CN115896187A - 一种利用连续流装置进行生物氧化制备潜手性酮化合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用连续流装置进行生物氧化制备潜手性酮化合物的方法，以固定化漆酶作为催化剂，在连续流微反应装置中，用于由消旋醇到潜手性酮的生物氧化。本发明生物氧化方法具有较高的转化率，底物消旋醇浓度可达到40mM，转化率可到95％，且本方法反应步骤简单，反应条件温和，安全，具备规模化生产的能力。将漆酶固定化后，连续运行时间最高可达2800分钟，提高了酶的利用率，显示出良好的操作稳定性。而且本方法对环境友好，利用氧气为氧化剂，氧化副产物为水，大大减少了传统化学氧化过程中造成的环境污染。
Description
技术领域
本发明涉及生物催化技术领域，具体是一种利用连续流装置进行生物氧化制备潜手性酮化合物的方法。
背景技术
漆酶是一种蓝色的多铜氧化酶，能够催化天然底物的氧化，其代价是将四电子氧还原为水。这种氧化还原酶在工业领域有多种应用，并在合成化学领域有着诱人的应用前景。漆酶对于伯醇和仲醇的氧化，需要使用介体系统。其中2,2,6,6-四甲基哌啶氧基自由基(TEMPO)是最高效的的介体之一。漆酶的底物种类繁多(如酚类和苯胺类)，其氧化过程随着分子氧还原为水，底物被氧化。因此，漆酶被定义为“环保”酶，水作为唯一的副产品。利用漆酶进行生物氧化，可以避免化学氧化剂条件苛刻，污染高等缺点。生物氧化生成的潜手性酮可以作为多种手性醇或手性胺药物中间体的重要起始原料，同时也解决了规模庞大的消旋醇的利用问题。
相对于传统间歇式和搅拌式连续反应器，连续流装置(微反应器)更加具有高效性。由于连续流装置具有比表面积大﹑收率高、稳定性高、选择性高、低能耗、提高样品一致性、低反应体积和均匀性、接触时间短、副产物少、快速放大等优点，且连续流装置自动化程度高，大大节省了人力物料成本。以连续流装置为核心的连续流生物催化具有广阔的应用前景。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种利用连续流装置进行，将消旋醇通过生物氧化制备潜手性酮化合物的方法。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种利用连续流装置进行生物氧化制备潜手性酮化合物的方法，包括如下步骤：
(1)以消旋醇为原料，将消旋醇与催化介体混合得到底物溶液；
(2)将步骤(1)得到的底物溶液，与空气或者氧气分别通过流量泵一起通入固定有氧化酶的连续流装置中进行氧化反应，收集反应产物，经萃取即得；
反应的方程式如下：
其中，R1为苯环上的取代基，选自氯、溴、氟、甲基、甲氧基中的任意一种；
所述R2选自甲基、乙基、乙烯基、乙炔基中的任意一种。
具体地，步骤(1)中，所述消旋醇为1-苯乙醇、1-对甲基苯丙醇、1-对氯苯乙醇、1-对氟苯乙醇、对甲基苯乙醇、对甲氧基苯乙醇中的任意一种；所述消旋醇溶于乙腈和柠檬酸缓冲液的混合溶液中，消旋醇浓度为30-40mmol/L。
优选地，步骤(1)中，所述催化介体为TEMPO，底物溶液中TEMPO的用量为底物消旋醇摩尔用量(mol)的10-33％。
优选地，步骤(2)中，所述的氧化酶为漆酶Laccase from Trametes versicolor，CAS号：80498-15-3，购自默克西格玛。
具体地，所述连续流装置包括底物溶液罐、第一流量泵、第二流量泵、气瓶、T型混合器以及酶填充柱；所述底物溶液罐与气瓶通过聚四氟乙烯管道并联连接在T型混合器的一端，T型混合器的另一端连接至酶填充柱；所述第一流量泵安装在底物溶液罐与T型混合器之间的聚四氟乙烯管道上；所述第二流量泵安装在气瓶与T型混合器之间的聚四氟乙烯管道上；所述氧化酶固定在酶填充柱内。
具体地，所述酶填充柱内采用环氧树脂对氧化酶进行固定，具体方法包括：
S1：环氧树脂的官能团修饰
将环氧树脂加入到H2SO4水溶液中搅拌2～4h，然后用去离子水洗去残留的H2SO4；接着加入到高碘酸钠水溶液中搅拌2～4h，然后用去离子水洗涤过滤；最后加入到甘氨酸水溶液中轻晃2～4h，去离子水洗涤多次后，得到修饰后的环氧树脂；
S2：氧化酶的树脂固定化
