CN115888773B

CN115888773B - 一种多功能级联纳米酶、其制备方法及应用

Info

Publication number: CN115888773B
Application number: CN202211388330.3A
Authority: CN
Inventors: 谭玉龙; 徐嘉曼; 师进生; 孔晓颖; 姜玉萍
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2022-11-08
Filing date: 2022-11-08
Publication date: 2023-08-11
Anticipated expiration: 2042-11-08
Also published as: CN115888773A

Abstract

本发明公开一种多功能级联纳米酶、其制备方法及应用，属于纳米材料技术领域。本发明所述的多功能级联纳米酶是将二氧化铈(CeO₂)和过氧化锌(ZnO₂)固定在扇贝型FePOs纳米酶材料中，同时加载光敏剂吲哚菁绿(ICG)制备而成。本发明所述多功能级联纳米酶，在808nm近红外激光照射下会产生光热，并释放活性氧，具有高效的抗菌及抗生物被膜效果，与此同时，铈离子价态的改变使其能够去除多余的活性氧，使其在具有治疗感染部位的同时，保护正常组织免受损伤。

Description

一种多功能级联纳米酶、其制备方法及应用

技术领域

本发明属于纳米材料技术领域，具体涉及一种多功能级联纳米酶、其制备方法及应用。

背景技术

生物膜是指附着于有生命或无生命物体表面被细菌胞外大分子包裹的有组织的细菌群体。生物膜中存在各种主要的生物大分子如蛋白质、多糖、DNA、RNA、肽聚糖、脂和磷脂等物质。生物膜的存在可以防止抗生素和其他药物作用于叶状体，从而使细菌对抗生素和宿主免疫防御机制具有很强的抗性。因此，开发一种可以抑制生物被膜并可以穿过生物被膜作用于菌体本身的新材料较为迫切。目前可用的生物膜抗性策略具有显著的局限性。随着纳米技术的发展，纳米粒子(NPs)作为一种纳米酶，在相关生理条件下具有稳定的化学结构，且遵循酶催化人工模拟酶纳米材料的酶动力学，具有高效、主动可调、易延展性以及可回收性等优点。近年来，纳米酶已被探索为仿生化学中天然酶的潜在替代品。其中，含有铁和铜的抗菌剂已被广泛研究和报道，可以提高细菌系统中活性氧(ROS)的水平，在医用消毒剂领域具有很高的价值。然而，传统的纳米酶仍面临多许多挑战，例如相元素组成、催化活性差、特异性差、活性位点密度低以及催化机理复杂等问题。因此，开发智能高效的抗菌纳米系统是一个有意义的课题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多功能级联纳米酶，所述多功能级联纳米酶是将二氧化铈(CeO₂)和过氧化锌(ZnO₂)固定在扇贝型FePOs纳米酶材料中，同时加载光敏剂吲哚菁绿(ICG)制备而成。本发明所述多功能级联纳米酶，在808nm近红外激光照射下会产生光热，并在纳米酶表面产生活性氧自由基，以使其能够在高效抗菌、抗生物被膜的同时保护正常组织免受损伤。

本发明提出如下技术方案：

一种多功能级联纳米酶的制备方法，步骤如下：

(1)制备FePOs

将尿素和十二烷基硫酸钠溶于水中，搅拌，制成溶液A；将Fe₂(SO₄)₃和磷酸溶于水中，滴加至上述溶液A中，搅拌；将混合物置于高温下密封反应，反应结束后，自然冷却至室温；离心收集所得产物，洗涤产物，真空干燥，获得FePOs；

(2)制备FC

将FePOs置于乙醇水溶液中，超声分散；加入Ce(NO₃)₃和六亚甲基四胺溶液；将混合物升温，回流，待反应结束后，冷却至室温；通过洗涤、离心除去杂质，将产物干燥，获得FC；

(3)制备FZ或FCZ

A、制备FZ

将FePOs溶于水中，加入Zn(OAc)₂和聚乙烯吡咯烷酮；将H₂O₂迅速加入到上述溶液中并剧烈搅拌，待反应结束后，离心，收集产物，并洗涤，获得FZ；或，

B、制备FCZ

将FC溶于水中，加入Zn(OAc)₂和聚乙烯吡咯烷酮；将H₂O₂迅速加入到上述溶液中并剧烈搅拌，待反应结束后，离心，收集产物，并洗涤，获得FCZ；

(4)制备FZI或FCZI

A、制备FZI

将FZ分散到吲哚菁绿溶液中，连续搅拌；待反应结束后，离心，收集产品，获得FZI，即所述的多功能级联纳米酶；或，

B、制备FCZI

将FCZ分散到吲哚菁绿溶液中，连续搅拌；待反应结束后，离心，收集产品，获得FCZI，即所述的多功能级联纳米酶。

在上述制备方法中：如步骤(1)所示，所述高温选自120～160℃，可进一步优选为140℃；如步骤(2)所示，所述升温是指，升温至60～80℃，可进一步优选为70℃。

