆菌CGMCC No.18060种子液接入到发酵培养基中，得到L-异亮氨酸发酵液；所述发酵培养基是在常规发酵培养基的基础上添加盐。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述盐为氯化钠。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述常规发酵培养基的组分为：
蔗糖19.8g/L，甘油20g/L，酵母粉4.8g/L，硫酸铵4.0g/L，磷酸二氢钾3.5g/L，磷酸氢二钾8.5g/L，硫酸镁4.8g/L，硫酸亚铁0.02g/L，硫酸锰12.9mg/L,硫酸锌0.27mg/L，硫酸铜0.48mg/L。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述氯化钠的添加量为：
1-8g/L。
5.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的组分为：蔗糖19.8g/L，甘油20g/L，酵母粉4.8g/L，硫酸铵4.0g/L，磷酸二氢钾3.5g/L，磷酸氢二钾8.5g/L，硫酸镁4.8g/L，硫酸亚铁0.02g/L，硫酸锰12.9mg/L,硫酸锌0.27mg/L，硫酸铜0.48mg/L，氯化钠1-8g/L。
6.根据权利要求1-5所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
将黄色短杆菌CGMCC No.18060种子液接入到发酵培养基中进行发酵培养，得到L-异亮氨酸发酵液；发酵培养温度为30℃，发酵时间为64小时，风量为800m³/h，压力为0.05Mpa；当糖浓度降至1.0g/L时，通过流加糖维持罐内糖浓度为1.0g/L，直至发酵结束。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵罐培养过程中，溶氧：前期（0-16小时）溶氧75%，后期（16小时至放罐前）溶氧35%；pH值：前期6.9，后期7.1。
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