将氧化酶加入到步骤(1)修饰后的环氧树脂中，然后加入CuSO4、50mM pH 7.0～7.5的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液，孵育18～20h，用20mM pH 7.0～7.5的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液洗涤过滤；最后加入碳酸钠缓冲液和硼氢化钠轻晃30～60min，用10mM pH 7.0～7.5的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液洗涤过滤，得到固定化的氧化酶，装填至柱内即得。
优选地，步骤S2中，氧化酶与修饰后的环氧树脂二者的用量比为20-25mg：1g。
优选地，步骤(2)中，底物溶液以50-75μL/min的流速通入连续流装置，在常压下，空气或者氧气以0.5-0.75mL/min的流速通入连续流装置。
优选地，步骤(2)中，所述连续流装置中氧化反应的温度控制在25～30℃，反应停留时间为30-35分钟。
优选地，步骤(2)中，反应产物经乙酸乙酯进行萃取，得到潜手性酮化合物。
有益效果：
本发明以固定化漆酶作为催化剂，在连续流微反应装置中，用于由消旋醇到潜手性酮的生物氧化。本发明生物氧化方法具有较高的转化率，底物消旋醇浓度可达到40mM，转化率可到95％，且本方法反应步骤简单，反应条件温和，安全，具备规模化生产的能力。将漆酶固定化后，连续运行时间最高可达2800分钟，提高了酶的利用率，显示出良好的操作稳定性。而且本方法对环境友好，利用氧气为氧化剂，氧化副产物为水，大大减少了传统化学氧化过程中造成的环境污染。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1是本发明的反应式。
图2是漆酶(Laccase,from Trametes versicolor)蛋白结构示意图。
图3是本发明环氧树脂官能团修饰原理示意图。
图4是本发明连续流装置示意图。
图5是漆酶催化介体TEMPO的分子结构。
图6苯乙酮的H1-NMR谱图。
图7对甲基苯丙酮的H1-NMR谱图。
图8对氯苯乙酮的H1-NMR谱图。
图9对氟苯乙酮的H1-NMR谱图。
图10对甲基苯乙酮的H1-NMR谱图。
图11对甲氧基苯乙酮的H1-NMR谱图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。
本发明以固定化漆酶作为催化剂，在连续流反应装置中，用于由消旋醇到潜手性酮的生物氧化，反应式如图1所示。
漆酶(Laccase from Trametes versicolor，)为商业化产品，CAS号：80498-15-3，购自默克西格玛，其蛋白结构如图2所示。
漆酶采用环氧树脂进行固定，具体方法包括：
S1：环氧树脂的官能团修饰
如图3所示，取1g环氧树脂，用去离子水洗涤3-4次过滤；然后，加入10～15ml 0.5MH2SO4温和搅拌2～4h，用去离子水洗去残留的H2SO4；接着加入10～15ml 0.1M高碘酸钠温和搅拌2～4h，用去离子水洗涤过滤；最后加入10～15ml 0.3M甘氨酸溶液轻晃2～4h，去离子水洗涤多次，得到修饰后的环氧树脂用于漆酶的固定；
S2：漆酶的树脂固定化
向步骤S1中制备的修饰后的环氧树脂加入20mg漆酶(Laccase,from Trametesversicolor)、适量的CuSO4和2～4ml 50mM pH 7.0～7.5的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液，孵育18～20h，用20mM pH 7.0～7.5的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液洗涤过滤；最后加入10～15ml碳酸钠缓冲液和5～15mg硼氢化钠轻晃30～60min，用10mM pH 7.0～7.5的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液洗涤过滤，得到固定化的漆酶(固定化后的漆酶只需简单过滤，即可快速有效地将固定化酶从反应体系中分离出来)，4℃冰箱储存备用。
如图4所示，本发明采用的连续流装置包括底物溶液罐1、第一流量泵2、第二流量泵3、气瓶4、T型混合器5以及酶填充柱6；所述底物溶液罐与气瓶通过聚四氟乙烯管道并联连接在T型混合器的一端，T型混合器的另一端连接至酶填充柱；所述第一流量泵安装在底物溶液罐与T型混合器之间的聚四氟乙烯管道上；所述第二流量泵安装在气瓶与T型混合器之间的聚四氟乙烯管道上；所述漆酶固定在酶填充柱内。
