CN1159063C

CN1159063C - 骨形态发生蛋白（bmp）作为治疗急性再生障碍性贫血药物的应用

Info

Publication number: CN1159063C
Application number: CNB001096850A
Authority: CN
Inventors: 褚建新; 赵钧铭; 丁顺利; 徐世才; 刘蔼如; 王淑萍
Original assignee: Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital of CAMS and PUMC
Priority date: 2000-06-21
Filing date: 2000-06-21
Publication date: 2004-07-28
Anticipated expiration: 2020-06-21
Also published as: CN1284380A

Abstract

本发明涉及骨形态发生蛋白(BMP)在制药领域中的新用途，尤其是在制备治疗急性再生障碍性贫血药物中的应用，具体方法为建立急性再障动物模型；制备验证BMP对急性再障的治疗作用，所说的急性再障诱导模型是在无菌条件下给大鼠腹腔注射5-Fu，然后经口灌喂马利兰提取液，一周一次，连续三周即可建成；再将制备好的BMP采用肌肉隐窝填埋方法，植入所述的动物模型体内，即可观察其对急性再障的治疗新用途，其优点是BMP一般无种属特异性，组织相容性好，无免疫排斥反应，简便易行，费用低廉，具有广泛应用前景。

Description

骨形态发生蛋白(BMP)作为治疗急性再生障碍性贫血药物的应用

本发明涉及骨形态发生蛋白(Bone morphogensis protein，BMP)在制备治疗急性再生障碍性贫血病药物中的应用。

1965年Urist首先发现用牛的脱钙骨基质胶植入小鼠肌肉内可诱导形成新的软骨和骨组织《Science 1965，27：2-10》。以后大量的研究证明，在骨基质中的确存在一种骨诱导活性蛋白，并命名为骨形态发生蛋白(BMP)。目前，已从多种动物，包括牛、猪、鼠、兔、猴和人等的骨基质中分离到BMP。BMP是一种糖蛋白，含有N糖基化位点。BMP的分子量因动物种属不同而有所差别，人、牛和猪的BMP分子量相近，分别为17，18.5和19.5kDa，大鼠骨的BMP分子量为25kDa；由19种氨基酸组成。1988年美国Wozney等以牛BMP基因为探针，从人的cDNA文库中克隆出7个人BMPcDNA，即BMP-1至BMP-7《Science1988，242：1528-1534》。其中重组的人BMP-2(rh-BMP-2)在体内外诱骨活性最为明显。BMP的作用一般无种属特异性，具有跨种属诱导成骨的能力。至目前为止，BMP的应用，一是骨缺损的修复，如由于外伤、肿瘤的侵袭和骨手术等引起的骨缺损，可用BMP植入骨缺损处，修复骨的缺损；或将BMP与人工生物材料混合植入动物体内，定型修复骨的缺损。二是用于骨折愈合的治疗，将BMP植入骨折处可促进骨痂形成，加快骨折愈合。关于急性再生障碍性贫血(再障)的治疗，目前，对于异常免疫介导的再障，多采用各种免疫抑制剂治疗，如抗淋巴细胞球蛋白(ALG)、抗胸腺细胞球蛋白(ATG)单独使用，其疗效为28-67％；ATG与康力龙合用总有效率为52％；ALG与环孢霉素A合用，疗效可达83％。但疗程长(2年左右)，费用昂贵，副作用大。对于非免疫介导的急性再障，特别是遗传性贫血病，至今尚无理想的治疗药物和方法。目前，国内外文献中尚未见用BMP治疗再生障碍性贫血病的报道。

本发明之目的在于提供BMP的新用途，即在制备治疗急性再生障碍性贫血药物中的新应用。

本发明基本原理是：一.再生障碍性贫血基本病损在骨髓，骨髓外(如皮下、肌肉组织等)的间叶细胞并无异常；二.BMP植入皮下或肌肉内有诱导骨及骨髓形成的作用，尽管BMP诱导骨髓细胞的来源尚不清楚，但肌肉中的间叶细胞(卫星细胞)转化为造血前体细胞的可能性，最近已获得证实。因此，利用BMP诱导自体间叶细胞形成骨及骨髓的作用，在再生障碍性贫血机体内重建正常造血系统，可以获得长期治疗的效果。具体实施方案包括两方面内容：一.大鼠急性再生障碍性贫血动物模型的建立；二.制备验证BMP对急性再生障碍性贫血的治疗作用。

