CN115927203A - 一种分泌单抗pvy-5的杂交瘤细胞株及其单抗和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分泌单抗PVY‑5的杂交瘤细胞株及其单抗和应用，所述杂交瘤细胞株4B4D8C3能分泌抗马铃薯Y病毒单抗，所述杂交瘤细胞株的保藏号为CCTCC NO：C2022282，所述单抗PVY‑5与马铃薯Y病毒的外壳蛋白有特异性免疫反应，单抗PVY‑5的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，利用直接ELISA方法检测对感染马铃薯Y病毒病叶的灵敏度达到1︰5120倍稀释，所述单抗PVY‑5还可用于制备ELISA试剂盒，或胶体金试剂盒，或纳米模拟酶试剂盒，能快速、灵敏、经济、准确的对马铃薯Y病毒病进行检测。

Description

一种分泌单抗PVY-5的杂交瘤细胞株及其单抗和应用

技术领域

本发明涉及植物病原体检测技术领域，尤其涉及一种分泌单抗PVY-5的杂交瘤细胞株及其单抗和应用。

背景技术

我国是世界上马铃薯生产第一大国，马铃薯种植面积及总产量均居世界首位，但单产水平居较落后，远低于欧美发达国家。马铃薯病毒病(PVX、PVY、PVS、PLRV等)引起的种薯退化，是造成马铃薯单产水平低的主要原因之一。在荷兰、英国及美国等欧美发达国家早在70多年前就开展了马铃薯种薯质量检测工作。实施严格的种薯质量检测认证与市场准入制度，是保障其种薯质量及单产水平的关键因素。目前，欧美等发达国家马铃薯脱毒种薯普及率超过90％以上，而我国仅为30～50％。随着国家马铃薯主粮化战略的实施，马铃薯战略地位的到进一步提升，而提高脱毒种薯质量及普及率成为马铃薯产业健康发展的重要保障。而病毒作为影响马铃薯种薯质量的主要有害生物，是判定种薯质量的是否合格的关键指标，与此同时，急需建立适合我国的马铃薯种薯质量检测认证技术体系。

按照现行国家标准规定，马铃薯种薯繁殖从原原种到生产用种需要4年左右的时间，期间要经过严格的田间检测、库房检测和实验室检测等环节，最终判定种薯的质量。因此，不同于其他大田作物种子质量检测，马铃薯种薯质量检测人员需要具备更专业的技术和丰富经验。因此需要建立和研发快速、准确、灵敏的检测技术及检测产品，以辅助检测人员对种薯质量作出科学、准确、及时的评判。

PVY是最常见、危害最重的马铃薯病毒之一，是马铃薯第二重要病害，造成了严重的经济损失。是马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的代表成员，寄主范围较广，可侵染茄科、豆科、黎科等多种植物，并且造成严重的经济损失。PVY作为影响马铃薯种薯质量的主要有害生物之一，是判定马铃薯种薯质量是否合格的关键指标之一。

因此，亟需建立简便、快速、灵敏、经济、准确的马铃薯病毒病PVY检测抗体，满足马铃薯种薯田间质量检测服务的需要，为马铃薯种薯质量检测认证工作的全面推进提供技术支持。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种分泌单抗PVY-5的杂交瘤细胞株4B4D8C3；本发明的目的之二在于提供一种所述杂交瘤细胞株4B4D8C3分泌产生的单抗PVY-5；本发明的目的之三在于提供所述单抗PVY-5在检测马铃薯PVY病毒中的应用；本发明的目的之四在于提供含有所述单抗PVY-5的试剂盒。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种分泌单抗PVY-5的杂交瘤细胞株4B4D8C3，所述杂交瘤细胞株能分泌抗马铃薯Y病毒单抗，所述杂交瘤细胞株保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2022282。

2、一种由所述杂交瘤细胞株4B4D8C3分泌产生的单抗PVY-5。

本发明优选的，所述单抗PVY-5的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明优选的，所述单抗PVY-5与马铃薯Y病毒外壳蛋白有特异性免疫反应，所述马铃薯Y病毒的外壳蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述单抗PVY-5的抗体类型及亚类为IgG1，链型为Kappa轻链，利用直接ELISA方法检测对感染马铃薯Y病毒病叶的灵敏度达到1︰5120倍稀释。

3、所述单抗PVY-5在检测马铃薯PVY病毒中的应用。

4、含有所述单抗PVY-5的试剂盒。

本发明优选的，所述试剂盒为ELISA试剂盒，或胶体金试剂盒，或纳米模拟酶试剂盒。

本发明优选的，所述纳米模拟酶试剂盒中纳米模拟酶为的Fe₃O₄磁性纳米颗粒。

本发明的有益效果在于：本发明公开了一种分泌单抗PVY-5的杂交瘤细胞株及其单抗和应用，所述杂交瘤细胞株4B4D8C3能分泌抗马铃薯Y病毒单抗，所述杂交瘤细胞株的保藏号为C2022282，所述单抗PVY-5与马铃薯Y病毒30KDa的外壳蛋白有特异性免疫反应，抗体类型及亚类为IgG1，链型为Kappa轻链，利用直接ELISA方法检测对感染马铃薯Y病毒病叶的灵敏度达到1︰5120倍稀释，所述单抗PVY-5还可用于制备ELISA试剂盒，或胶体金试剂盒，或纳米模拟酶试剂盒，能快速、灵敏、经济、准确的对马铃薯Y病毒病进行检测。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为本发明技术路线；

