CN115901982A - 一种滋阴凉血的中药组合物的特征图谱的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中药检测技术领域,具体提供了一种滋阴凉血的中药组合物的特征图谱的构建方法,该特征图谱的构建方法中包括(1)供试品溶液的制备;(2)采用高效液相色谱法检测供试品溶液,填充剂采用十八烷基硅烷键合硅胶,以乙腈和含磷酸的水溶液为流动相,进行梯度洗脱,梯度洗脱程序包括,0→15min→50min→60min→70min→80min→90min,流动相中乙腈的体积百分数为4%→4%→11%→20%→25%→30%→40%;所述中药组合物包括生地黄、熟地黄、芍药、山药、川续断、黄芩、黄柏和生甘草,经大量实验筛选得到特定的洗脱程序,得到10个共有特征峰,并实现了包含10个有效成分的特征峰的有效分离,峰形好,基线平稳。
Description
技术领域
本发明属于中药检测技术领域,具体涉及一种滋阴凉血的中药组合物的特征图谱的构建方法。
背景技术
保阴煎是调经要方之一,是《景岳全书》中的一个方子,该方组成有生地黄、熟地黄、芍药、山药、川续断、黄芩、黄柏和生甘草,主要用于阴虚血热而致血不循经之证。方中生地清热凉血,养阴生津;熟地黄、白芍养血敛阴;黄芩、黄柏清热凉血;山药、续断补脾肾,填精血,全方共奏凉血养血之功。临床应用以五心烦热、带下淋浊、经来量多、舌红脉数为辨证要点。
中药成分复杂,药效部位常常不是单一成分,以某种单一成分作为质量控制指标已越来越不适应中药质量控制的要求。因此,中药特征图谱技术应运而生。中药特征图谱技术源于指纹鉴定学,利用现代信息技术和质量分析手段较全面的反映了中药所含化学成分的种类和数量。对于中药材,特征图谱可以用来鉴别真伪、评判优劣;对于中成药,特征图谱可以鉴别产品真伪,评判制备工艺的合理性,有效地控制产品质量。现阶段中药的有效成分大多数尚不明确,中药特征图谱的整体性和模糊性正好适应这一特点,较单一成分的质量控制方法更具有科学性和全面性。目前,国际上已认可将中药特征图谱作为中药质量的控制模式。高效液相色谱法具有分离效能高、分析速度快等优点,已成为当今特征图谱的主要分析手段。为了保阴煎进行质量检测和质量控制,
现行的法定标准《中国药典》未收录保阴煎,马文凤等高效液相与高分辨率的质谱联合使用实现了对保阴煎中没食子酸、芍药苷和红花黄色素等物质进行鉴别,但是一方面该方法对设备要求大,且操作复杂,需要配备专门的质谱设备操作人员,而若仅采用其公开的高效液相法检测又存在出峰个数少,分离效果差的问题。
发明内容
因此,本发明的目的在于解决现有技术中的方法检测保阴煎对应的中药组合物及其制剂时得到的指纹图谱的出峰个数少,分离效果差或者设备要求大,操作复杂的问题,提供了一种滋阴凉血的中药组合物的特征图谱的构建方法。
具体的,本发明提供了一种中药组合物及其制剂的特征图谱的构建方法,包括以下步骤,
(1)供试品溶液的制备;
(2)采用高效液相色谱法检测供试品溶液,填充剂采用十八烷基硅烷键合硅胶,以乙腈和含磷酸的水溶液为流动相,进行梯度洗脱,梯度洗脱程序包括,0→15min→50min→60min→70min→80min→90min,流动相中乙腈的体积百分数为4%→4%→11%→20%→25%→30%→40%;检测波长为210-280nm,柱温25-40℃,所述中药组合物包括生地黄、熟地黄、芍药、山药、川续断、黄芩、黄柏和生甘草。
根据本发明任一项所述的构建方法,其中,步骤(1)包括:
1)取供试品,加溶剂提取,得到提取液;
2)将提取液固液分离,取液体,即为供试品溶液。
根据本发明任一项所述的构建方法,还满足如下A-D中的任意一项或者多项:
A、步骤1)中,溶剂选自甲醇、乙醇、甲醇水溶液或者乙醇水溶液;
B、步骤1)中供试品的质量与溶剂的体积之比为0.1-0.3:20-50,质量与体积的比例关系为g/mL;
C、步骤1)中,提取方式为回流提取或者超声提取,提取时间为15min-1h;