一.大鼠急性再生障碍性贫血模型的建立

目前，在国内外建立的干细胞受损的再生障碍性贫血模型(包括小鼠、大鼠和家兔)都是用马利兰诱导的。这些模型都存在给药时间长、发病率低、死亡时间不规律和继发性肿瘤发生率高等缺点，难以用于药物筛选和实验治疗。为了制备验证BMP对急性再生障碍性贫血的治疗作用，首先要建立一种较理想的动物模型。

本发明利用5-氟脲嘧啶(5-Fu)富集干细胞和马利兰(busulfan)损伤干细胞的作用机制，采用两者联合给药，即“聚而杀之”的方案，成功地用大鼠复制出了类似人类急性造血干细胞衰竭型再生障碍性贫血(再障)模型。

实验动物：Wistar大鼠，雌性，体重180-250克，清洁级。

5-氟脲嘧啶(5-FU)注射液：250mg/支，天津市氨基酸公司人民制药厂生产。

马利兰(Busulfan)片：即临床应用的“白消安”，2mg/片，上海华联制药有限公司生产。为保证给药剂量准确，用马利兰片制备成丙酮提取液，再配制成水悬液，供大鼠口服用。

再障诱导方案：在无菌条件下，大鼠腹腔注射5-Fu，100-200mg/kg，然后经口灌喂马利兰提取液，10-20mg/kg，一周一次，连续3周。

血象的动态观察：采取尾血用库尔特血球计数仪计数白细胞、血小板、血红蛋白和红细胞比积。

骨髓有核细胞计数：取股骨，剪除股骨头和远端关节软骨，冲出骨髓细胞，按常规用血细胞计数池计数一根股骨有核细胞数。

骨髓粒-巨噬细胞集落形成单位(GM-CFU)检测：按常规方法取骨髓细胞作GM-CFU检测。

病理形态学观察：死亡或定期活杀的动物，取股骨、肝、脾和淋巴结，10％福尔马林固定，石蜡切片，进行病理形态学观察。

实验结果：

1.再障的发生率和死亡率：

共进行了5批计49只大鼠实验，结果40只发生急性再障，发病率为82.0％，平均存活时间为30.0±6.5天，9只为慢性再障(占18.0％)，总发病率为100％；死亡48只，死亡率98％，1只生存＞3个月。

2.血象的动态改变：根据两批实验共15只实验大鼠血象的动态观察，所检4项血象指标均呈持续性减低，停药后2-3周，血象降到最低，有的动物由于严重贫血而死亡。结果见表1。

表1 5-Fu+Busulfan诱发大鼠再障血相的动态改变(X±SD)

观察时间给药前 5-Fu第5天停药1周停药2周停药3周

动物数 15 15 15 10 5

白细胞(10⁹/L) 15.7±4.3 8.3±1.8 7.0±3.5 11.0±9.9 9.0±4.2

比积(％) 36.3±7.8 38.5±7.5 31.3±1.7 18.0±8.5 16.0±.5.7

血小板(10⁹/L) 620±127 448±179 150±89 110±14 110±99

血红蛋白(g/L) 151±15 117±73 95±44 70±42 60±57

3.再障动物骨髓有核细胞数(BMNC)和脾指数(mg脾重/g体重)的改变：随着病程的发展，BMNC数/股骨和脾指数明显减低，至濒死时BMNC数比实验前降低了14倍，脾指数减少约一半(见表2)。表明骨髓造血衰竭和脾脏萎缩十分严重。

表2.再障动物骨髓有核细胞数和脾指数的改变

观察时间给药前给药后

1周 2周 3周(濒死)

BMNC 37.0±9.9 27.0±2.6 9.5±3.7* 2.6±0.3*

10⁶/股骨

脾指数 2.9±0.2 2.8±0.4 2.2±0.3* 1.5±0.4*

(mg/g)

每组观察动物数3只与实验前相比P＜0.01

4.再障大鼠骨髓中粒-巨噬细胞集落形成单位(GM-CFU)检测：正常大鼠骨髓GM-CFU为55.1±3.7个/2×10⁵细胞，而再障动物骨髓未发现有集落生长(见表3)。