图2为PVY-CP基因片段扩增；

其中，M：2K plusII marker，1、2：PVY-CP基因片段(807bp)；

图3为PVY-CP原核表达结果；

其中，M：Marker，1：菌体沉淀，2：菌体上清，3：菌体总蛋白；

图4为PVY-CP纯化结果；

其中，A：不同浓度咪唑洗脱PVY-CP，M：marker，1：50mM咪唑洗脱液，2：100mM咪唑洗脱液，3：300mM咪唑洗脱液；B：PVY-CP纯化结果，M：marker，4：浓缩后蛋白)；

图5为Western blot分析PVY单克隆抗体特异性；

其中，M：蛋白marker，1：健康马铃薯组培苗，2：感染PVY的马铃薯组培苗，3：感染PVX的马铃薯组培苗；

图6为PVY单克隆抗体灵敏度分析；

图7为PVY纳米模拟酶试纸条特异性检测；

其中，1：PVA，2：PVM，3：PVS，4：PVX，5：PLRV，6：PVY，7：健康植株；

图8为PVY纳米模拟酶试纸条灵敏度检测；

其中，1：1:10倍稀释，2：1:10²倍稀释，3：1:10³倍稀释，4：1:10⁴倍稀释，5：1:10⁵倍稀释，6：阴性对照。

生物保藏：

将2株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址为中国武汉武汉大学，分别命名为4F1B2G11、4B4D8C3；4F1B2G11保藏日为2022年9月1日，保藏号为CCTCC NO：C2022281，分类命名为杂交瘤细胞株4F1B2G11；4B4D8C3保藏日为2022年9月1日，保藏号为CCTCC NO：C2022282，分类命名为杂交瘤细胞株4B4D8C3。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例所需生物材料及试剂：马铃薯健康试管苗，感染PVX、PVY、PVA、PVS、PVM与PLRV的马铃薯试管苗均是本实验室留存；纳米模拟酶(Fe₃O₄，10mg/mL)由中科院生物物理所段德民研究员提供(制备方法参见文献Duan D,Fan K,Zhang D,et al.Nanozyme-stripfor rapid local diagnosis of Ebola)；Balb/c小鼠，购买于江南实验动物基地；Tizol、尿素、咪唑、青霉素与链霉素购买于生工生物工程(上海)股份有限公司；反转录试剂盒购买于翌圣生物科技(上海)有限公司；胶回收试剂盒购买于北京全式金生物公司；E.Coli BL21感受态细胞、表达蛋白重组质粒(pET28a)、LB培养基、Tris缓冲溶液、IgG-HRP与SDS-PAGE蛋白胶购买于艾柏森生物公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、PEG1450、HT与HAT购买于Sigma公司；新生牛血清购买于草原绿野公司；DMEM(Glu 4.5g/L)购买于大连美仑生物技术有限公司；透析袋、ELISA包被液、ELISA终止液、TMB显色液与DAB显色液购买于北京索莱宝科技有限公司；抗体亚型检测试剂盒购买于Sino Biological；超滤浓缩管购买于Millipore；亲和层析柱与Protein A纯化柱购买于武汉汇研生物科技股份有限公司；酶标板购买于Costar；硝酸纤维素膜、吸水纸、玻璃纤维素膜与PVC底板购买于上海金标生物科技公司。

本发明技术路线如图1所示。

实施例1、马铃薯Y病毒CP蛋白原核表达载体构建

一、引物设计与合成

在生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)上检索PVY的基因序列，根据PVY的外壳蛋白(coat protein，CP)基因全长序列设计扩增CP蛋白基因全长的引物(表1)，将引物在NCBI上进行比对，比对后由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。用PVY-CP-F与PVY-CP-R的引物扩增PVY-CP基因，扩增产物长度为807bp，编码PVY-CP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3。

表1.PVY-CP-F与PVY-CP-R的引物序列

二、病毒基因组的提取

(1)将样品置于研钵中，加液氮研磨成粉末，转至1.5mL离心管，加入1mL TRIzol混匀；

(2)4℃，14000g离心5min；

(3)取上清，加入200μL三氯甲烷，振荡混匀，室温放置15min；

(4)4℃，12000g离心15min；吸取上层水相至新1.5mL离心管中，加入0.5mL异丙醇，混匀，室温放置10min；

(5)4℃，12000g离心10min；

(6)弃上清，留沉淀，加入1mL 75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；

(7)4℃，7500g离心5min，弃上清，将离心管倒置于滤纸上，自然干燥；

(8)加入25～100μL DEPC水溶解沉淀，即得到RNA。

三、扩增病毒CP基因

(1)cDNA的合成

以提取植物病毒总RNA为模板，按照试剂盒的说明进行操作

(2)PCR扩增

以合成的cDNA为模板，以表1中的引物进行扩增，反应体系为系为50μL，cDNA模板2μL，病毒上、下游引物(0.1μmol·L-1)各2μL，2×taq酶25μL，ddH₂O补足至50μL。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸10min。

