CN1158992A - 用光散射测定阿马多利化合物的方法 - Google Patents

用光散射测定阿马多利化合物的方法 Download PDF

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Abstract

为了借助于利用光散射的简便的光学方法定量地测定阿马多利化合物，向池3中的含有阿马多利化合物试样照射来自He-Ne激光器的激发光，接受该试样的散射光并分光，得到光散射光谱。通过检测器23检测出用以决定该散射光谱中相对于激发波长的偏移波数并存在于820-840cm-1、1655-1660cm-1、2000-2020cm-1、2080-2100cm-1、2460-2470cm-1或2530-2600cm-1的光散射光谱。使用该光散射峰的峰强度或积分值，用检量线测定阿马多利化合物的糖化物浓度或糖化率。

Description

用光散射测定阿马多利化合物的方法
本发明涉及定量测定糖化白蛋白、糖化血红蛋白、糖化球蛋白等的阿马多利(Amadori)化合物的方法。
阿马多利化合物是具有蛋白质、肽或氨基酸类的氨基的物质(以下称蛋白质等)和醛糖类还原性糖共存时，一部分氨基和醛基非酶地，且不可逆地结合，进行阿马多利转位而生成的。阿马多利化合物的生成速度，用反应性物质浓度、接触时间、温度等函数表示。因此，可认为从其生成量可得到与物质有关的各种信息，所说的物质含有其反应性物质。作为含有阿马多利化合物的物质，有酱油等食品、血液等体液。
例如，在生物体中，葡萄糖和氨基酸结合，生成阿马多利化合物的果糖氨基衍生物。将血液中的血红蛋白被糖化后的果糖氨基衍生物称为糖血红蛋白、将血液中的白蛋白被糖化后的果糖氨基衍生物称为糖白蛋白、将血液中的蛋白质被糖化后的果糖氨基衍生物称为果糖胺。这些果糖氨基衍生物在血中浓度，反映了过去一定时期的平均血糖值，由于其测定值是糖尿病症状诊断及管理的重要指标，所以确立阿马多利化合物测定手段，在临床上是极其有用的。另外，通过定量食品中的阿马多利化合物，可知道其食品制造后的保存状况及时间，在质量管理上很起作用。
这样，阿马多利化合物的定量分析，在包括医学及食品的广范围内是有用的。
以往，作为阿马多利化合物的定量法，已知有利用高速液相色谱的方法(参照chromatogr.Sci.，10，659(1979))、使用充填结合硼酸的固体的柱的方法(参照clin.chem.，28，2088(1982))、电泳法(参照clin.chem.，26，1598(1980))、利用抗原-抗体反应的方法(参照J.JCLA，18，620(1993)，机器·试剂，16，33-37(1993))、果糖胺的测定法(参照clin，chem.Acta，127，87-95(1982))、在使用硫代巴比士酸氧化后比色定量方法(参照clin.chem.Acta，112，179-204(1981))、放射免疫法(RIA)法等。
电泳法及色谱法，在测定上费时间、操作繁杂，蛋白质绝对量的测定值，受到混合物质中亲合力大小接近的物质影响，而难以准确地定量测定。
RIA法，灵敏度、特异性及再现性优良，但标识过程繁杂。
果糖胺测定法是利用果糖胺在碱溶液中的还原力的方法，但由于受到其他还原物质影响，有容易产生测定误差的缺点。
只要能将光照射在物质上，使用其光散射光谱，定量糖化蛋白质等的阿马多利化合物，就是简便而有效的，但目前尚没有利用这种光散射光谱测定阿马多利化合物的报告。
因此，本发明的目的在于提供一种利用光散射的简便光学方法，定量测定阿马多利化合物的方法。