表3.再障大鼠骨髓中GM-CFU的改变(cfu/2×10⁵)

观察时间正常动物(n＝6) 再障组(n＝10) P值

GM-CFU 55.1±3.7 0±0 ＜0.05

5.再障动物病理形态学观察：根据濒死和死亡再障大鼠造血器官的病理形态学观察，股骨和胸骨骨髓增生极度低下(图1)，间质瘀血水肿，脂肪细胞增多，残留少数淋巴样细胞，多呈典型凋亡表现(图2)；脾脏、淋巴结和胸腺等淋巴器官明显萎缩，脾脏淋巴细胞也可见凋亡现象(图3)；肝细胞脂肪变性。肝脾无髓外造血灶。这些特点符合人类急性再障的表现。

6.单纯注射5-Fu组：10只大鼠于腹腔一次注射5-Fu，血象出现一过性减低，停药10天后基本恢复正常；骨髓组织学检查，第3天骨髓增生极度低下，残留成熟粒细胞，第5天沿骨内膜出现大量淋巴样细胞(形态上难与造血干细胞区别)(图4)，第7天出现髓系分化，第10天骨髓增生明显活耀，细胞组成基本正常(图5)。动物无一死亡。

7.单纯马利兰组：按文献方法，单用马利兰诱发大鼠再障。采用了两种剂量(10-20mg/kg，每周2次，总剂量127mg/kg，和5-10mg/kg每周3次，总剂量105mg/kg)，12只大鼠中只有3只死于再障，其余动物于停药后血象恢复。

由此可见，大鼠于一次注射5-Fu后(即造血干细胞富集时期)连续给予马利兰的联合用药方案，可诱导大鼠发生典型的急性再生障碍性贫血，发病率100％，80％实验动物在一个月内死亡，总死亡率为98％。其临床表现与人类急性再障相似。为筛选治疗再生障碍性贫血药物和进行实验治疗提供了理想的模型。造血细胞和淋巴细胞凋亡，可能是马利兰损伤造血细胞的主要机制。国内外未见有类似报道。

二.BMP治疗急性再生障碍贫血的作用

本项研究分为两部分：一.BMP诱导骨及骨髓的形成过程；二.BMP治疗急性再生障碍性贫血病的作用。

实验动物：Wistar大鼠，雌性或雄性，体重180-250克，清洁级；昆明小鼠，雌性

或雄性，体重20-25克，清洁级。

BMP制剂的制备：脱钙骨基质胶(bonematrixgelatin，BMG)，按文献方法稍加改进，即取大鼠新鲜四肢管状骨，去除所有软组织、软骨及骨髓，经泠蒸馏水充分洗涤，分别在乙醇和乙醚中脱脂，经液氮冰冻后粉碎成1mm³小颗粒，在0.6M HCl中脱钙3-5小时，蒸馏水洗涤，70％乙醇浸泡，使pH达到中性，然后用乙醇和乙醚脱水，保存于消毒的小瓶内，待用。BMG中含有与胶原蛋白结合的BMP。重组人的BMP-2(rh-BMP-2)，购置军事医学科学院生化室；经环氧乙烷消毒后，4℃干燥器内保存，备用。

手术器俱：眼科剪刀、镊子和分离针，缝线和缝皮针，消毒敷料，乙醚等。

BMP肌肉植入术：小鼠或大鼠于乙醚麻醉下，伏卧固定于消毒木版上，剪除大腿毛发，75％酒精消毒，盖上消毒手术巾，沿大腿外侧剪开皮肤约0.8-1.0cm，用剪刀尖划破肌膜，再用小镊子向纵深分离肌肉，形成隐窝，然后用眼科分离针挑取少许BMG或rh-BMP-2或两者等量混合物，散置入肌肉内，小鼠约0.5mg，大鼠约1.0-2.0mg，然后逢合肌膜和皮肤。

异位骨小结的观察：BMP植入后在局部形成骨小结。为了观察BMP诱导骨和骨髓的形成过程，于BMP植入后不同时间，活杀动物，取出骨小结，进行以下观察：骨小结内有核细胞计数、常规细胞形态学和病理形态学观察(方法同第一部分)；脾集落形成单位(CFU-S)试验(按文献方法进行)，基质细胞培养和基质细胞造血干细胞因子(SCF)表达(采用微孔滤膜免疫金银染色法，结果用双波长薄层扫描仪CS-9000在波长505nm下扫描各点的染色强度表示)。