(3)琼脂糖凝胶电泳检测：

配置1％的琼脂糖凝胶，按比例加入GoldView^TM核酸显色染料(按照每20ml TAE溶液加入1μL的GoldView^TM)，摇晃均匀。缓慢的倒入模具中，放置冷却至其成胶块状为可用，选择合适的位置点入DNA Maker与PCR产物进行电泳(电泳时电压为140V，20分钟)，结束后利用凝胶成像仪观察目的条带，将目的条带切下，放入离心管进行回收。

(4)PCR产物的回收纯化：

按照全式金DNA凝胶回收试剂盒中的说明书对PCR产物回收与纯化。

四、病毒CP蛋白基因与pET28a载体连接

将胶回收纯化后的PVY的CP蛋白基因片段与pET28a载体连接，连接体系如下(表2)，37℃链接30min。

表2.pET28a载体连接体系

五、大肠杆菌转化

将BL21感受态细胞从超低温冰箱取出放置于冰盒上，待其融化后加入10μL连接产物(PET28a-PVY-CP)，吹打混合均匀后，冰浴30min。42℃热击90s，冰浴2min。加入500μL不含抗生素的LB液体培养基，放入37℃恒温摇床180r/min进行复苏1.5h。室温4000g离心5min，弃多余上清液，将菌体吹打混匀后，将浓缩后的菌液均匀涂在LB/Kan⁺固体培养基上，当菌液完全被固体培养基吸收后，将平板封好倒置于37℃恒温培养箱中过夜培养，第二天挑取单克隆菌斑，放入LB/Kan⁺液体培养基进行摇菌后送至上海生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

六、病毒CP蛋白基因在大肠杆菌中表达

(1)将测序正确的大肠杆菌菌液加入5mL的LB液体培养基中，放入37℃恒温振荡培养箱，250rpm/min过夜培养16-18h，作为种子液；

(2)按1:100转接到新鲜的200mL LB培养基中，37℃，250rpm/min条件培养，当菌液OD₆₀₀＝0.6时，补加IPTG诱导剂，于18℃继续诱导培养；

(3)4℃，5000rpm/min，15min，收集菌体；

(4)将菌体用裂解buffer(50mm Tris、0.5M NaCl，pH 8.0)重悬后进行超声破碎。超声条件为：work 3s，off 2s，时间15min，重复一遍；

(5)超声后的样品，4℃，5000rpm/min，15min，分别取上清液和沉淀用SDS-PAGE胶进行蛋白分析。

七、病毒CP蛋白纯化

(1)取培养后的菌体，加入裂解buffer(50mM Tris、0.5M NaCl，pH 8.0)重悬后进行超声破碎。超声条件为：work 3s，off 2s，时间15min，重复一遍；

(2)将超声破碎后的菌液于低温离心机内离心，4℃，5000rpm/min，15min，收集上清，在上清中加入变性剂尿素，终浓度为8M，溶解后，于4℃静置1h，离心取上清；

(3)将上述获得的上清液，用0.45μm滤膜过滤，通过Ni亲和层析柱进行蛋白纯化。

步骤如下：

a)用5倍柱体积的去离子水洗涤，去除空气和20％乙醇；

b)5～10倍柱体积Buffer A平衡柱子，(Buffer A：50mM Tris、0.15M NaCl、8M尿素，pH 8.0)；

c)将样品以0.5mL/min的速度流穿Ni柱；

d)用Buffer A平衡柱子；

e)分别用50mM咪唑、100mM、300mM咪唑洗脱。

f)将洗脱下来的样品分别进行SDS-PAGE胶分析是否有目的蛋白。

八、结论

(1)PVY-CP基因原核表达载体构建结果

PVY-CP基因经PCR扩增后，利用琼脂糖凝胶电泳分析，检测到长度为807bp的DNA片段(图2)，通过胶回收得到PVY-CP基因片段，将其连接到pET28a载体上，并转入BL21感受态细胞中，37℃倒置平板过夜培养后，挑选单克隆菌斑送至生工进行测序，经过序列比对，选择测序结果正确的菌液进行蛋白表达。

(2)PVY-CP表达结果

将测序正确的菌液按照推荐添加IPTG诱导剂，经SDS-PAGE胶进行蛋白分析，重组蛋白PVY-CP可以表达，如图3所示，其中泳道1为菌体沉淀，泳道2为菌体上清，泳道3为菌体总蛋白，说明重组蛋白PVY-CP以可溶性形式主要存在于菌体上清中，部分以包涵体形式存在于菌体沉淀中。