D、步骤2)中,所述固液分离为离心或者过滤。
进一步地,步骤(2)高效液相色谱法的色谱条件还包括:流速为0.8-1.2ml/min,进样量为2-20μl;和/或,色谱柱采用Agilene 5TC-C18 5μm,250×1.6mm柱、Diamonsil C185μm,250×1.6mm柱或者WondaSil C18 5μm,250×1.6mm柱;和/或,柱温25-40℃。
进一步地,步骤(2)中含磷酸的水溶液的体积百分数为0.05-2%;和/或,梯度洗脱程序还包括:90→100min,流动相中乙腈的体积百分数为40%→4%;和/或,检测波长为230nm。
某些优选的实施方式中,构建方法还包括,采用没食子酸对照品、马钱苷酸对照品、盐酸黄柏碱对照品、芍药内酯苷对照品、芍药苷对照品、甘草苷对照品、黄芩苷对照品、盐酸小檗碱对照品、汉黄芩苷对照品、黄芩素对照品中的至少一种制备对照品溶液的步骤,以及按照上述任一所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照品溶液得到对照品的参照峰的步骤。
进一步地,所述对照品溶液的制备方法包括,取没食子酸对照品、马钱苷酸对照品、盐酸黄柏碱对照品、芍药内酯苷对照品、芍药苷对照品、甘草苷对照品、黄芩苷对照品、盐酸小檗碱对照品、汉黄芩苷对照品、黄芩素对照品适量,加溶剂制成每1ml含没食子酸1-10μg、马钱苷酸15-50μg、盐酸黄柏碱2-20μg、芍药内酯苷15-50μg、芍药苷30-70μg、甘草苷15-50μg、黄芩苷80-130μg、盐酸小檗碱15-50μg、汉黄芩苷15-50μg、黄芩素15-50μg的混合溶液。其中,所述溶剂可以为甲醇,也可以为体积百分数不小于30%的甲醇水溶液或者乙醇水溶液。
根据本发明任一项所述的构建方法,所述中药组合物及其制剂选自中药组合物和中药组合物的制剂中的至少一种。
例如,所述中药组合物可以通过如下方法制成,按照选定的重量份数称取生地黄、熟地黄、芍药、山药、川续断、黄芩、黄柏和生甘草,混合后按常规提取方法提取或者分别按常规提取方法提取后混合,即得。所述常规提取方法包括煎煮提取、浸渍提取、渗漉提取、回流提取、超声提取和水蒸气蒸馏提取中的一种或几种;提取溶剂选自水或体积百分数为5-98%的醇溶液;提取次数至少为1次(例如1-3次);提取时间至少为10min(例如10min-1h),或者使得提取液体积缩小至提取溶剂加入体积的1/2-3/4;提取溶剂的体积与原料药重量的比值≥5mL/g(例如5-30mL/g)。
其中,中药组合物的制剂是由中药组合物提取后得到的提取液(例如水煎煮后得到的汤剂)按照药学上常规工艺,加入或者不加药学上常规辅料制成的中药制剂。所述中药组合物的制剂可以但不局限于干粉剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、软膏剂、溶液剂等。
进一步地,本发明提供的中药组合物及其制剂特征图谱的构建方法可以同时适用于中药组合物、中药组合物的标准汤剂冻干粉和中药组合物的颗粒剂,即所述中药组合物及其制剂选自中药组合物、中药组合物的标准汤剂冻干粉(也称保阴煎物质基准样品粉末)和中药组合物的颗粒剂中的至少一种。
进一步地,所述中药组合物和/或其制剂的特征图谱呈现10个特征峰,与黄芩苷对照品参照物峰相应的峰为参比峰,各特征峰与参比峰的相对保留时间在规定值的±5%的范围之内,规定值为:0.177(峰1)、0.408(峰2)、0.469(峰3)、0.595(峰4)、0.669(峰5)、0.853(峰6)、1.000(峰7)、1.642(峰8)、1.859(峰9)、2.018(峰10)。
进一步地,所述中药组合物包括生地黄6-9重量份、熟地黄6-9重量份、芍药6-9重量份、山药4-7重量份、川续断4-7重量份、黄芩4-7重量份、黄柏4-7重量份和生甘草3-4重量份。