本发明用到的催化介体为TEMPO，其分子结构如图5所示。
实施例1
底物溶液(1-苯乙醇40mM、乙腈2mL、pH 5.0的柠檬酸缓冲液18ml，TEMPO 20mg)，将底物溶液罐1与第一流量泵2连接，设置流速50μL/min。将气瓶4与第二流量泵3连接，调节流量0.5-0.75mL/min(常压)，使空气流速缓慢均匀，气液两相经过T型混合器5分布均匀后进入固定化酶的树脂填充柱(酶填充柱6，15cm×0.8cm)，保持树脂填充柱温度为30℃，反应液的柱内停留时间约为35分钟。反应液流出后用乙酸乙酯进行萃取后用气相色谱进行分析，结果如图6所示。总转化率为98％，连续运行时间为2700分钟。
实施例2
底物溶液(1-对甲基苯丙醇40mM、乙腈2mL、pH 5.0的柠檬酸缓冲液18ml，TEMPO20mg)，将底物溶液罐1与第一流量泵2连接，设置流速50μL/min。将气瓶4与第二流量泵3连接，调节流量0.5-0.75mL/min(常压)，使空气流速缓慢均匀，气液两相经过T型混合器5分布均匀后进入固定化酶的树脂填充柱(酶填充柱6，15cm×0.8cm)，保持树脂填充柱温度为30℃，反应液的柱内停留时间约为35分钟。反应液流出后用乙酸乙酯进行萃取后用气相色谱进行分析，结果如图7所示。总转化率为93％，连续运行时间为2535分钟。
实施例3
底物溶液(1-对氯苯乙醇40mM、乙腈2mL、pH 5.0的柠檬酸缓冲液18ml，TEMPO20mg)，将底物溶液罐1与第一流量泵2连接，设置流速50μL/min。将气瓶4与第二流量泵3连接，调节流量0.5-0.75mL/min(常压)，使空气流速缓慢均匀，气液两相经过T型混合器5分布均匀后进入固定化酶的树脂填充柱(酶填充柱6，15cm×0.8cm)，保持树脂填充柱温度为30℃，反应液的柱内停留时间约为35分钟。反应液流出后用乙酸乙酯进行萃取后用气相色谱进行分析，结果如图8所示。总转化率为95％，连续运行时间为2820分钟。
实施例4
底物溶液(1-对氟苯乙醇40mM、乙腈2mL、pH 5.0的柠檬酸缓冲液18ml，TEMPO20mg)，将底物溶液罐1与第一流量泵2连接，设置流速50μL/min。将气瓶4与第二流量泵3连接，调节流量0.5-0.75mL/min(常压)，使空气流速缓慢均匀，气液两相经过T型混合器5分布均匀后进入固定化酶的树脂填充柱(酶填充柱6，15cm×0.8cm)，保持树脂填充柱温度为30℃，反应液的柱内停留时间约为35分钟。反应液流出后用乙酸乙酯进行萃取后用气相色谱进行分析，结果如图9所示。总转化率为92％，连续运行时间为2620分钟。
实施例5
底物溶液(对甲基苯乙醇40mM、乙腈2mL、pH 5.0的柠檬酸缓冲液18ml，TEMPO20mg)，将底物溶液罐1与第一流量泵2连接，设置流速50μL/min。将气瓶4与第二流量泵3连接，调节流量0.5-0.75mL/min(常压)，使空气流速缓慢均匀，气液两相经过T型混合器5分布均匀后进入固定化酶的树脂填充柱(酶填充柱6，15cm×0.8cm)，保持树脂填充柱温度为30℃，反应液的柱内停留时间约为35分钟。反应液流出后用乙酸乙酯进行萃取后用气相色谱进行分析，结果如图10所示。总转化率为87％，连续运行时间为2510分钟。
实施例6
底物溶液(对甲氧基苯乙醇40mM、乙腈2mL、pH 5.0的柠檬酸缓冲液18ml，TEMPO20mg)，将底物溶液罐1与第一流量泵2连接，设置流速50μL/min。将气瓶4与第二流量泵3连接，调节流量0.5-0.75mL/min(常压)，使空气流速缓慢均匀，气液两相经过T型混合器5分布均匀后进入固定化酶的树脂填充柱(酶填充柱6，15cm×0.8cm)，保持树脂填充柱温度为30℃，反应液的柱内停留时间约为35分钟。反应液流出后用乙酸乙酯进行萃取后用气相色谱进行分析，结果如图11所示。总转化率为83％，连续运行时间为2230分钟。
本发明提供了一种利用连续流装置进行生物氧化制备潜手性酮化合物的方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
Claims (10)