(3)PVY-CP纯化结果

将培养后的菌体裂解后进行超声破碎，低温离心后收集上清液，加入尿素使其变性后，用0.45μm滤膜过滤，分别用50mM咪唑、100mM、300mM咪唑洗脱，分别进行SDS-PAGE胶分析是否有目的蛋白，结果如图4，A所示，泳道1为50mM咪唑洗脱液，泳道2为100mM咪唑洗脱液，泳道3为300mM咪唑洗脱液。将100mM、300mM咪唑洗脱的蛋白稀释透析后浓缩，并用SDS-PAGE胶检测目的蛋白纯度，结果如图4，B所示，泳道4为浓缩后的目的蛋白，显示纯度很高。

实施例2、马铃薯Y病毒单克隆抗体血清制备

一、免疫小鼠

(1)将实施例1制备的原核表达纯化后的重组蛋白PVY-CP为免疫原，选取健康Balb/c小鼠3只，首次免疫使用PVY抗原50μg，每只与等体积的弗氏完全佐剂乳化后，腹部多点皮下注射免疫小鼠；

(2)第一次免疫后，每隔14d，用PVY抗原50μg，每只和等体积的弗氏不完全佐剂乳化后，腹部多点皮下注射免疫小鼠，免疫3次；

(3)第三次免疫开始，每次免疫后7d进行小鼠眼眶静脉丛(或尾静脉)取血，通过间接ELISA测定小鼠血液抗体效价；

(4)免疫至小鼠血清效价合格后，选取效价较高的小鼠，腹腔注射50μg PVY抗原加强免疫。

二、免疫小鼠血清效价检测

(1)蛋白包被：实验组用ELISA包被液稀释PVY抗原蛋白至5μg/mL，对照组加ELISA包被液，100μL/孔，4℃包被过夜，PBST清洗2遍；

(2)封闭：配制3％脱脂奶粉，380μL/孔，室温孵育1h，PBST清洗2遍；

(3)加样：取血清稀释至指定浓度，100μL/孔，室温孵育1h，PBST清洗2遍；

(4)二抗：兔抗鼠IgG-HRP 1：1000，100μL/孔，室温孵育1h，PBST清洗3遍；

(5)显色：TMB显色液，A液：B液＝1:1，100μL/孔，室温反应20min；

(6)终止：ELISA终止液，50μL/孔；

(7)读值：酶标仪主波长450nm，副波长630nm测定结果。

以PVY-CP为免疫原对小鼠进行免疫，第一次免疫后，每隔14天进行加强免疫，共免疫3次，第四次通过间接ELISA方法测定小鼠血清效价(表3)，其中3号小鼠免疫效价最高，加强免疫3～7天，进行细胞融合实验。

表3.小鼠血清效价

实施例3、病毒单克隆杂交瘤细胞制备

一、细胞融合

(1)在生物安全柜中，收集生长旺盛、形态良好的骨髓瘤细胞(Sp2/0)约10⁷个于50mL离心管中，不添加血清的DMEM(Glu 4.5g/L)培养基重悬，37℃培养箱预热；；

(2)加强免疫后3至7天的免疫合格小鼠，无菌条件下，取脾脏研磨过筛后离心收集脾细胞；

(3)脾细胞与Sp2/0混匀离心后，用融合剂PEG1450进行化学融合，添加DMEM终止反应；

(4)离心收集融合细胞，用添加NBS(新生牛血清)和HAT的高糖DMEM进行培养和筛选，约8天后用间接ELISA进行融合初筛，阳性细胞孔进行融合复筛；

(5)选择稳定表达抗体的单克隆杂交瘤细胞，细胞扩大培养后，取细胞进行腹水生产，并冻存细胞。

二、融合细胞筛选

采用BSA竞争ELISA方法检测，步骤如下：

(1)蛋白包被：分别用ELISA包被液稀释PVY抗原或Y病毒研磨液至指定浓度，100μL/孔，4℃包被过夜，PBST清洗2遍；

(2)封闭：配制3％脱脂奶粉，380μL/孔，室温孵育1h，PBST清洗2遍；

(3)加样：原倍加入细胞上清，80μL，室温孵育1h，PBST清洗2遍；

(4)二抗：兔抗鼠IgG-HRP 1:1000，100μL/孔，室温孵育1h，PBST清洗3遍；

(5)显色：TMB显色液A液：B液＝1:1，100μL/孔，室温反应20min；

(6)终止：ELISA终止液，50μL/孔；

(7)读值：酶标仪主波长450nm，副波长630nm测定结果；

(8)选择生活力良好，进行第一次亚克隆。

本次细胞融合获得16株阳性细胞(表4)，继续进行细胞亚克隆实验。

表4.3号小鼠融合筛选

三、细胞亚克隆筛选

用有限稀释法进行细胞克隆化。将阳性细胞重悬取细胞计数，以每200μL培养基含1个细胞为准则，按计数结果将阳性细胞稀释，每孔200μL加入96孔板中。7至9天后镜检观察，标记出现单一细胞簇孔。进行间接ELISA法检测阳性细胞。检测方法如下：