在本发明中，在含有阿马多利化合物的试样上照射单一波长的激发光，接受来自该试样的散射光、进行分光，得到光散射光谱，在该光散射光谱中使用，作为相对于激发光波长的偏移波数(波矢)，存在于820-840cm-1、1655-1660cm-1、2000-2020cm-1、2080-2100cm-1、2460-2470cm-1或2530-2600cm-1的光散射峰值，定量测定阿马多利化合物。
在含有阿马多利化合物的试样中，照射单一波长的激发光得到的光散射光谱，光散射峰与荧光光谱重叠。若进行除去该荧光光谱部分的运算操作，可容易地求出光散射峰中任何一个峰的峰强度或积分值。这样，按照求得的光散射峰的峰强度或积分值，可定量测定阿马多利化合物。
这样，在本发明中，在试样中照射单一波长的激发光，因为只从其试样接受散射光并分光，所以可通过简便的光学测定法，定量测定阿马多利化合物。
其中的定量测定，既包括测定试样中阿马多利化合物量；也包括测定试样中蛋白质等的糖化率。糖化率定义如下：
(阿马多利化合物)/(阿马多利化合物+蛋白质等)。
其中任何一个测定值，都是通过检量线求出的。
在得到的光散射光谱中，荧光光谱是反映(阿马多利化合物+蛋白质等)的总和。因此，对于测定蛋白质等的糖化率的优选方法，是通过使用光散射光谱的光散射峰中任何一个峰的峰强度或积分值I，与在光散射光谱中，作为对于激发波长的偏移波数，除了820-840cm-1、1655-1660cm-1、2000-2020cm-1、2080-2100cm-1、2460-2470cm-1或2530-2600cm-1之外的任意规定的波数领域的积分值S的比I/S，可正确地进行测定。
图1A，1B是分别表示糖化率24.1％、58.2％的人体血清白蛋白的光散射光谱图。
图2是表示高浓度的葡萄糖水溶液的光散射光谱图。
图3是表示进行从图1A、图1B光谱除去荧光光谱的运算操作后的各个光散射光谱图。
图4是表示光散射光谱的一个峰的峰强度和糖化率关系的检量线。
图5是表示光散射光谱的一个峰的峰积分值和糖化率关系的检量线。
图6是表示白蛋白浓度与荧光光谱积分值的关系图。
图7A，7B，分别是添加分解酶前、添加分解酶后的阿马多利化合物的光散射光谱图。
图8是表示N*-Z-lysine的光散射光谱图。
图9是表示图7A，7B的测定的，刚添加分解酶不久，光散射峰随时间变化图。
图10是表示实施本发明的测定装置的一个例子的流程图。
图11A，11B是同一测定装置的其他分析池部分的例子，是表示分别取出180°增强散射、90°增强散射例子的断面图。
图12A是表示除去荧光光谱后的人血中血红蛋白的光散射光谱，图12B示出血红蛋白浓度与荧光光谱积分值的关系。
图13A，13B分别示出缬氨酸，糖化缬氨酸的光散射光谱。
图1A，1B所示的光散射光谱，是在浓度为10mg/dl的人体血清白蛋白水溶液中，照射He-Ne激光装置(输出7mw)的激光(波长632.8nm)，激发得到的图，图1A是糖化率24.1％、图1B是糖化率58.2％的人体血清白蛋白水溶液。横轴是用波数表示来自He-Ne激光波长的光散射偏移，纵轴是散射光强度。
图1A，1B是两个光散射光谱，在同一光散射偏移位置上显示尖锐峰，糖化率越大其峰强度也越大。另外，测定与图1A，1B试样相同浓度的葡萄糖水溶液的光散射光谱，未观察到峰等图形。若将葡萄糖水溶液浓度作成10000mg/dl的高浓度，测定其光散射光谱时，可得到图2所示的光谱，在此，显示了若干个峰，但与图1所示的尖锐峰位置不同。其结果表明，图1A、1B的尖锐的光散射峰，不是由于葡萄糖产生的光散射峰，而是由于糖化白蛋白产生的光散射峰。