进一步地,所述中药组合物包括生地黄7.5重量份、熟地黄7.5重量份、芍药7.5重量份、山药5.6重量份、川续断5.6重量份、黄芩5.6重量份、黄柏5.6重量份和生甘草3.7重量份。
例如,所述中药组合物可以通过如下方法制成,按照选定的重量份数称取生地黄、熟地黄、芍药、山药、川续断、黄芩、黄柏和生甘草,混合后按常规提取方法提取或者分别按常规提取方法提取后混合,即得。所述常规提取方法包括煎煮提取、浸渍提取、渗漉提取、回流提取、超声提取和水蒸气蒸馏提取中的一种或几种;提取溶剂选自水或体积百分数为5-98%的醇溶液;提取次数至少为1次;提取时间至少为10min;提取溶剂的体积与原料药重量的比值≥2L/kg。
其中,中药组合物的制剂是由中药组合物提取后得到的提取液(例如煎煮后得到的汤剂)按照药学上常规工艺,加入或者不加药学上常规辅料制成的中药制剂。优选地,所述中药组合物的制剂可以但不局限于干粉剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、软膏剂、溶液剂等。
本发明还提供了一种中药组合物及其制剂的质量检测方法,包括将待测产品的特征图谱与所述的中药组合物和/或其制剂的对照特征图谱进行比较的步骤;所述待测产品的特征图谱为使用待测产品按照上述任一所述的构建方法得到;所述中药组合物包括生地黄、熟地黄、芍药、山药、川续断、黄芩、黄柏和生甘草,所述的中药组合物和/或其制剂的的对照特征图谱选自如下(1)-(4)中的任意一项:
(1)其具有10个特征峰,与黄芩苷对照品参照物峰相应的峰为参比峰,各特征峰与参比峰的相对保留时间在规定值的±5%的范围之内,规定值为:0.177(峰1)、0.408(峰2)、0.469(峰3)、0.595(峰4)、0.669(峰5)、0.853(峰6)、1.000(峰7)、1.642(峰8)、1.859(峰9)、2.018(峰10)。;
(2)其具有10个特征峰,分别与上述方法构建得到的没食子酸对照品、马钱苷酸对照品、盐酸黄柏碱对照品、芍药内酯苷对照品、芍药苷对照品、甘草苷对照品、黄芩苷对照品、盐酸小檗碱对照品、汉黄芩苷对照品和黄芩素对照品的参照峰相对应;
(3)使用单批次或者多批次中药组合物和/或其制剂按照上述任一所述的构建方法得到的特征图谱;
(4)使用多批次中药组合物和/或其制剂按照上述任一所述的构建方法得到的特征图谱通过平均值或者中位数法制成对照特征图谱。
所述待测产品选自包括生地黄、熟地黄、芍药、山药、川续断、黄芩、黄柏和生甘草的中药组合物或者该中药组合物的制剂。中药组合物和中药组合物的制剂同前述论述。
可选的,至少采用3批中药组合物或者中药组合物的制剂得到对照特征谱图,例如采用3个批次的保阴煎物质基准样品粉末、15个批次的保阴煎物质基准样品粉末、15批保阴煎颗粒。
某些实施方式中,利用中药色谱指纹图谱相似度评价软件生成中药组合物及其制剂的对照特征图谱。
某些优选的实施方式中,利用中药色谱指纹图谱相似度评价软件生成中药组合物及其制剂的对照特征图谱后还包括标记共有特征峰的步骤。
本发明技术方案,具有如下优点:
1.本发明提供的中药组合物及其制剂的特征图谱的构建方法,以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,乙腈和含磷酸的水溶液为流动相,梯度洗脱,经大量实验筛选得到特定的洗脱程序,并控制检测波长为210-280nm,柱温25-40℃,得到10个共有特征峰,分别与没食子酸对照品、马钱苷酸对照品、盐酸黄柏碱对照品、芍药内酯苷对照品、芍药苷对照品、甘草苷对照品、黄芩苷对照品、盐酸小檗碱对照品、汉黄芩苷对照品、黄芩素对照品的参照峰相对应,出峰个数明显增加且特征峰的分离效果明显提高,峰形好,基线平稳,检测时间短,为该中药组合物及其制剂的质量检测和控制提供依据,能充分的反映该中药组合物及制剂的整体性和特征性,方法操作简单,设备普遍,能适用于该中药组合物和不同的制剂类型的质量控制。