(1)蛋白包被：实验组分别用ELISA包被液稀释PVY抗原蛋白至1μg/mL，对照组加ELISA包被液，100μL/孔，4℃包被过夜，PBST清洗2遍；

(2)封闭：配制3％脱脂奶粉，380μL/孔，室温孵育1h，PBST清洗2遍；

(3)加样：取原倍细胞上清，80μL/孔，室温孵育1h，PBST清洗2遍；

(4)二抗：兔抗鼠IgG-HRP 1:1000，100μL/孔，室温孵育1h，PBST清洗3遍；

(5)显色：TMB显色液A液:B液＝1:1，100μL/孔，室温反应20min；

(6)终止：ELISA终止液，50μL/孔；

(7)读值：酶标仪主波长450nm，副波长630nm测定结果；

(8)选择稳定表达抗体的单克隆杂交瘤细胞，细胞扩大培养后，取细胞进行腹水生产，并冻存细胞。

经过2次细胞亚克隆，仅挑选镜检单克隆和二克隆进行检测，获得4株阳性单克隆杂交瘤细胞株(表5)，进行细胞扩大培养，取细胞进行腹水生产，并冻存细胞。

表5.亚克隆结果

实施例4、马铃薯病毒单克隆抗体制备

一、腹水制备

腹腔注射致敏剂液体石蜡0.5mL/只，7天后腹腔注射阳性杂交瘤细胞，每株细胞打一只小鼠。每只小鼠注射10⁵～10⁶个细胞，离心收集的细胞用1×PBS缓冲液重悬后进行注射。直至第8天起可观察到小鼠腹腔微隆，继续饲养至腹腔涨圆到行动不便时，用引流法多次收集腹水，离心后于-80℃冻存。

二、腹水纯化

(1)取腹水，用PBS稀释并过滤(0.22μm)。

(2)取过滤后的样品，通过Protein G柱进行蛋白纯化。步骤如下：

a)用5倍柱体积的去离子水洗涤，去除空气和20％乙醇；

b)5～10倍柱体积buffer平衡柱子，buffer：PB缓冲液；

c)将样品以0.5mL/min的速度流穿Protein G柱；

d)用上述buffer平衡柱子；

e)用甘氨酸洗脱，并用Tris中和。

(3)收集上述甘氨酸洗脱的样品，于4℃透析(透析Buffer：PBS)过夜。

(4)取透析后的样品，用超滤法(超滤管)浓缩，并用SDS-PAGE胶检测目的蛋白纯度。

(5)对纯度达到要求的抗体进行性能检测。

三、单克隆抗体检测

A.单克隆抗体性能检测

(1)蛋白包被：用ELISA包被液稀释PVY-CP、Y病毒研磨液、X病毒研磨液、健康组织研磨液，100μL/孔，4℃包被过夜，PBST清洗2遍；

(2)封闭：配制3％脱脂奶粉，380μL/孔，室温孵育1h，PBST清洗2遍；

(3)加样：取PVY单克隆抗体稀释至指定浓度，100μL/孔，室温孵育1h，PBST清洗2遍；

(4)一抗：兔抗鼠IgG-HRP 1:1000，100μL/孔，室温孵育1h，PBST清洗3遍；

(5)显色：TMB显色液A液：B液＝1:1，100μL/孔，室温反应20min；

(6)终止：ELISA终止液，50μL/孔；

(7)读值：酶标仪主波长450nm，副波长630nm测定结果。

B.单克隆抗体特异性检测

(1)总蛋白提取：分别取0.1g植物组织，液氮研磨，加入250μL总蛋白提取液与5μL50×蛋白酶抑制剂；

(2)13000rpm，4℃离心15min，吸取上清液；

(3)上清液加入loading buffer后混匀，沸水煮10min，冷却5min，4℃13000rpm离心10min；

(4)配制10％SDS-PAGE分离胶和5％浓缩胶，加样后180V电泳至loading buffer跑出；

(5)电泳结束前将PVDF膜在甲醇中浸泡15s；

(6)电泳结束后，将胶在转膜液中浸泡15min，进行转膜。100V转膜1～1.5h；

(7)转好膜后用TBST清洗一次，用丽春红染色拍照，再用TBST清洗几次后，用TBST配制的5％脱脂奶粉进行封闭，室温封闭1h；

(8)封闭完后加入1:5000稀释的一抗，4℃孵育过夜；

(9)一抗反应完全后，用TBST进行洗膜，4次，每次15min；

(10)加入1:5000稀释的二抗，室温孵育1h；

(11)二抗反应完全后用TBST洗膜，4次，每次10min；

(12)加入ECL显色液进行拍照。

采用Western Blot方法分别对PVY-2、PVY-3、PVY-4与PVY-5单克隆抗体进行特异性分析，均可以与感染PVY的马铃薯组培苗的蛋白提取液发生特异性免疫反应，不与感染PVX的马铃薯组培苗蛋白提取液发生特异性免疫反应，也不与健康的马铃薯组培苗蛋白提取液发生特异性免疫反应(图5)，可以说明4株PVY单克隆抗体的特异性较好。

