CN115896236A - 一种丙氨酸氨基转移酶的检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医学分析检测技术领域，尤其涉及一种丙氨酸氨基转移酶的检测试剂盒及检测方法。本发明利用Trinder反应，在R1试剂中同时添加丙酮酸氧化酶和谷氨酸氧化酶，使反应中生成的H₂O₂大大提高，相对于传统方法，色原物质生成速度大于传统方法中NADH的消耗速度，从而使得灵敏度增加。高灵敏度不仅可以提高被测物的检出限，降低仪器的噪声对检测的影响，提高精密度，而且可以为以后降低样本使用量，提高临床样本的使用效率。

Description

一种丙氨酸氨基转移酶的检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及医学分析检测技术领域，尤其涉及一种丙氨酸氨基转移酶的检测试剂盒及检测方法。

背景技术

ALT是转氨酶的一种，催化丙氨酸和α-酮酸之间的氨基转移反应。磷酸吡哆醛是转氨酶的辅基，酶蛋白与磷酸吡哆醛结合后才具有催化活性。ALT是最最常见的临床检验项目之一。ALT主要存在于肝脏，但也广泛存在于心脏、骨骼肌、肾脏、胰腺、脾脏、肺等组织，这些组织损伤或者坏死是，血清中ALT升高。ALT主要存在于细胞质，释放容易，故血清ALT升高可出现于组织损伤早期。

测定血清ALT大多测定其催化活性。1955年Karmen建立基于酶偶联反应的紫外分光光度动态监测法(速率法)。1957年基于二硝基苯肼显色反应的比色法(赖氏法)。在早期技术条件下，赖氏比色法相对简单，曾得到广泛的应用，但该方法存在原理缺陷，也不便自动分析，后随着技术发展逐渐淘汰，速率法成为主流方法。20试剂70年代到80年代国际临床化学联合会(IFCC)对速率法反应条件(底物浓度，缓冲液种类，预温育，磷酸吡哆醛活化等)进行优化，推荐反应温度为30℃的ALT测定方法。该方法产生明显国际影响，目前的ALT测定方法几乎均源于此法，同时该方法在推进ALT测定标准化方面起到了一定的作用。在20世纪末人民发现该方法所能实现的标准化程度有限，遂考虑采纳计量学溯源原料。2002年，IFCC在原推荐方法的基础上提出ALT参考方法，仅为了适应现代检测仪器条件，将反应温度由30℃调整至37℃。该方法目前为国际公认的参考方法。目前也常使用可溯源至参考方法的定标品校准，以实现ALT测定标准化。

IFCC推荐的ALT测定参考方法原理为：血清ALT催化L-丙氨酸与α-酮戊二酸的氨基转移反应，生成丙酮酸和L-谷氨酸。生成的丙酮酸在乳酸脱氢酶(LDH)的作用下氧化还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，NADH在340nm波长处有较强光吸收，而NAD+无吸收，在底物过剩的情况下，丙酮酸的生成速率与血清ALT成正比，NADH下降速率与丙酮酸的生成速率成正比，因而可通过检测检测NADH下降速率测定血清ALT活性浓度。其酶偶联反应式如下：

IFCC方法作为推荐方法获得了市场大部分医学实验室和企业的认可。后续的各企业根据自身的情况，对试剂进行优化调整，大部分的改进均基于改良NADH的保存条件，降低NADH长期保存的成本，提高稳定性。