2.本发明提供的中药组合物及其制剂的特征图谱的构建方法,经对照品指认,1号峰为没食子酸峰、2号峰为马钱苷酸峰、3号峰为盐酸黄柏碱峰、4号峰为芍药内酯苷峰、5号峰为芍药苷峰、6号峰为甘草苷峰、7号峰为黄芩苷峰、8号峰为盐酸小檗碱峰、9号峰为汉黄芩苷峰、10号峰为黄芩素峰,分离均良好,面积适中,以它为参照可通过定性方式实现该中药组合物及制剂质控的精确性。
3.本发明提供的中药组合物及其制剂的的质量检测方法,包括特征图谱构建方法,通过比对待测产品的特征图谱以及所述的中药组合物和/或其制剂的的可以检测该中药组合物及其制剂的质量,该方法可以从整体上检测控制中药组合物和制剂,且方法操作简单,精密度高、稳定性好、重复性好、分析速率快。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实验例1中不同波长的色谱图;自上而下依次为190nm、210nm、230nm、254nm、265nm、280nm;
图2为本发明实验例1中不同流动相的色谱图;
图3为本发明实验例1中不同梯度洗脱程序的色谱图;
图4为本发明实验例1中不同柱温的色谱图;
图5为本发明实验例1中不同色谱柱的色谱图;
图6为本发明实验例1中不同提取溶剂的色谱图;
图7为本发明实验例1中不同提取时间的色谱图;
图8为本发明实验例1中保阴煎物质基准样品粉末的对照特征图谱;
图9为本发明实验例1中15批保阴煎物质基准样品粉末的特征图谱;
图10为本发明实验例1中混合对照品溶液的色谱图图;
图11为本发明实验例1中保阴煎物质基准样品粉末的特征图谱;
图12为本发明实验例2中空白溶剂的色谱图;
图13为本发明实验例2中精密度色谱图;
图14为本发明实验例2中重复性色谱图;
图15为本发明实验例2中稳定性色谱图。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明,并不局限于所述最佳实施方式,不对本发明的内容和保护范围构成限制,任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品,均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者,按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规试剂产品。本发明中,0.1%的磷酸溶液是指体积百分数为0.1%的磷酸水溶液。
实验例1
1、仪器与试药:
LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司),SPD-M20A紫外检测器,LC-2010高效液相色谱仪(日本岛津公司),CBM-20A高效液相色谱仪(日本岛津公司),SPD-10AVP紫外检测器,BT.125D型电子分析天平购于德国赛多利斯公司,DZF-6050型真空干燥箱购于上海一恒科技有限公司,DHP-420型电热恒温培养箱购于北京市永光明医疗仪器有限公司,综合药品稳定性试验箱BXZ-250S购于上海博迅实业有限公司,KQ-250型超声波清洗机购于昆山市超声仪器有限公司。高效实验型实验室超纯水机RM-220购于四川沃特尔科技发展有限公司。
没食子酸对照品(批号:110831-201605)购于中国药品生物制品检定所,规格为供含量测定用;马钱苷酸对照品(批号:111865-201704)购于中国药品生物制品检定所,规格为供含量测定用;盐酸黄柏碱对照品(批号:111895-201504)购于中国药品生物制品检定所,规格为供含量测定用;芍药内酯苷对照品(批号:MUST-18041601)购于成都曼斯特生物科技有限公司,规格为供含量测定用;芍药苷对照品(批号:110736-201741)购于中国药品生物制品检定所,规格为供含量测定用;甘草苷对照品(批号:111610-201607)购于中国药品生物制品检定所,规格为供含量测定用;黄芩苷对照品(批号:110715-201720)购于中国药品生物制品检定所,规格为供含量测定用;盐酸小檗碱对照品(批号:110713-201613)购于中国药品生物制品检定所,规格为供含量测定用;汉黄芩苷对照品(批号:112002-201702)购于中国药品生物制品检定所,规格为供含量测定用;黄芩素对照品(批号:111595-201607)购于中国药品生物制品检定所,规格为供含量测定用。甲醇、乙腈(色谱级,Fisher Co.Ltd);水:娃哈哈饮用纯净水;甲醇、乙醇:分析纯,北京化工厂。