C.单克隆抗体配对检测

(1)蛋白包被：用ELISA包被液稀释PVY单克隆抗体至1μg/mL，100μL/孔，4℃包被过夜，PBST清洗2遍；

(2)封闭：配制3％脱脂奶粉，380μL/孔，室温孵育1h，PBST清洗2遍；

(3)加样：PVY组织500倍稀释，阴性组织500倍稀释，100μL/孔，室温孵育1h，PBST清洗2遍；

(4)一抗：将标生物素的PVY抗体稀释至1μg/mL，100μL/孔，室温孵育1h，PBST清洗2遍；

(5)二抗：Avidin-HRP 1:10000，100μL/孔，室温孵育1h，PBST清洗3遍；

(6)显色：TMB显色液A液：B液＝1:1，100μL/孔，室温反应20min；

(7)终止：ELISA终止液，50μL/孔；

(8)读值：酶标仪主波长450nm，副波长630nm测定结果。

当吸光值大于阴性对照2倍及以上，认为配对成功。根据DAS-ELISA结果(表6)显示，PVY单克隆抗体仅一对抗体配对成功，包被抗体为PVY-5时，检测抗体为PVY-2配对成功。

表6PVY单克隆抗体配对结果

注：*为配对成功抗体

D.单克隆抗体灵敏度检测

(1)蛋白包被：用ELISA包被液稀释马铃薯Y病毒组培苗研磨液(1g/mL)，1:10～1:163840倍梯度稀释，阴性对照组加ELISA包被液稀释健康马铃薯组织提取液，100μL/孔，4℃包被过夜，PBST清洗2遍；

(2)封闭：配制3％脱脂奶粉，380μL/孔，室温孵育1h，PBST清洗2遍；

(3)加样：取PVY单克隆抗体稀释至指定浓度，100μL/孔，室温孵育1h，PBST清洗2遍；

(4)二抗：兔抗鼠IgG-HRP 1:1000，100μL/孔，室温孵育1h，PBST清洗3遍；

(5)显色：TMB显色液A液:B液＝1:1，100μL/孔，室温反应20min；

(6)终止：ELISA终止液，50μL/孔；

(7)读值：酶标仪主波长450nm，副波长630nm测定结果。

结果如图6所示，用PVY进行包被，应用直接ELISA方法检测，PVY单克隆抗体灵敏度可以达到1:5120倍稀释。

将单克隆抗体PVY-2和PVY-5送艾柏森生物科技有限公司进行测序，PVY-2重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，PVY-2轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；PVY-5重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，PVY-5轻链可变区核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示。

将2株分泌单克隆抗体PVY-2、PVY-5的杂交瘤细胞株送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址为中国武汉武汉大学，分别命名为4F1B2G11、4B4D8C3；4F1B2G11保藏日为2022年9月1日，保藏号为CCTCC NO：C2022281，分类命名为杂交瘤细胞株4F1B2G11；4B4D8C3保藏日为2022年9月1日，保藏号为CCTCC NO：C2022282，分类命名为杂交瘤细胞株4B4D8C3。

实施例5、PVY纳米模拟酶试纸条制备

一、PVY单克隆抗体纳米模拟酶标记筛选

(1)取所需用量的纳米酶溶液，加入纯化水，配制成0.5mg/mL浓度，超声1～2min(53kHz)；

(2)13000rpm，室温离心5～10min；

(3)吸去上清，加入纯化水，配制成0.5mg/mL浓度，重悬后，超声1～2min；

(4)13000rpm，室温离心5～10min，吸去上清；

(5)称取10倍纳米酶质量的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，加入MES溶液(50mM，pH 6.0)混匀，配制成10mg/mL NHS溶液；称取10倍纳米酶质量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，加入MES溶液(50mM，pH 6.0)混匀，配制成10mg/mL浓度EDC溶液，注意避光；

(6)等体积吸取步骤5配好的两溶液加至步骤4洗过的纳米酶中，配制成0.5mg/mL浓度，重悬混匀，超声30～60s，共超声3～5次，在混合器上室温反应30～40min(注意避光)；

(7)13000rpm，室温离心5～10min，吸去上清；

(8)加入MES溶液(50mM，pH 6.0)，配制成0.5mg/mL浓度，震荡混匀，然后超声1～2min；13000rpm，室温离心5～10min，吸去上清；

(9)取100μg的PVY单克隆抗体加入到MES溶液中(50mM，PH 8.0)混匀，配制成0.1mg/mL浓度的抗体溶液；

(10)吸取步骤9中配好的抗体加至步骤8洗过的纳米酶中，配制成1mg/mL浓度的纳米酶溶液，重悬混匀，超声10～20s，共超声5～10次，2～8℃混合器上反应14～18h；

(11)将反应完的溶液放置到磁力架上，吸取澄清液体到新的离心管，用超微量蛋白检测仪检测澄清液体抗体标记效率。往离心管中加入Tris-buffer(50mM，pH 7.4)，配制成0.5mg/mL纳米酶溶液，重悬混匀，超声10～20s，5～10次，室温反应30～40min；