1.一种利用连续流装置进行生物氧化制备潜手性酮化合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以消旋醇为原料，将消旋醇与催化介体混合得到底物溶液；
(2)将步骤(1)得到的底物溶液，与空气或者氧气分别通过流量泵一起通入固定有氧化酶的连续流装置中进行氧化反应，收集反应产物，经萃取即得；
反应的方程式如下：
其中，R1为苯环上的取代基，选自氯、溴、氟、甲基、甲氧基中的任意一种；
所述R2选自甲基、乙基、乙烯基、乙炔基中的任意一种。
2.根据权利要求1所述的利用连续流装置进行生物氧化制备潜手性酮化合物的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述消旋醇为1-苯乙醇、1-对甲基苯丙醇、1-对氯苯乙醇、1-对氟苯乙醇、对甲基苯乙醇、对甲氧基苯乙醇中的任意一种；所述消旋醇溶于乙腈和柠檬酸缓冲液的混合溶液中，消旋醇浓度为30-40mmol/L。
3.根据权利要求2所述的利用连续流装置进行生物氧化制备潜手性酮化合物的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述催化介体为TEMPO，底物溶液中TEMPO的用量为底物消旋醇摩尔用量的10-33％。
4.根据权利要求1所述的利用连续流装置进行生物氧化制备潜手性酮化合物的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的氧化酶为漆酶Laccase from Trametes versicolor。
5.根据权利要求1所述的利用连续流装置进行生物氧化制备潜手性酮化合物的方法，其特征在于，所述连续流装置包括底物溶液罐、第一流量泵、第二流量泵、气瓶、T型混合器以及酶填充柱；所述底物溶液罐与气瓶通过聚四氟乙烯管道并联连接在T型混合器的一端，T型混合器的另一端连接至酶填充柱；所述第一流量泵安装在底物溶液罐与T型混合器之间的聚四氟乙烯管道上；所述第二流量泵安装在气瓶与T型混合器之间的聚四氟乙烯管道上；所述氧化酶固定在酶填充柱内。
6.根据权利要求5所述的利用连续流装置进行生物氧化制备潜手性酮化合物的方法，其特征在于，所述酶填充柱内采用环氧树脂对氧化酶进行固定，具体方法包括：
S1：环氧树脂的官能团修饰
将环氧树脂加入到H2SO4水溶液中搅拌2～4h，然后用去离子水洗去残留的H2SO4；接着加入到高碘酸钠水溶液中搅拌2～4h，然后用去离子水洗涤过滤；最后加入到甘氨酸水溶液中轻晃2～4h，去离子水洗涤多次后，得到修饰后的环氧树脂；
S2：氧化酶的树脂固定化
将氧化酶加入到步骤(1)修饰后的环氧树脂中，然后加入CuSO4、50mM pH 7.0～7.5的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液，孵育18～20h，用20mM pH 7.0～7.5的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液洗涤过滤；最后加入碳酸钠缓冲液和硼氢化钠轻晃30～60min，用10mM pH7.0～7.5的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液洗涤过滤，得到固定化的氧化酶，装填至柱内即得。
7.根据权利要求6所述的利用连续流装置进行生物氧化制备潜手性酮化合物的方法，其特征在于，步骤S2中，氧化酶与修饰后的环氧树脂二者的用量比为20-25mg：1g。
8.根据权利要求4所述的利用连续流装置进行生物氧化制备潜手性酮化合物的方法，其特征在于，步骤(2)中，底物溶液以50-75μL/min的流速通入连续流装置，空气或者氧气以0.5-0.75mL/min的流速通入连续流装置。
9.根据权利要求4所述的利用连续流装置进行生物氧化制备潜手性酮化合物的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述连续流装置中氧化反应的温度控制在25～30℃，反应停留时间为30-40分钟。
10.根据权利要求4所述的利用连续流装置进行生物氧化制备潜手性酮化合物的方法，其特征在于，步骤(2)中，反应产物经乙酸乙酯进行萃取，得到潜手性酮化合物。
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