大鼠再障模型：为本实验室建立的5-Fu+Busulfan诱导的大鼠急性再障模型。

动物血象和病理形态学观察方法同第一部分。

实验结果：

(一).BMP诱导骨及骨髓的形成过程：

1)大鼠和小鼠肌肉内植入BMP后骨及骨髓形成的过程基本相似，先在植入的BMP周围出现大量的间叶细胞，多为圆形或梭形，随后细胞变园，形成软骨细胞(图6)，细胞间酸性粘多糖染色呈强阳性；植入2周后出现软骨化骨，新生骨排列成髓腔，血管丰富；植入后26天在间质内出现大量造血细胞，其成分与正常无异。观察至3个月造血仍甚活跃(图7)。有的间叶细胞增生特别活跃(图8)。

2)异位骨小结造血细胞的特性：新形成的骨小结，细胞涂片造血细胞的形态与正常无异(图9)。骨髓有核细胞数可达10⁶-10⁷；CFU-S₍₁₂₎(第12天脾脏集落形成单位)形成能力与自体股骨骨髓无明显区别；骨髓细胞体外培养，基质细胞生长比同体骨髓明显活跃；骨小结骨髓基质细胞的SCF表达，其扫描强度为0.174±0.017，而自体骨髓为0.089±0.006，两者有明显差别(P＜0.001)。

(二).BMP治疗大鼠急性再障贫血的作用

按本室建立的方法，用5-Fu+Busulfan联合方案诱导再障，于诱导前3-5天，两侧大腿肌肉内分别植入rh-BMP-2与BMG混合物(1∶5)1-2mg，对照组则于两侧大腿肌肉内分别植入同量琼脂，然后观察实验组与对照组再障动物血象和生存率，死亡动物进行病理形态学观察。

1.血象的变化：

植入BMP的实验组，于停药后1周各项血像指标均高于对照组，其中白细胞和血红蛋白尤为明显(P＜0.05)，停药后第3周，实验组有5只活存，对照组仅2只存活，实验组各项血像指标仍高于对照组，但由于动物数减少，除比积外，未显示有统计学的差别。停药后2个月，对照组仅1只活存，实验组5只大鼠，除2只非再障(血象已恢复)死亡外，3只血象已恢复至正常水平。(见表4)。

表4肌肉内植入BMP对急性再障大鼠血象的影响

观察组别动物白细胞比积血红蛋白血小板

时间数 (10⁹/L) (％) (g/L) (10⁹/L)

停药后对照组 9 7.0±3.5 31.3±1.7 95±44 150±88

1周实验组 9 10.5±2.2^* 35.7±3.1 117±8^* 234±22

停药后对照组 2 18.0±5.7 6.0±5.7 110±156 80±28

3周实验组 5 22.7±6.1 16.7±3.1^* 180±87 140±91

停药后对照组 1 18.0 46 180 540

2个月实验组 3# 18.0±4.0 38.0±3.5 147±12 580±53

^*P＜0.05 #另2只非再障死亡

2.肌肉内植入BMP对急性再障大鼠生存的影响

在两批大鼠肌肉内植入BMP的实验治疗组中，共16只动物，有9只活存大于3个月，存活率为56.3％，明显高于对照组(23只大鼠中仅1只活存＞3个月)；死亡大鼠平均生存时间，实验组也较对照组有明显延长，平均存活时间分别为44.9±18.8天和34.2±8.2天。经t检验和χ²检验，两者差别明显(t＝2.68，χ²＝3.91，P＜0.05)。

表5肌肉内植入BMP对急性再障大鼠生存情况的影响

实验动物长生存率死亡动物

分组 (＞3个月) 生存时间(天)

对照组 23 1/23(4.3％) 34.2±8.2

BMP治疗组 16 9/16(56.3％) 44.9±18.8

3.再障诱发过程中植入BMP的疗效：于大鼠注射5-Fu和第2次口服马利兰后进行肌肉内植入BMP术，然后继续口服一次马利兰。结果未发现有延长大鼠生命的作用(资料未列入)。