保阴煎物质基准样品,处方:生地黄7.5g、熟地黄7.5g、芍药7.5g、山药5.6g、川续断5.6g、黄芩5.6g、黄柏5.6g、生甘草3.7g;制法:以上八味,加水600ml,煎煮至约400ml,滤过,冷冻干燥,粉碎,即得。15批保阴煎物质基准样品分别采用不同批次的上述八味药制成。
稀乙醇:药典术语,即取乙醇529ml,加水稀释至1000ml,即得。
2、中药组合物及其制剂特征图谱的构建方法
供试品溶液的制备:取保阴煎物质基准样品粉末约0.2g,精密称定,置50ml量瓶中,加入稀乙醇35ml,超声处理(功率240W,频率40kHz)30分钟,使完全分散,放冷,加稀乙醇至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
高效液相色谱法测试:以十八烷基键合硅胶为填充剂(Agilene 5TC-C18 5μm,250×1.6mm);以乙腈为流动相A,以0.1%磷酸溶液为流动相B,按下表中的规定进行梯度洗脱;流速为每分钟1.0ml;柱温为30℃;进样量10μl,检测波长为230nm。
表1梯度程序
3、色谱条件的选择
3.1波长选择
取保阴煎物质基准样品粉末0.2g,精密称定,置50ml量瓶中,加稀乙醇35ml,超声处理(功率240W,频率45KHZ)30分钟,放冷,加稀乙醇至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得供试品溶液,注入高效液相色谱仪,分别在190nm、210nm、230nm、254nm、265nm、280nm下测试,其余色谱条件如本实验例第2项记载,结果如图1所示。从图中可以看出,210-280nm下基线平稳、峰形好,色谱峰分离度较好,其中230nm下的色谱峰分离度最好、出峰个数最多,峰形较好,故优选230nm为检测波长。
3.2流动相的选择
按照本实验例第2项制备供试品溶液,考察下述三组流动相,以乙腈为流动相A,以水为流动相B(流动相1);以乙腈为流动相A,以0.1%磷酸溶液为流动相B(流动相2);以甲醇为流动相A,以0.1%磷酸溶液为流动相B(流动相3)对特征峰的影响;按下表中的规定进行梯度洗脱,分别精密吸取供试品溶液10μl注入液相色谱仪,区别仅在于流动相不同,其余色谱条件如本实验例第2项记载,记录色谱图,结果见图2。
表2梯度程序
从图2可以看出,相比于流动相1和流动相3来说,流动相2具有明显更优的分离效果,出峰个数也明显增加且峰形更好,故选择流动相2。
3.3梯度程序的选择
按照本实验例第2项制备供试品溶液,考察梯度洗脱程序对特征峰的影响,分别按下表中的规定进行梯度洗脱,分别精密吸取供试品溶液10μl注入液相色谱仪,区别仅在于梯度洗脱程序不同,其余色谱条件如本实验例第2项记载,记录色谱图,结果见图3。
表3梯度洗脱程序
从图3可以看出,相比于梯度1和梯度2来说,梯度3具有明显更优的分离效果、出峰个数也明显增加且峰形好,故选择梯度3。
3.4柱温的选择
按照本实验例第2项制备供试品溶液,考察下述三组柱温,①柱温:室温25℃;②柱温:30℃;③柱温:40℃;对色谱图的影响;分别精密吸取供试品溶液10μl注入液相色谱仪,区别仅在于柱温不同,其余色谱条件如本实验例第2项记载,记录色谱图,结果见图4。
25℃-40℃可以展示较多特征峰,当柱温箱温度高于35℃(例如40℃)特征峰个数变少、基线漂移且分离度稍变差,因此,柱温优选25-35℃。
3.5色谱柱的选择