(12)将反应完的溶液放置到磁力架上，吸去上清液，加入5％BSA-PBS溶液，配制成1mg/mL纳米酶溶液，重悬，超声10～20s，5～10次，超声清洗仪温度控制在2～8℃。重悬后，放在2～8℃混合器上封闭2～4h；

(13)磁吸附，弃上清，加入1％BSA-PBS处理液，配制成1mg/mL纳米酶溶液，重悬，超声10～20s，5～10次，超声清洗仪温度控制在2～8℃。重悬后2～8℃保存，贴签备用。

二、结合垫、样品垫与吸水垫预处理

A、结合垫预处理

(1)将玻璃纤维膜用仪器切割成宽为7mm规格的结合垫；

(2)配置结合垫预处理液(1％Triton X-100，50mM硼酸钠，pH 8.0)；

(3)取适量切割好的结合垫放置于结合垫预处理盒子中，用移液枪吸取结合垫预处理液滴加在结合垫上，使其全部浸湿，浸泡25～35min；

(4)镊子将浸泡好的结合垫夹至干燥网上，整齐排开，于40℃烘箱干燥2h，至完全烘干；

(5)将烘干的结合垫放至密封袋中，放入适量干燥剂，写好标签，保存于除湿柜中备用。

B、样品垫预处理

(1)将玻璃纤维膜用仪器切割成宽为11mm规格的样品垫；

(2)配置样品垫预处理液(10mM PBS，1％Tween 20，0.1g/L PVP K30，pH 7.4)；

(3)取适量切割好的样品垫放置于样品垫预处理盒子中，用移液枪吸取样品垫预处理液滴加在样品垫上，使其全部浸湿，浸泡25～35min；

(4)用镊子将浸泡好的样品垫夹至干燥网上，整齐排开，于40℃烘箱干燥2.5h，至完全烘干；

(5)将烘干的样品垫放至密封袋中，放入适量干燥剂，写好标签，保存于除湿柜中备用。

C、吸水垫处理

(1)将吸水纸用仪器切割成宽为22mm规格的吸水垫；

(2)将切割好的吸水垫放置干燥网上，整齐排开，于40℃烘箱干燥2.5h；

(3)将干燥好的吸水垫放至密封袋中，放入适量干燥剂，写好标签，保存于除湿柜中备用。

D、NC膜划线操作

(1)取一定量PVY抗体，加入包被缓冲溶液，稀释至浓度为1.5mg/mL的包被抗体溶液；

(2)取一定量羊抗鼠IgG，加入包被缓冲溶液，稀释至浓度为1mg/mL的羊抗鼠IgG溶液；

(3)打开划线喷膜仪，执行清洗程序，清洗完成后将泵1的导管放入稀释后的PVY(检测线)抗体溶液中，将泵3的导管放入稀释后的羊抗鼠IgG(质控线)溶液中；

(4)将贴好NC膜的PVC背衬板放置在划线喷膜仪正确位置，按照1μL/cm的划膜速度，执行划线程序；

(5)划线完成后执行清洗程序并关机，将PVC背衬板做好标记，放入烘箱干燥1h，温度37℃。

E、结合垫喷金操作

(1)取标记了PVY抗体的纳米酶，放入离心管，用磁力架吸附，弃去溶液，加入一定量纳米酶标记抗体稀释液(50mM Tris，10％海藻糖，5％BSA，1％Triton X-100，1％Tween20，0.05％proclin，1％ PVP K30，pH 8.5)，稀释至纳米酶浓度为1mg/mL；