目前在干化学法试剂盒利用丙酮酸氧化酶，将ALT催化生成的丙酮酸用丙酮酸氧化酶催化生成过氧化氢，再通过检测过氧化氢的生成量检测ALT含量：丙氨酸氨基转移酶催化L-丙氨酸的氨基转移到α-酮戊二酸，以产生丙酮酸和谷氨酸。丙酮酸被丙酮酸氧化酶氧化成乙酰磷酸酯和过氧化氢。过氧化氢在过氧化物酶的催化作用下使显色层中的4-氨基安替比林和N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠氧化为蓝色醌型化合物，在590nm波长下，经反射分光光度法测量一定时间内反射率的变化率，通过标准曲线计算丙氨酸氨基转移酶的活性。将反应温度控制在37℃±1℃条件下，测定在5分钟内即可完成。该原理试剂也可改造为液体试剂，对试剂进行精确定量。宁波美康生物公司开发了一种利用丙氨酸底物-丙氨酸氧化酶法，将ALT催化生成的丙酮酸用丙酮酸氧化酶催化生成过氧化氢，后者在过氧化物酶的催化与4-氨基安替比林和色原反应，生成醌亚胺色素，使用分光光度计在对应波长下进行测定。这种方法绕过了NADH的保存问题，提高了试剂的稳定性。但该方法灵敏度仍然不够理想，存在较高的提升空间。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种丙氨酸氨基转移酶的检测试剂盒及检测方法。与传统试剂盒相比，该试剂盒灵敏度高、精密度好，同时降低了样本使用量，大大提高了临床样本的使用效率。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种丙氨酸氨基转移酶的检测试剂盒，由R1试剂和R2试剂组成；

所述R1试剂包括缓冲液、L-丙氨酸、MgCl₂、海藻糖、表面活性剂、防腐剂、酶保护剂、FAD、Vc氧化酶、磷酸二氢钾、色原物质、丙酮酸氧化酶和谷氨酸氧化酶；

所述R2试剂包括缓冲液、α-酮戊二酸、酶保护剂、4-AAP、过氧化物酶和防腐剂。

本发明采用酶偶联法，丙氨酸与α-酮戊二酸在丙氨酸氨基转移酶(以下简称ALT)的催化下反应生成丙酮酸和谷氨酸。丙酮酸和谷氨酸分别在丙酮酸氧化酶和谷氨酸氧化酶的催化下与氧气反应生成过氧化氢，过氧化氢与色原在过氧化物酶的作用下产生醌亚胺色素，在对应的检测波长下检测吸光度的上升速率，与标准物质的上升速率比对，从而实现对ALT的定量检测。

一些实施方案中，所述R1试剂包括如下组下浓度的组分：

一些实施方案中，所述R2试剂包括如下浓度的组分：

一些实施方案中，所述R1试剂和R2试剂中，缓冲液为Tris缓冲液、Good’s缓冲液、磷酸盐缓冲液中的至少一种。

一些实施方案中，所述R1试剂中，表面活性剂为曲拉通、吐温、聚氧乙烯月桂醚，Thexit中的至少一种。

一些实施方案中，所述R1试剂和R2试剂中，酶保护剂为明胶、BSA中的一种或两种。

一些实施方案中，所述R1试剂中，色原为于N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基l)-3-甲氧基苯胺钠盐(二水合物)(ADOS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺钠盐(ADPS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺钠盐(ALPS)、3-羟基-2,4,6-三碘苯甲酸(HTBA)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOPS)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-35-二甲氧基苯胺钠盐(HDAOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-丙磺基)间甲苯胺(TOOS)中的至少一种，其中，色原的种类包括但不仅限于以上种类。

一些实施方案中，所述R1试剂和R2试剂中，防腐剂为叠氮钠、Proclin-300中的一种或几种。

本发明提供的检测试剂盒中，所述R1试剂的pH为7.6；所述R2试剂的pH为9.0。

本发明还提供一种非诊断目的检测丙氨酸氨基转移酶的方法，利用权利要求1～9任一项所述的检测试剂盒对待测样本进行检测，包括如下步骤：

将待测样本与R1试剂混合，在37℃下温浴5min，加入R2试剂，混匀后37℃下静置30秒后，检测546nm处吸光度，根据吸光度变化率-浓度标准曲线，计算待测样本中丙氨酸氨基转移酶的浓度。

一些具体实施例中，所述方法包括如下步骤：

所述取60ul样品，与2.25mlR1试剂混合，在37℃下温浴5min，加入0.75ml R2试剂，混匀后37℃下静置30秒后，每隔10-20秒监测一次546nm处吸光度，共计检测2分钟。将测得的各点吸光度与测得时间进行线性拟合，求出每分钟的吸光度变化量(A/min)。将空白样本与标准样本分别按此步骤操作，建立吸光度变化率-浓度标准曲线，将检测得到的吸光度变化率与标准曲线比对，即可计算待测样本中丙氨酸氨基转移酶的浓度。

