CN115895898A - 一种高产苯乳酸的乳酸菌筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高产苯乳酸的乳酸菌筛选方法，从泡菜中分离出乳酸菌，将乳酸菌加入到液体MRS培养基中培养，得到菌悬液；将菌悬液涂布到MRS琼脂碳酸钙培养基上培养；将含有菌落的MRS琼脂碳酸钙培养基平板从培养皿中分离出，并将其置于含中性红指示剂的MRS琼脂培养基平板上，形成双重平板，封口，培养；根据菌落周围形成的红色透明圈的大小筛选出高产苯乳酸菌。本发明采用双重平板法筛选乳酸菌，由于菌落形成的苯乳酸都分布在上层平板的透明钙圈内，而此处由下层平板渗透上来的中性红遇到苯乳酸颜色变深，它使得碳酸钙的透明圈更加明显，更容易和准确地判断苯乳酸的产量，在高产苯乳酸的菌株诱变育种过程中可以更加准确地快速筛选目标菌株。

Description

一种高产苯乳酸的乳酸菌筛选方法

技术领域

本发明涉及微生物育种技术中的高产菌株快速筛选领域，尤其涉及一种高产苯乳酸的乳酸菌筛选方法。

背景技术

苯乳酸具有抑菌、防腐和保鲜等多种重要功能，因此在农产品的加工及贮藏领域具有广阔前景。目前苯乳酸的生产主要有化学合成和微生物发酵合成两种来源。苯乳酸化学合成法技术繁琐，产物不纯，副产物较多，且易造成污染环境；微生物发酵发面主要采用乳酸菌作为生产菌合成苯乳酸，然而自然界分离得到的一般具有苯乳酸产量低、生长速率慢、培养条件要求高等缺点，难以达到规模化工业生产的需求，这就需要对菌株进行改良、筛选。目前乳酸菌初筛的方法主要是利用溶钙圈法对乳酸菌进行筛选，其原理是乳酸菌产生的酸性物质和碳酸钙反应而出现的溶解圈，从中挑选产生溶钙圈大的菌落；然而，该方法存在现象不明显、容易产生碳酸钙沉淀等问题。

发明内容

基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种高产苯乳酸的乳酸菌筛选方法。

本发明提出的一种高产苯乳酸的乳酸菌筛选方法，采用微生物分离纯化技术从泡菜中分离出乳酸菌，将乳酸菌加入到液体MRS培养基中培养，得到菌悬液；将菌悬液涂布到MRS琼脂碳酸钙培养基上培养，得到乳酸菌菌落；将含有菌落的MRS琼脂碳酸钙培养基平板从培养皿中分离出，并将上述培养基平板置于含中性红指示剂的MRS琼脂培养基平板上，形成双重平板，封口，培养；根据菌落周围形成的红色透明圈的大小筛选出高产苯乳酸菌。

优选地，将乳酸菌加入到液体MRS培养基中于27～32℃下培养1-3d，得到菌悬液。

优选地，将菌悬液涂布到MRS琼脂碳酸钙培养基上于27～32℃下培养2-3d，得到乳酸菌菌落。

优选地，将菌悬液涂布到MRS琼脂碳酸钙培养基上之前，还包括按十倍稀释法采用生理盐水按将菌悬液稀释，制成10^-5～10^-6倍稀释度的稀释液。

优选地，所述含中性红指示剂的MRS琼脂培养基平板中，中性红指示剂的含量为0.1500～0.1750g/L；其制备是将中性红指示剂加入到MRS琼脂培养基中得到的。

优选地，封口后，于27～32℃下培养2-3d。

现有技术中，乳酸菌筛常选用溶钙圈法，是利用乳酸菌产生的苯乳酸可以溶解平板中的碳酸钙形成透明钙圈，但是钙圈的大小尤其是钙圈的边界不是太明显，尤其到了菌体生长的中后期，尽管此时菌体大量合成苯乳酸，但是钙圈会更加模糊，往往会影响苯乳酸产量的判断。

如果采用中性红显色反应法，平板中加入中性红后菌落周围由于苯乳酸的形成开始出现深红色菌圈，但是菌圈的边界与周围的培养基界限不明显，同时由于早期中性红的加入对菌体的生长和苯乳酸的形成都会有抑制作用，这也会影响苯乳酸产量的判断。