在图1A、1B的光谱中，山形的大而平稳的峰是来自白蛋白和糖化白蛋白的荧光，由糖化白蛋白引起的光散射峰，与该大的荧光峰重叠，从荧光峰突出并被显示。
糖化白蛋白的光散射峰，作为来自He-Ne激光波长的偏移波数，存在于830cm-1、1658cm-1、2009cm-1、2082cm-1、2463cm-1及2544cm-1附近。
从图1A、1B的光散射光谱中除去荧光光谱部分作为背景信号的光谱，分别表示在图3A，3B中。这样，通过除去荧光光谱部分，可容易求出光散射峰的峰强度及峰积分值(面积)。
图4是对于糖化率不同的人体血清白蛋白水溶液的标准试样表示了糖化率和，如图3A，3B所示的，除去荧光光谱部分后的峰高的关系图。进行过测定的峰，作为来自He-Ne激光波长的偏移波数，是1658cm-1附近的峰。标准试样的人血清白蛋白水溶液，作为糖化率24.1％的及58.2％的市售品，可得到。其他的糖化率的标准试样，是通过调合这些市售标准试样而制得。图4所示的标准试样的糖化率，为24.1％、31.3％、38.7％、45.5％、51.9％及58.2％。这些标准试样的糖化率值，是用全自动葡萄糖白蛋白分级定量装置GAA-2000(株式会社京都第一科学制品)测定的值。
按照图4，由于糖化率与光散射峰的峰强度之间是直线关系，其结果可以作为糖化率的检量线使用。另外，由于测定该检量线用数据的标准试样的(糖化白蛋白+白蛋白)浓度是一定的，所以也可将该检量线，转用于表示糖化白蛋白浓度及光散射峰的峰强度关系的检量线。因此，若使用该检量线，对于未知试样，测定光散射光谱的峰强度后，可求出糖化率或糖化白蛋白浓度。
使用相同标准试样的光散射光谱的相同峰的积分值，测定糖化率与光散射积分值关系的结果，如图5所示。此时，在糖化率及峰积分值之间，可得到直线关系，也可利用该关系作为检量线。为此，对于未知试样，即使测定峰积分值，而不测定光散射光谱峰的峰强度，也可求出糖化率或糖化白蛋白浓度。
图4及图5的直线关系，即使对于图3A，3B所示的其他光散射峰，也同样成立。
当从图4或图5所示的峰强度或峰积分值对于糖化率的关系的检量线，求出未知试样的糖化率时，必须调节未知试样的浓度，使未知试样的(糖化白蛋白+白蛋白)浓度与标准试样的(糖化白蛋白+白蛋白)浓度相同，或必须换算测定值，以使(糖化白蛋白+白蛋白)浓度相同。另一方面，图1A，1B的光散射光谱，除了光散射峰之外，同时也可检出荧光光谱。图6是表示该荧光光谱中，来自He-Ne激光波长的偏移波数，对于(糖化白蛋白+白蛋白)浓度不同的标准试样，测定416.508～1434.74cm-1区域的积分值(纵轴强度)的结果。由于在(糖化白蛋白+白蛋白)浓度与荧光光谱的积分值之间，可得到直线关系，所以通过按照荧光光谱的积分值求出(糖化白蛋白+白蛋白)浓度，可修正从糖化白蛋白光散射峰的峰强度及峰积分值得到的糖化率。进行荧光光谱积分的波数区域，只要是显现荧光光谱的区域，可任意选择，但不限于上述一侧。
另外，以光散射峰中任何一个峰的峰强度或积分值I，与光散射光谱的荧光光谱部分任意规定的波数区域的积分值S的比I/S作为参数，对于糖化率不同的多个标准试样，可求出表示糖化率与I/S值关系的检量线，对于未知试样，若测定制作检量线时使用的光散射峰的I/S值，与该检量线一致时，可求出由白蛋白浓度修正的糖化率。
以上例子是对于糖化蛋白质中的糖化白蛋白进行测定的例子，但这些光散射峰，从糖化蛋白开始，在糖化肽、糖化氨基酸等的阿马多利化合物上，同样地被观测到。在阿马多利化合物中，临床上，重要的是糖化蛋白质的糖化白蛋白、糖化血红蛋白及果糖胺，但本发明对于其他的阿马多利化合物也同样适用。