按照本实验例第2项制备供试品溶液,考察下述三组色谱柱,色谱柱1:Agilene5TC-C18 5μm,250×1.6mm;色谱柱2:Diamonsil C18 5μm,250×1.6mm;色谱柱3:WondaSilC18 5μm,250×1.6mm;对色谱图的影响;分别精密吸取供试品溶液10μl注入液相色谱仪,区别仅在于色谱柱不同,其余色谱条件如本实验例第2项记载,记录色谱图,结果见图5。
相比于其他两种色谱柱,Agilene 5TC色谱柱分离效果更好一些,所得图谱的峰面积的响应值较高、峰的个数较稳定,保持一致,故优选Agilene 5TC色谱柱。
3.6检测时间
流动相2对应的色谱图显示,在90分钟后,基本无色谱峰出现。
4、供试品溶液的制备
(1)提取溶剂的考察
分别取三份保阴煎物质基准样品粉末0.2g,精密称定,置50ml量瓶中,分别精密加稀乙醇、甲醇、乙醇35ml,超声处理(功率240W,频率45KHZ)30分钟,放冷,分别加稀乙醇、甲醇、乙醇至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得,精密吸取续滤液10μl,分别注入液相色谱仪,记录色谱图,采用高效液相色谱法按本实施例第2项下色谱条件测定,结果见图6所示。
小结:由记录的色谱图可知:稀乙醇、甲醇、乙醇超声提取得到的色谱图的峰响应值和峰的个数基本一致。
(2)提取时间的考察
分别取三份保阴煎物质基准样品粉末0.2g,精密称定,置50ml量瓶中,分别精密加稀乙醇35ml,分别超声处理(功率240W,频率45KHZ)15、20、30、45、60分钟,放冷,分别加稀乙醇至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。精密吸取续滤液10.0μl,注入液相色谱仪,采用高效液相色谱法按本实施例第2项下色谱条件测定,结果见图7所示。提取时间在15~60分钟,得到的色谱图的峰响应值和峰的个数能基本一致。为了保证完全提取,选择提取时间为30分钟。
5、保阴煎物质基准样品粉末的对照特征图谱的建立以及特征峰确认
取15批保阴煎物质基准样品粉末分别按照本实施例第2项下方法制备供试品溶液并测定,获得15批保阴煎物质基准样品粉末的特征图谱,将这些特征图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)中进行共有峰指认与对照指纹图谱建立,建立了保阴煎物质基准样品粉末的对照特征图谱,结果见图8所示,其中图8中S1是保阴煎物质基准样品粉末的对照特征图谱,图9分别为15批保阴煎物质基准样品粉末的特征图谱。
对照特征图谱中呈现10个特征峰,与黄芩苷参照物峰相应的峰为S峰,各特征峰与S峰的相对保留时间为规定值,规定值:0.177(峰1)、0.408(峰2)、0.469(峰3)、0.595(峰4)、0.669(峰5)、0.853(峰6)、1.000(峰7)、1.642(峰8)、1.859(峰9)、2.018(峰10)。对于15批保阴煎物质基准样品粉末的特征图谱中各特征峰与S峰的相对保留时间均在规定值的±5%之内。
对照特征图谱中呈现10个特征峰,其中10个峰应分别与相应的参照物峰保留时间相同。相应的参照物分别为没食子酸对照品、马钱苷酸对照品、盐酸黄柏碱对照品、芍药内酯苷对照品、芍药苷对照品、甘草苷对照品、黄芩苷对照品、盐酸小檗碱对照品、汉黄芩苷对照品和黄芩素对照品。
取没食子酸对照品、马钱苷酸对照品、盐酸黄柏碱对照品、芍药内酯苷对照品、芍药苷对照品、甘草苷对照品、黄芩苷对照品、盐酸小檗碱对照品、汉黄芩苷对照品、黄芩素对照品适量,加甲醇制成每1ml含没食子酸5.9μg、马钱苷酸23μg、盐酸黄柏碱9μg、芍药内酯苷26.3μg、芍药苷56.2μg、甘草苷25.7μg、黄芩苷110.4μg、盐酸小檗碱35μg、汉黄芩苷35.7μg、黄芩素23.4μg的混合溶液,即得对照品溶液,采用高效液相色谱法按本实施例第2项下色谱条件测定,制得对照品图谱,见图10所示。将保阴煎物质基准样品粉末供试品图谱与对照品图谱比对,指认特征峰,见图11所示。