与现有技术相比，本发明采用双重平板法筛选乳酸菌，即将含乳酸菌菌落的碳酸钙培养基平板与含中性红指示剂的培养基平板按照上下顺序叠放在一起，下层平板中的中性红指示剂会渗透到上层平板中，与上层平板中的苯乳酸产生明显的颜色反应而呈现红色，再由于乳酸菌产生的苯乳酸可以溶解平板中的碳酸钙形成透明钙圈，从而最终在上层平板的菌落周围形成明显的红色透明圈，根据红色透明圈的大小，即可以判断乳酸菌产苯乳酸的能力强弱。

本发明建立了一种基于透明钙圈法和显色反应法两种技术的乳酸菌筛选新方法，该方法简单易操作，由于菌落形成的苯乳酸都分布在透明钙圈内，而此处的中性红遇到苯乳酸颜色变深，它使得碳酸钙的透明圈更加明显，更加容易和准确地判断苯乳酸的产量，在高产苯乳酸的菌株诱变育种过程中可以更加准确地快速筛选目标菌株。

附图说明

图1为本发明实施例1中MRS琼脂碳酸钙平板培养菌落图；

图2为本发明实施例1中MRS琼脂碳酸钙中性红平板培养菌落图；

图3为本发明实施例1中双重平板培养菌落图。

具体实施方式

下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

实施例1

1.乳酸菌分离：取市场中购买的泡菜，用移液枪量取泡菜汁5ml，置于事先灭过菌的液体MRS培养基中，30℃的恒温培养箱中培养3天待用。当整个锥形瓶内液体变得浑浊后，首先观察培养基中菌体生长情况，挑选出菌体长势良好的菌体，在超净工作台中用移液枪移取5ml菌液接入装有100mLMRS液体培养基的锥形瓶中。置于30℃培养3天，获得菌体富集液。取富集液离心用无菌生理盐水梯度稀释，取稀释液涂平板，30℃培养48h。选择菌落周围有明显碳酸钙溶解圈的单菌落，接种针挑取相应单菌落在MRS固体培养基划线，直至出现乳白色、大小均一的单菌落。

2.菌悬液制备：将获得的菌落按照1.5vt％的接种量加入装有200mL MRS液体培养基的三角瓶中，在30℃条件下培养48h后，得到菌悬液。

3.乳酸菌培养：

1)MRS琼脂碳酸钙培养：用移液枪从三角瓶中吸取0.4mL菌悬液注入盛有3.6mL无菌水的试管中，以此类推，制成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6不同稀释度的溶液，将其涂布于MRS琼脂碳酸钙培养基的平板上，30℃培养2-3d，经过实验测定10^-6稀释的菌液长出的菌落在培养基上分布较为均匀，可以较好的观察到实验现象。其中，10^-6稀释度的菌液在MRS琼脂碳酸钙培养基上生长情况如图1所示。从图1中可以看出，乳酸菌产生的苯乳酸可以溶解平板中的碳酸钙形成透明钙圈，但是钙圈的大小尤其是钙圈的边界不是太明显，尤其到了菌体生长的中后期，尽管此时菌体大量合成苯乳酸，但是钙圈更加模糊，往往会影响苯乳酸产量的判断。

2)MRS琼脂碳酸钙中性红培养：在MRS琼脂碳酸钙培养基中加入一定量中性红指示剂，制成中性红浓度为0.1250、0.1500、0.1750、0.2000、0.2250g/L梯度的含中性红平板；用移液枪从三角瓶中吸取0.4mL菌悬液注入盛有3.6mL生理盐水的试管中进行梯度稀释，直至得到10^-6稀释度的菌液，将其涂布于不同梯度的含中性红平板上(1L培养基)，30℃培养2-3d，经过实验测定中性红浓度0.1750g/L时可以较好的观察到实验现象。乳酸菌在含中性红的MRS琼脂培养基上(中性红浓度为0.1750g/L)生长情况如图2所示。从图2中可以看出，平板中加入中性红后菌落周围由于苯乳酸的形成开始出现深红色菌圈，但是菌圈的边界与周围的培养基界限不明显，同时由于早期中性红的加入对菌体的生长和苯乳酸的形成都会有抑制作用，这也会影响苯乳酸产量的判断。