本发明采用酶偶联法，丙氨酸与α-酮戊二酸在丙氨酸氨基转移酶(以下简称ALT)的催化下反应生成丙酮酸和谷氨酸。丙酮酸和谷氨酸分别在丙酮酸氧化酶和谷氨酸氧化酶的催化下与氧气反应生成过氧化氢，过氧化氢与色原在过氧化物酶的作用下产生醌亚胺色素，在对应的检测波长下检测吸光度的上升速率，与标准物质的上升速率比对，从而实现对ALT的定量检测。

本发明具有如下有益效果：

1.本发明采用Trinder反应代替传统的丙氨酸底物-乳酸脱氢酶法，不使用NADH作为色原，绕开了传统方法中存在的NADH不稳定的问题，并且避免了由于血清中天然存在的氨、谷氨酸脱氢酶和α-酮酸(除丙酮酸外)引起的测值误差。

2.本发明一方面使用trinder反应进行显色，由于trinder反应中生成的色素在检测波长下的摩尔消光系数大于NADH，因此使得灵敏度增加；另一方面本方法使用谷氨酸氧化酶和丙酮酸氧化酶分别氧化丙氨酸氨基转移酶催化反应产生的谷氨酸和丙酮酸，提高了过氧化氢的生成量，进而提高了显色物质的生成量。相对于传统方法，色原物质生成速度大于传统方法中NADH的消耗速度，从而使得灵敏度增加。高灵敏度不仅可以提高被测物的检出限，降低仪器的噪声对检测的影响，提高精密度，而且可以为以后降低样本使用量，提高临床样本的使用效率。

3.本发明试剂盒为双试剂，将丙酮酸氧化酶和谷氨酸氧化酶放于R1中，消除了血清中存在的丙酮酸的干扰。

附图说明

图1示37℃放置测试值相对偏差变化；

图2示2-8℃放置测试值相对偏差变化。

具体实施方式

本发明提供了一种丙氨酸氨基转移酶的检测试剂盒及检测方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

如无其他说明，本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

其中，4-AAP为4-氨基安替比林，TOOS为N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐。Tris为三羟甲基氨基甲烷，均为市售分析纯试剂TritonX-100为表面活性剂，用以溶解脂肪，提高抗脂浊能力。FAD为丙酮酸氧化酶辅基。MgCl₂为丙酮酸氧化酶激活剂。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1本发明试剂盒

试剂盒组成如下：

表1

检测方法为：取60ul样品，与2.25mlR1混合，在37℃下温浴5min，加入0.75mlR2试剂，混匀后37℃下静置30秒后，每隔10-20秒监测一次546nm处吸光度，共计检测2分钟。将测得的各点吸光度与测得时间进行线性拟合，求出每分钟的吸光度变化量(A/min)。将空白样本与标准样本分别按此步骤操作，建立吸光度变化率-浓度标准曲线，将检测得到的吸光度变化率与标准曲线比对，即可计算结果。

实施例2试剂盒性能测试试验

1实验材料：

1.1试剂：

1.1.1实验试剂：按实施例1配方配制试剂

1.1.2对比试剂1：丙氨酸氨基转移酶检测试剂(丙氨酸底物-丙酮酸氧化酶法)，配方与实施例1的区别为试剂R1中不添加谷氨酸氧化酶

1.1.3对比试剂2.:市售丙氨酸氨基转移酶试剂(丙氨酸底物法)，其成分如下：

表2

1.2样本：

1.2.1临床血清

1.2.2定值多项生化校准血清

1.2.3定值多项生化质控血清

1.3仪器：

1.3.1生化仪：日立7180型全自动生化仪

1.3.2移液器,万级分析天平等

2实验方法：

2.1复溶：按说明书方法分别复溶多项生化校准血清和多项生化质控血清

2.2上机参数：

2.3实验试剂参数如下：

表3

项目	参数
		波长(主/副)	546/800
样本(ul)	6
		R1	225
R2	75
		反应方向	上升
检测方法	速率法
		读点	25-32
定标方法	两点线性
		单位	U/L