在上述制备方法中，对于各成分的用量，本发明不作具体限定，只要采用本发明的技术构思来制备并获得FZI或FCZI，均在本发明的保护范围之内。本发明在具体实施方式中提供了FZI以及FCZI的具体制备过程，但应当理解的是，这仅仅是本发明众多可实施范围中的一种而已，当相应的成分用量作出变化时，例如，将尿素的用量调整为5g时，本发明的技术方案依旧可以实施，并如期获得FePOs；其它成分的用量，例如十二烷基硫酸钠、Fe₂(SO₄)₃、磷酸、水、FePOs、乙醇水溶液、Ce(NO₃)₃、六亚甲基四胺溶液、FC、Zn(OAc)₂、聚乙烯吡咯烷酮、H₂O₂、FZ、吲哚菁绿溶液以及FCZ等，均可依据实际情况作出调整，并能够使本发明的技术方案得到实施。上述各成分的用量，可在当前实施方式的基础上，以不同步或者同步的方式，作1倍量、2倍量、3倍量甚至更多倍量的调整，以使各成分之间的用量比例丰富多样，并能够使本发明的技术方案得到实施。当然，本发明旨在保护合理的用量范围，对于那些超脱于实施内容本身的数值，例如，以实施例1中的尿素为例，当尿素的用量大到反应体系已不再是液体体系时，其反应将可能不再顺利进行，自然不属于本发明的保护范畴。但显然的是，本领域技术人员是能够理解上述内容，并意识到各成分在合理可控的用量范围内是应当予以保护的。除非有人在本发明的基础上，证明了各成分用量对于FZI或FCZI的制备能够取得其它的意想不到的技术效果。

本发明提供了由上述方法制备的多功能级联纳米酶。

本发明所述的多功能级联纳米酶，在808nm近红外激光照射下会产生光热，并在纳米酶表面产生活性氧自由基，能够破坏细菌被膜，致使细菌死亡。基于此，本发明还提供了上述多功能级联纳米酶在抗菌或抗生物被膜中的应用，其应用目的可以是非诊疗性的，也可以是诊疗性的。优选地，本发明提供了上述多功能级联纳米酶在制备具有抗菌或抗生物被膜效果的药物或制剂中的应用。

在上述应用中，可优选地向多功能级联纳米酶提供808nm的近红外激光照射，以获得更好的抗菌或抗生物被膜效果。其中，激光照射功率选自0.5～1.5W/cm²；优选为1W/cm²。

鉴于本发明所述多功能级联纳米酶在生物被膜方面的作用机理，其抗菌种类具有相当程度的广谱性，本发明并不限制其作用菌种，但在具体实施案例中，所述菌种可以是金黄色葡萄球菌或白色念珠菌。

本发明的有益效果为：

本发明的多功能级联纳米粒子，在808nm近红外激光照射下会产生光热，并释放活性氧，具有高效的抗菌及抗生物被膜效果，与此同时，铈离子价态的改变使其能够去除多余的活性氧，使其在具有治疗感染部位的同时，保护正常组织免受损伤。因此，本发明有望为生物相容性纳米酶开辟新道路。

附图说明

图1为FCZI的透射电镜图；

图2为纳米粒子(NPs)的表征；其中，a～c图分别为FePOs、FC以及FCZI的透射电镜图；d图为FCZI相应元素的映射图像；e图为FCZI的EDS能谱图；f～j图为FCZI的XPS谱图，其中，f图为宽扫描光谱，g图为Fe 2p光谱，h图为P 2p光谱，i图为Ce 3d_3/2和Ce 3d_5/2光谱，j图为Zn 2p_1/2和Zn 2p_3/2光谱；