小结:对照特征图谱中呈现10个特征峰,其中10个峰应分别与相应的参照物峰保留时间相同;与黄芩苷参照物峰相应的峰为S峰,计算各特征峰与参照峰(S)的相对保留时间,其相对保留时间应在规定值的±5%之内。规定值为:0.177(峰1)、0.408(峰2)、0.469(峰3)、0.595(峰4)、0.669(峰5)、0.853(峰6)、1.000(峰7)、1.642(峰8)、1.859(峰9)、2.018(峰10)。
实验例2方法学验证
1、空白干扰考察
空白溶剂:稀乙醇。
精密量取10μl稀乙醇溶液,注入液相色谱仪,按实验例1第2项的色谱条件项下条件测定,记录稀乙醇的色谱图,结果表明:稀乙醇对本品特征图谱的测定没有干扰,结果见图12。
2、精密度试验:取保阴煎物质基准样品,按实验例1第2项下方法制备供试品溶液,连续进样6次,记录其特征图谱。以7号色谱峰(黄芩苷)为参照峰,计算特征峰相对保留时间见表4、相对峰面积见表5,结果显示各主要共有色谱峰的相对保留时间的RSD<1.0%,相对峰面积的RSD<5.0%,表明仪器精密度良好,如图13。
表4仪器精密度试验结果表(相对保留时间)
表5、仪器精密度试验结果表(相对保留峰面积)
3、重复性试验:取保阴煎物质基准样品6份,按实验例1第2项下方法平行制备供试品溶液6份,分别测定,记录其特征图谱。以7号色谱峰(黄芩苷)为参照峰,计算各特征峰相对保留时间见表6、相对峰面积见表7,结果显示各主要共有色谱峰的相对保留时间的RSD<1.0%,相对峰面积的RSD<5.0%,表明该方法重复性良好,如图14。
表6重复性试验结果表(相对保留时间)
表7重复性试验结果表(相对保留峰面积)
4、稳定性试验:取保阴煎物质基准样品,按实验例1第2项下方法制备供试品溶液,常温放置,24小时内每隔一定时间,进样6次,记录其特征图谱。以7号色谱峰(黄芩苷)为参照峰,计算各特征峰相对保留时间见表8、相对峰面积见表9,结果显示各主要共有色谱峰的相对保留时间的RSD<1.0%,相对峰面积的RSD<5.0%,表明供试品溶液在24小时内稳定,如图15。
表8稳定性试验结果表(相对保留时间)
表9稳定性试验结果表(相对保留峰面积)
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种中药组合物及其制剂的特征图谱的构建方法,其特征在于,包括以下步骤,
(1)供试品溶液的制备;
(2)采用高效液相色谱法检测供试品溶液,填充剂采用十八烷基硅烷键合硅胶,以乙腈和含磷酸的水溶液为流动相,进行梯度洗脱,梯度洗脱程序包括,0→15min→50min→60min→70min→80min→90min,流动相中乙腈的体积百分数为4%→4%→11%→20%→25%→30%→40%;检测波长为210-280nm,柱温25-40℃,所述中药组合物包括生地黄、熟地黄、芍药、山药、川续断、黄芩、黄柏和生甘草。
2.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,步骤(1)包括:
1)取供试品,加溶剂提取,得到提取液;
2)将提取液固液分离,取液体,即为供试品溶液。
3.根据权利要求2所述的构建方法,其特征在在于,步骤(1)还满足如下A-D中的任意一项或者多项:
A、步骤1)中,溶剂选自甲醇、乙醇、甲醇水溶液或者乙醇水溶液;
B、步骤1)供试品的质量与溶剂的体积之比为0.1-0.3:20-50,质量与体积的比例关系为g/mL;
C、步骤1)中,提取方式为回流提取或者超声提取,提取时间为15min-1h;
D、步骤2)中,所述固液分离为离心或者过滤。
4.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,步骤(2)高效液相色谱法的色谱条件还包括:流速为0.8-1.2ml/min,进样量为2-20μl;和/或,色谱柱采用Agilene 5TC-C185μm,250×1.6mm柱、Diamonsil C18 5μm,250×1.6mm柱或者WondaSil C18 5μm,250×1.6mm柱;和/或,柱温为25-35℃。