作为实例，在图12A示出，将He-Ne激光照射到人血的血红蛋白水溶液(糖化率未知)得到光散射光谱，除去荧光光谱部分作为背景。在与图3A，图3B相同的喇曼偏移位置处可见到尖锐的峰。即使对血红蛋白，与图6相同，在图12B中示出对血红蛋白浓度不同的标准试样，测定荧光光谱适当区域的积分值(纵轴的强度)的结果。在此也可看到荧光光谱的积分值与血红蛋白浓度间呈直线关系。
图1A，1B的6个光散射峰，作为表示是在阿马多利化合物特有的峰的例子，在葡萄糖及氨基酸的结合部位(果糖结构)使用特异反应的果糖氨基酸氧化酶等，分解作为阿马多利化合物的糖化氨基酸，将所查出的这些峰的变化结果，表示在图7A，7B中。图7A是作为使其酶反应前的糖化氨基酸的N′-Fructosyl-Nα-Z-lysine(FZL)水溶液，通过He-Ne激光激发的光散射光谱。图7B表示的是在该试样溶液中，使糖化氨基酸分解酶反应后的光散射光谱，若与图7A的光谱相比，在阿马多利化合物中特有的峰的峰强度减少。图8是表示在FZL通过糖化氨基酸分解酶分解后生成的作为氨基酸的Nα-Z-lysine(αZL)的标准试样中，照射He-Ne激光激发得到的光散射光谱，观察不到图7A，7B显示的特异光散射光谱。
图9是在图7A，7B中，对于添加糖化氨基酸分解酶后的时间内，测定来自He-Ne激光波长的偏移波数1658cm-1峰的峰强度变化的结果。随着时间的推移，由于分解酶，糖化氨基酸发生分解，峰强度减少。由此表明，这些特征光散射峰，是由于糖与氨基酸结合的峰。
作为其他氨基酸的缬氨酸与作为其糖化氨基酸的糖化缬氨酸的光散射光谱分别示于图13A，图13B。糖化缬氨酸的光谱也具有阿马多利化合物所特有的峰。
图10是说明本发明测定光散射光谱的装置的一个例子。1是激发光源、例如可使用激光装置。作为激光装置，可使用连续振荡的Ar离子激光、Kr离子激光、He-Ne激光、He-Cd激光、Nd：YAG激光、或脉冲激光，可选择利用从近紫外线区域到近红外区域的广泛波长范围的激光。作为激光装置以外的光源，也可使用卤素灯等。在此，作为光源1，可使用He-Ne激光。2是控制光源1输出的电源装置。
4是带通滤波器，是为了从来自光源1的激光12，切去侧波带用的。激光12，通过半反射镜5分离成试样侧的激发光12s及对照侧的对照光12r，激发光12s经过用以切去由半反射镜5发生的波长光的带通滤波器7，用透镜9集光并入射到池3中。
池3是石英制的方筒状的散射光池，装有反应溶液，保持一定温度，如25℃。为了增强从池3的反应溶液发生的散射光，在激发光12s的入射方向，配置镜子11a，激发光12s透过池3后，通过用镜子11a反射，再入射到池3中而增强光散射。另外，在和激发光12s的入射方向成90°方向，沿向分光器22侧反射的方向配置镜子11b，从池3发生的散射光，含有被镜子11b反射的光，与激发光及雷利散射光一起用集光透镜16，20集光，通过滤波器21，集光在分光器22上。滤波器21的作用是，切去激发光及雷利散射光成分后，只是将从激光波长进行了波长偏移的散射光及荧光成分，入射到分光器22。作为分光器22及检出器23，使用借助沿着分光器22的分散方向配置多个检出元件的多色计的多通道检出方式。24是为从多通道检出器23，在每个波长取出输出的检出器控制器。
作为分光器22，使用扫描型分光器，作为检出器23，可作为具有单一检出元件的检出器。此时，为了对分光器22进行波长扫描，必须有分光器控制部25。