2.4对比试剂1:与实验试剂的检测参数相同，见表3。

2.5对比试剂2：

表4

项目	参数
		波长(主/副)	340/546
样本(ul)	10
		R1	200
R2	40
		反应方向	下降
检测方法	速率法
		读点	21-34
定标方法	两点线性
		单位	U/L

2.6灵敏度：测试校准血清样本，分别计算吸光度变化率(A/min)，减去空白吸光度变化率后计算结果，换算至50U/L吸光度变化率(A/min)，结果见表6：

表5

由表4结果可知，在设定参数下，本发明试剂的分析灵敏度均明显高于对照试剂(对比例1～2)，其中，分析灵敏度为对比试剂1的1.8倍，是对比试剂2的5.37倍。考虑样本量的差异，实验试剂和对比试剂1的样本：试剂比例为1:50，对比试剂2的比例为1:24，所以理论上实验试剂的灵敏度是对比试剂2的10.95倍。

2.7稳定性：

2.7.1将试剂用按2.2参数在生化仪上定标后放于37℃环境中，每隔2d测试同一份血清3次，求平均值，观察灵敏度与测试值变化，结果如下：

表6

可以发现，实验试剂在37℃下放置14天，其测试值下降幅度远小于对比试剂，证明实验试剂稳定性高于对比试剂

2.7.2将试剂放于2-8℃，放置21月，在1周，2周，4周，3月，6月，12月，18月，21月分别测试定值多项生化校准品，将分析灵敏度换算至100U/L吸光度变化率，比较分析灵敏度变化情况。

表7

由表7可知，保存21月后，实施例1的试剂分析灵敏度下降幅度小于对比例2的试剂，说明本发明试剂的实时稳定性优于对比试剂。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种丙氨酸氨基转移酶的检测试剂盒，其特征在于，由R1试剂和R2试剂组成；

所述R1试剂包括缓冲液、L-丙氨酸、MgCl₂、海藻糖、表面活性剂、防腐剂、酶保护剂、FAD、Vc氧化酶、磷酸二氢钾、色原物质、丙酮酸氧化酶和谷氨酸氧化酶；

所述R2试剂包括缓冲液、α-酮戊二酸、酶保护剂、4-AAP、过氧化物酶和防腐剂。

2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述R1试剂包括如下组下浓度的组分：

3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述R2试剂包括如下浓度的组分：

4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述R1试剂和R2试剂中，缓冲液为Tris缓冲液、Good’s缓冲液、磷酸盐缓冲液中的至少一种。

5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中，表面活性剂为曲拉通、吐温、聚氧乙烯月桂醚，Thexit中的至少一种。

6.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述R1和R2试剂中，酶保护剂为明胶、BSA中的一种或两种。

7.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中，色原为N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基l)-3-甲氧基苯胺钠盐(二水合物)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺钠盐、N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺钠盐、3-羟基-2,4,6-三碘苯甲酸(、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐、N-(2-羟基-3-磺丙基)-35-二甲氧基苯胺钠盐和N-乙基-N-(2-羟基-3-丙磺基)间甲苯胺中的至少一种。

8.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述R1试剂和R2试剂中，防腐剂为叠氮钠、Proclin-300中的一种或几种。

9.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述R1试剂的pH为7.6；所述R2试剂的pH为9.0。

10.一种非诊断目的检测丙氨酸氨基转移酶的方法，其特征在于，利用权利要求1～9任一项所述的检测试剂盒对待测样本进行检测，包括如下步骤：

将待测样本与R1试剂混合，在37℃下温浴5min，加入R2试剂，混匀后37℃下静置30秒后，检测546nm处吸光度，根据吸光度变化率-浓度标准曲线，计算待测样本中丙氨酸氨基转移酶的浓度。

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