5.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,步骤(2)中含磷酸的水溶液的体积百分数为0.05-2%;和/或,梯度洗脱程序还包括:90→100min,流动相中乙腈的体积百分数为40%→4%;和/或,检测波长为230nm。
6.根据权利要求1-5中任一所述的构建方法,其特征在于,所述的构建方法还包括,采用没食子酸对照品、马钱苷酸对照品、盐酸黄柏碱对照品、芍药内酯苷对照品、芍药苷对照品、甘草苷对照品、黄芩苷对照品、盐酸小檗碱对照品、汉黄芩苷对照品、黄芩素对照品中的至少一种制备对照品溶液的步骤,以及按照权利要求1-5中任一所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照品溶液得到对照品的参照峰的步骤。
7.根据权利要求6所述的构建方法,其特征在于,所述对照品溶液的制备方法包括,取没食子酸对照品、马钱苷酸对照品、盐酸黄柏碱对照品、芍药内酯苷对照品、芍药苷对照品、甘草苷对照品、黄芩苷对照品、盐酸小檗碱对照品、汉黄芩苷对照品、黄芩素对照品适量,加溶剂制成每1ml含没食子酸1-10μg、马钱苷酸15-50μg、盐酸黄柏碱2-20μg、芍药内酯苷15-50μg、芍药苷30-70μg、甘草苷15-50μg、黄芩苷80-130μg、盐酸小檗碱15-50μg、汉黄芩苷15-50μg、黄芩素15-50μg的混合溶液。
8.根据权利要求1-5中任一所述的构建方法,其特征在于,所述中药组合物和/或其制剂的特征图谱呈现10个特征峰,与黄芩苷对照品参照物峰相应的峰为参比峰,各特征峰与参比峰的相对保留时间在规定值的±5%的范围之内,规定值为:0.177(峰1)、0.408(峰2)、0.469(峰3)、0.595(峰4)、0.669(峰5)、0.853(峰6)、1.000(峰7)、1.642(峰8)、1.859(峰9)、2.018(峰10)。
9.根据权利要求1-5中任一所述的构建方法,其特征在于,所述中药组合物包括生地黄6-9重量份、熟地黄6-9重量份、芍药6-9重量份、山药4-7重量份、川续断4-7重量份、黄芩4-7重量份、黄柏4-7重量份和生甘草3-4重量份。
10.一种中药组合物及其制剂的质量检测方法,其特征在于,包括将待测产品的特征图谱与所述的中药组合物和/或其制剂的对照特征图谱进行比较的步骤;所述待测产品选自包括生地黄、熟地黄、芍药、山药、川续断、黄芩、黄柏和生甘草的中药组合物或者该中药组合物的制剂;所述待测产品的特征图谱为使用待测产品按照权利要求1-9中任一所述的构建方法得到;所述的中药组合物和/或其制剂的的对照特征图谱选自如下(1)-(4)中的任意一项:
(1)其具有10个特征峰,与黄芩苷对照品参照物峰相应的峰为参比峰,各特征峰与参比峰的相对保留时间在规定值的±5%的范围之内,规定值为:0.177(峰1)、0.408(峰2)、0.469(峰3)、0.595(峰4)、0.669(峰5)、0.853(峰6)、1.000(峰7)、1.642(峰8)、1.859(峰9)、2.018(峰10);
(2)其具有10个特征峰,分别与权利要求6或7任一所述的构建方法得到的没食子酸对照品、马钱苷酸对照品、盐酸黄柏碱对照品、芍药内酯苷对照品、芍药苷对照品、甘草苷对照品、黄芩苷对照品、盐酸小檗碱对照品、汉黄芩苷对照品、黄芩素对照品的参照峰相对应;
(3)使用单批次或者多批次中药组合物和/或其制剂按照权利要求1-9中任一所述的构建方法得到的特征图谱;
(4)使用多批次中药组合物和/或其制剂按照权利要求1-9中任一所述的构建方法得到的特征图谱通过平均值或者中位数法制成对照特征图谱。
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