3.病理形态学观察：植入BMP后诱导再障的实验组，第33天活杀大鼠的病理观察，股骨骨髓增生较活跃(图10)，但仍可见增生底下区，骨髓细胞成分无异常；肌肉中形成的骨小结，一个骨髓细胞增生较活跃(图11)，2个增生低下，常见淋巴样细胞；脾脏淋巴滤泡增生恢复正常(图12)。第89天活杀大鼠的病理学观察，股骨骨髓增生更为活跃，脂肪细胞减少，骨髓细胞成分无异常(图13)；肌肉中形成的骨小结中，一个骨髓细胞增生较活跃(图14)，2个增生低下，也常见淋巴样细胞。实验组死于再障的大鼠，股骨和骨小结造血细胞增生均减低。对照组大鼠死亡时，骨髓增生均极度底下，仅见个别小的造血灶。

由此可见，肌肉内植入rh-BMP-2或BMG可在局部形成骨及骨髓组织，出现活跃造血细胞约为植入BMP后第28天；骨小结内的造血细胞在形态上和功能上与自体骨髓细胞无明显差别，其中基质细胞增生和造血干细胞因子(SCF)水平高于自体骨髓。根据本发明建立的大鼠急性再障模型，于再障前3-5天肌肉内植入rhBMP-2/BMG混合物，结果证明BMP植入对再障的发生发展有明显控制作用，约56.3％实验动物获得长期生存，明显高于对照组，其血象也已完全恢复正常。这一发现开拓了BMP作为治疗急性再生障碍性贫血药物的新用途。值得注意的是，诱导再障前植入BMP的治疗效果明显优于再障时植入BMP，提示BMP诱导造血的时间与5-Fu+Busulfan诱导的急性再障之间存在一个时间差，应用时需加以注意。

本发明的优点，一是BMP一般无种属特异性，rh-BMP-2已开始投放市场，为临床应用提供了有利条件；二是BMP是利用自体间叶细胞诱导出来的造血细胞，组织相容性完全一致，无免疫排斥的可能，一旦在体内重建新的造血系统，有可能获得长期效果；三是方法简便易行，费用低廉，具有广泛应用价值。在对机体影响不大的肌肉内(如腹直肌)做一小手术，植入BMP即可达到治疗效果。

附图说明：

图1：5-Fu+Busulfan诱发大鼠急性再障，股骨骨髓增生极度减低，充满脂肪细胞。石蜡

切片，HE染色40x

图2：5-Fu+Busulfan诱导大鼠急性再障，残留细胞多呈凋亡形态表现(→)。

石蜡切片，HE染色160x

图3：5-Fu+Busulfan诱导大鼠急性再障，脾脏明显萎缩，脾滤泡缩小，残留细胞有的呈

凋亡形态表现(→)。石蜡切片，HE染色80x

图4：大鼠单用5-Fu后第5天，股骨骨髓增生低下，骨内膜下出现淋巴样

细胞(造血干细胞)。石蜡切片，HE染色80x

图5：大鼠单用5-Fu后第10天，骨髓增生恢复正常。石蜡切片，HE染色80x

图6：大鼠肌肉内植入BMP第10天间质细胞增生和软骨形成。石蜡切片，HE染色80x

图7：大鼠肌肉内植入rh-BMP-2第70天，骨小结形成，骨小结内造血活跃，

少数脂肪细胞。石蜡切片，HE染色80x

图8：小鼠肌肉内植入rh-BMP-2第22天出现大量的间叶细胞。图中心粉红色物为未吸

收的BMP。石蜡切片，HE染色80x

图9：骨小结骨髓细胞离心涂片，可见各系造血细胞。瑞氏染色80x

图10：植入BMP后诱发再障的实验组大鼠，第33天活杀股骨骨髓增生活跃，造血细

胞形态正常。石蜡切片，HE染色40x，

图11：同上大鼠骨小结骨髓细胞增生活跃，可见各系造血细胞。石蜡切片，HE染色80x

图12：同上大鼠的脾脏，脾滤泡增生恢复正常。石蜡切片，HE染色40x

图13：植入BMP后诱导再障实验组，第89天活杀的大鼠，股骨骨髓增生活跃，造血细

胞形态正常。石蜡切片，HE染色80x

图14：同上大鼠骨小结造血细胞增生活跃，可见各系造血细胞。石蜡切片，HE染色40x。

Claims

1、骨形态发生蛋白(BMP)在制备治疗急性再生障碍性贫血药物中的应用。