另一方面，用半反射镜5与激发光分开的对照光12r通过镜子6折曲到检测器30方向，经过用于切去在镜子6发生的波长光的带通滤波器8入射到检测器30中，检测光源强度。
数据处理运算·输出部31，用表示光源强度的对照光侧的检出器30的检出值，修正由分光器22及检出器23的光散射光检出值，得到光散射光谱。在进行定量测定时，数据处理演算·输出部31，保持着预先测定制作的检量线数据，从测定未知试样得到的峰强度或峰面积，或者从用荧光光谱的面积值将其修正过的值，按照检量线，算出糖化物浓度或糖化率并进行输出。分光器22进行波长扫描时，数据处理运算，输出部31，通过分光器控制部25，进行波长扫描。
图11A，11B示出用以进一步有效地进行使激发光的光散射增强的池的实例。
对于图11A，池3a是由玻璃、石英或聚对苯二甲酸乙二醇酯等透明材料制成的圆底烧瓶状池子，可装入试样溶液。该池3a可嵌入到积分球状的池架10a中。池架10a的内面作成反射面，同时，开设用以使激发光12s入射，并沿与入射方向成180°的方向取出散射光的窗。激发光12s，用镜子14折曲后，从池架10a的窗，入射到池3a中。16是将从池架10a的窗射出的散射光与激发光一起聚光的聚光透镜。照射在池3a内的试样溶液中的激发光，在池架10a内面反复反射，随着光散射，从池架10a的窗取出，并导向分光器方向。
图11B是在池架10b开窗，以便在相对于激发光的入射方向成90°方向取出散射光的例子。池3a嵌入到其内表面成为反射面的积分球状的池架10b中，在池架10b上开有从y方向入射激发光12s的窗及在与该入射方向成90°的X方向取出散射光18的窗。

Claims (7)

1.一种阿马多利化合物的测定方法，其特征是对含有阿马多利化合物的试样照射单一波长的激发光，接受来自该试样的散射光并分光，得到光散射光谱，使用该散射光谱中作为相对于激发波长的偏移波数并存在于820-840cm-1、1655-1660cm-1、2000-2020cm-1、2080-2100cm-1、2460-2470cm-1或2530-2600cm-1的光散射峰，定量地测定阿马多利化合物。
2.按照权利要求1的阿马多利化合物的测定方法，其特征在于，进行从上述光散射光谱中除去荧光光谱部分的运算操作后，根据上述散射峰的任何一个峰的强度或积分值定量地测定阿马多利化合物。
3.按照权利要求1的阿马多利化合物的测定方法，其特征在于，用上述光散射光谱中任意规定波数领域的积分值，校正根据上述散射峰的任何一个峰的强度或积分值求出的阿马多利化合物的浓度或糖化率。
4.按照权利要求1的阿马多利化合物的测定方法，其特征在于，根据上述散射峰的任何一个峰的峰强度或积分值I、与上述光散射光谱中任意规定波数领域的荧光光谱的积分值S的比I/S，测定阿马多利化合物的糖化率。
5.按照权利要求4的阿马多利化合物的测定方法，其特征在于，上述荧光光谱的积分值S是，决定在该散射光谱中，相对于激发波长偏移波数，除去820-840cm-1、1655-1660cm-1、2000-2020cm-1、2080-2100cm-1、2460-2470cm-1或2530-2600cm-1后，任意规定波数领域的积分值。
6.按照权利要求1的阿马多利化合物的测定方法，其特征在于，测定的阿马多利化合物是糖化白蛋白、糖化血红蛋白及果糖胺中的任何一种。
7.按照权利要求1的阿马多利化合物的测定方法，其特征在于，作为激发光源是使用He-Ne激光。
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