4.双重平板法筛选，具体操作为：取乳酸菌菌悬液稀释(稀释度为10^-6)后涂于MRS琼脂碳酸钙平板，后放入培养箱中30℃培养60h，待乳酸菌长好后，将培养好的乳酸菌菌落及培养乳酸菌的平板一起移至含中性红(浓度0.1750g/L)的MRS琼脂平板上培养60h。由于中性红会与乳酸菌产生的苯乳酸作用产生颜色反应而呈现红色，再加上碳酸钙与苯乳酸作用产生溶解圈，所以周围的菌落会形成红色透明圈，根据透明圈的大小及红色的深浅，即可以判断乳酸菌产苯乳酸的能力强弱。乳酸菌在双重平板的生长情况如图3所示。从图3中可以看出，采用双重平板法，菌落形成的苯乳酸都分布在透明钙圈内，而此处的中性红遇到苯乳酸颜色变深，它使得碳酸钙的透明圈更加明显，更加容易和准确地判断苯乳酸的产量。

上述含中性红的MRS琼脂平板的制备如下：在1L的MRS琼脂培养基中加入0.1750g中性红。中性红浓度过低效果不明显，中性红浓度过高则影响乳酸菌活性。所以，为了避免早期乳酸菌与中性红直接接触而抑制其生长，采用中性红双重平板培养，而不是直接将中性红加入到MRS琼脂碳酸钙培养基中。

实施例2

一种高产苯乳酸的乳酸菌筛选方法，步骤如下：

1.乳酸菌分离：同实施例1。

2.菌悬液制备：将获得的菌落按照1vt％的接种量加入到泡菜，通过微生物培养技术分离出乳酸菌，放入装有200mL MRS液体培养基的三角瓶中，在27℃条件下培养72h后，得到菌悬液。

3.双重平板法筛选：取乳酸菌菌悬液稀释(稀释度为10^-6)后涂于MRS琼脂碳酸钙平板，后放入培养箱中27℃培养72h，待乳酸菌长好后，将培养好的乳酸菌菌落及培养乳酸菌的平板一起移至含中性红(浓度0.1750g/L)的MRS琼脂平板上(其制备方法同实施例1)培养72h。由于中性红会与乳酸菌产生的苯乳酸作用产生颜色反应而呈现红色，再加上碳酸钙与苯乳酸作用产生溶解圈，所以周围的菌落会形成红色透明圈，根据透明圈的大小及红色的深浅，即可以判断乳酸菌产苯乳酸的能力强弱。

实施例3

一种高产苯乳酸的乳酸菌筛选方法

1.乳酸菌分离：同实施例1。

2.菌悬液制备：将获得的菌落按照2vt％的接种量加入到泡菜，通过微生物培养技术分离出乳酸菌，放入装有200mL MRS液体培养基的三角瓶中，在32℃条件下培养24h后，得到菌悬液。

3.双重平板法筛选：取乳酸菌菌悬液稀释(稀释度为10^-5)后涂于MRS琼脂碳酸钙平板，后放入培养箱中32℃培养48h，待乳酸菌长好后，将培养好的乳酸菌菌落及培养乳酸菌的平板一起移至含中性红(浓度0.1750g/L)的MRS琼脂平板上(其制备方法同实施例1)培养60h。由于中性红会与乳酸菌产生的苯乳酸作用产生颜色反应而呈现红色，再加上碳酸钙与苯乳酸作用产生溶解圈，所以周围的菌落会形成红色透明圈，根据透明圈的大小及红色的深浅，即可以判断乳酸菌产苯乳酸的能力强弱。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种高产苯乳酸的乳酸菌筛选方法，其特征在于，采用微生物分离纯化技术从泡菜中分离出乳酸菌，将乳酸菌加入到液体MRS培养基中培养，得到菌悬液；将菌悬液涂布到MRS琼脂碳酸钙培养基上培养，得到乳酸菌菌落；将含有菌落的MRS琼脂碳酸钙培养基平板从培养皿中分离出，并将上述培养基平板置于含中性红指示剂的MRS琼脂培养基平板上，形成双重平板，封口，培养；根据菌落周围形成的红色透明圈的大小筛选出高产苯乳酸菌。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将乳酸菌加入到液体MRS培养基中于27～32℃下培养1-3d，得到菌悬液。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，将菌悬液涂布到MRS琼脂碳酸钙培养基上于27～32℃下培养2-3d，得到乳酸菌菌落。

4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，将菌悬液涂布到MRS琼脂碳酸钙培养基上之前，还包括按十倍稀释法采用生理盐水将菌悬液稀释，制成10^-5～10^-6倍稀释度的稀释液。

5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述含中性红指示剂的MRS琼脂培养基平板中，中性红指示剂的含量为0.1500～0.1750g/L；其制备是将中性红指示剂加入到MRS琼脂培养基中得到的。

6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，封口后，于27～32℃下培养2-3d。

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