(2)将稀释好的纳米酶标记抗体溶液置于超声仪，超声5～10次，每次10～20秒；

(3)打开划线喷膜仪，执行清洗程序，清洗完成后将泵2的导管放入超声后的纳米酶标记抗体溶液中；

(4)将经过预处理的结合垫放置在划线喷膜仪正确位置，按照5μL/cm的喷膜速度，执行喷垫程序；

(5)喷垫完成后执行清洗程序并关机，将结合垫做好标记后，放入烘箱干燥1h，温度37℃。

三、PVY纳米模拟酶试纸条组装

(1)打开贴板机，将PVC板往里贴紧贴板机工作板位置，按启动吸气固定PVC板，PVC板尽量放在中间位置，以免掀开离型纸时处于活动状态；

(2)按照选定的组合进行试纸条组装；

(3)按启动键，将干燥后的NC膜、结合垫，吸水垫、预处理好的样品垫，按照吸水垫压NC膜2mm，结合垫压NC膜2mm，样品垫压结合垫2mm的设定，贴在背衬板上；

(4)贴板程序结束后，关闭贴板机。将试剂条大板放置在湿度≤30％避光环境下储存备用；

(5)将贴好的PVC板放置在斩切机上，打开电源和开关，抬起翻转架，调整置物板的位置，将成品大板卡住，成品大板左端对齐刀片处，放下翻转架；

(6)设定试纸条斩切宽度为0.4cm，点击开始进行斩切；

(7)将切好的试纸条装入试剂卡壳中；打开自动压壳机电源，将装好壳的试剂条放在压壳机传送带上，点击“运行”按钮，机器运行，直至所有试剂卡壳压壳结束，关闭压壳机；

(8)将试纸条装入放有干燥剂的热封袋中进行热封；

(9)热封结束后，做好标记，将试纸条保存在湿度不高于30％的除湿柜中。

四、PVY纳米模拟酶试纸条性能检测

A、可用PVY纳米模拟酶试纸条筛选

(1)将感染PVY的组培苗用液氮研磨成粉，加入提取缓冲液，涡旋混匀，室温离心4000g，2min；

(2)将按照组装好的试纸条分别滴加阳性对照与空白对照；

(3)将样品滴加至样品孔后，室温计时15min；

(4)观察试纸条检测是否出现假阳性，并记录未出现假阳性试纸条编号。

制备PVY纳米模拟酶试纸条根据DAS-ELISA配对结果进行选择抗体。

PVY单克隆抗体仅有一对配对成功，为PVY-2与PVY-5，分别对PVY-2与PVY-5进行标记，PVY-5与PVY-2进行包被，以PVY-2作为标记抗体，PVY-5作为包被抗体制备的PVY纳米模拟酶试纸条滴入阳性样品后，C线(质控线)与T线(检测线)同时出现条带，能够检测到阳性结果，但加入阴性对照后，C线与T线也同时出现条带，表现出假阳性。以PVY-5作为标记抗体，PVY-2作为包被抗体制备的PVY纳米模拟酶试纸条滴入阳性样品后，C线与T线同时出现条带，能够检测到阳性结果，加入阴性对照后，仅出现C线，为阴性结果。

最终，选择以PVY-5作为标记抗体，PVY-2作为包被抗体制备的PVY纳米模拟酶试纸条。

B、PVY纳米模拟酶试纸条特异性检测

(1)将未出现假阳性试纸条进行特异性检测，

(2)分别将感染PVA、PVM、PVS、PVY、PVX与PLRV的植株和健康植株用液氮研磨成粉，加入提取缓冲液，涡旋混匀；

(3)室温离心4000g，2min，取上清液；

(4)将样品滴加至样品孔后，室温计时15min，观察并记录实验结果。

结果如图7所示，将PVA、PVM、PVS、PVX、PLRV和健康的植株汁液滴入到试纸条中，试纸条仅出现C线，为阴性结果，说明试纸条不与PVA、PVM、PVS、PVX、PLRV和健康的植株发生免疫反应，将PVY植株汁液滴入试纸条中，C线与T线均出现，为阳性结果，说明试纸条与PVY发生免疫反应，具有较好的特异性。

C、PVY纳米模拟酶试纸条灵敏度检测

(1)将感染PVY的组培苗用液氮研磨成粉，按照0.1g植物组织加入1ml提取缓冲液，涡旋混匀；

(2)室温离心4000g，2min；

(3)将上清液按照1:10、1：10²、1:10³、1:10⁴、1:10⁵梯度进行稀释；

(4)将稀释后的样品涡旋混匀后滴加至样品孔，室温计时15min，观察并记录实验结果。

结果如图8所示，PVY纳米模拟酶试纸条能够在1:10、1:10²、1:10³稀释后，同时出现C线与T线，检测结果为阳性，能够检测出PVY，当稀释倍数为1:10⁴、1:10⁵稀释后，仅出现C线，未出现T线，结果为阴性，不能检测到PVY。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (8)

1.一种分泌单抗PVY-5的杂交瘤细胞株4B4D8C3，其特征在于，所述杂交瘤细胞株能分泌抗马铃薯Y病毒单抗，所述杂交瘤细胞株保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2022282。

2.一种由权利要求1所述杂交瘤细胞株4B4D8C3分泌产生的单抗PVY-5。

3.根据权利要求2所述的单抗PVY-5，其特征在于，所述单抗PVY-5的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

4.根据权利要求2所述的单抗PVY-5，其特征在于，所述单抗PVY-5与马铃薯Y病毒外壳蛋白有特异性免疫反应，所述马铃薯Y病毒的外壳蛋白基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；所述单抗PVY-5的抗体类型及亚类为IgG1，链型为Kappa轻链，利用直接ELISA方法检测对感染马铃薯Y病毒病叶的灵敏度达到1︰5120倍稀释。

5.权利要求3或4任一项所述单抗PVY-5在检测马铃薯PVY病毒中的应用。

6.含有权利要求3或4任一项所述单抗PVY-5的试剂盒。

7.根据权利要求6所述含有单抗PVY-5的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为ELISA试剂盒，或胶体金试剂盒，或纳米模拟酶试剂盒。

8.根据权利要求7所述的含有单抗PVY-5的试剂盒，其特征在于，所述纳米模拟酶试剂盒中纳米模拟酶为的Fe₃O₄磁性纳米颗粒。

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