图3为FCZI的XPS谱图；其中，a图为C1s光谱，b图为O1s光谱；

图4为FePOs、FZ和FCZ的XRD图；

图5为各纳米粒子的理化性能图；其中，a图为Zeta电势图；b图为FePOs与GSH和H₂O₂反应后的ESR光谱；c图为不同pH条件下的亚甲基蓝降解曲线，上方曲线的pH为7.4，下方曲线的pH为6.5；d图为在pH为6.5条件下，亚甲基蓝在不同时间的降解曲线，从上到下依次为10min、50min、0min、15min；e图为热重分析图，从500℃一侧看，曲线从上到下依次为FCZ、FCZI以及ICG；f和g图均为FCZI的ESR光谱图，中间横直线为“Dark”条件，上下曲线为激发条件；h图为不同FCZI浓度条件下的温度曲线图，曲线从上往下依次为2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0mg/mL；i图为不同辐照密度条件下的温度曲线图，曲线从上往下依次为1.5W/cm²、1W/cm²、0.5W/cm²；j图为光热循环曲线；k图为PBS和FCZI的红外热图像；

图6为抗菌试验图；其中，a图为PBS组的金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的SEM图像；b图为“FCZI+激光”组的金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的SEM图像；c图为各试验组的细菌存活率；d图为不同浓度FCZI条件下的细菌存活率；e图为各试验组的CLSM(活/死染色)图像；f图为各试验组处理条件下的生物膜生存情况；

图7为经各试验组处理后的细菌涂布生长图；

图8为抗菌试验图；其中，a图为各试验组采用DCFH-DA染色的CLSM图像；b图为各试验组中金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的ROS产量曲线，其中，从下到上依次代表control、Laser、FC、FZ、FCZI(1mg/mL)+Laser、FCZI(2mg/mL)+Laser；c图为不同浓度FCZI处理条件下的金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的DNA凝胶电泳图；d图为不同处理条件下的蛋白质浓度，反映大分子物质从细胞中的泄露情况；e图为FCZI的抗菌机理。

具体实施方式

在本发明中，TEM图、HRTEM图、XPS图、EDS图以及Zeta电位等理化图像，均通过现有技术手段测定。本发明所使用的其它术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

多功能级联纳米酶的制备：

Ⅰ.制备FePOs

将6.0g尿素和0.5g十二烷基硫酸钠(SDS)溶于84mL去离子水中，磁力搅拌10min，制成溶液A。将0.2g Fe₂(SO₄)₃和0.49g 20％磷酸溶于8mL去离子水中，滴加至上述溶液A中，然后磁力搅拌20min。将混合物转移到150mL特氟龙内衬的高压反应釜中，在140℃下保持密封2h，然后自然冷却至室温。离心收集所得产物，用去离子水和乙醇洗涤产物，最后在60℃的真空中干燥。产物被标记为“FePOs”。

Ⅱ.制备FC

将50mg FePOs置于40mL乙醇水溶液(乙醇与水等体积)中，超声分散。加入0.4mmoLCe(NO₃)₃和15mL 0.02g/L六亚甲基四胺溶液(HMT)。将混合物的反应温度升至70℃并保持回流2h，然后冷却至室温。通过去离子水洗涤，离心，循环洗涤和离心步骤，以除去杂质，纯化产物，然后在60℃下干燥。产物被标记为“FC”。

Ⅲ.制备FZ或FCZ

(1)制备FZ

将40mg FePOs溶于5.0mL水中，加入0.1g Zn(OAc)₂和0.1g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。将0.5mL 30％H₂O₂迅速加入到上述溶液中并剧烈搅拌，反应24h。离心10min，收集并用去离子水洗涤产物。产物标记为“FZ”。或，

(2)制备FCZ

将40mg FC溶于5.0mL水中，加入0.1g Zn(OAc)₂和0.1g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。将0.5mL30％H₂O₂迅速加入到上述溶液中并剧烈搅拌，反应24h。离心10min，收集并用去离子水洗涤产物。产物标记为“FCZ”。

Ⅳ.制备FZI或FCZI

(1)制备FZI

将50mg FZ分散到8mL 3mg/mL吲哚菁绿(ICG)溶液中，连续搅拌8h。离心10min，收集产品，获得多功能级联纳米酶，标记为“FZI”。或，

(2)制备FCZI

将50mg FCZ分散到8mL 3mg/mL吲哚菁绿(ICG)溶液中，连续搅拌8h。离心10min，收集产品，获得多功能级联纳米酶，标记为“FCZI”。FCZI的透射电镜图如图1所示。

其中，由FZ制备的FZI，是在FePOs表面修饰有ZnO₂和ICG的纳米酶；由FCZ制备的FCZI，是在FePOs表面修饰有CeO₂、ZnO₂和ICG的纳米酶。

(一)结构表征

1、TEM图

TEM图由透射电子显微镜(TEM)测定。由图2可知，FePOs表现出平均直径约330nm的均匀型“扇贝”纳米结构(图2a)；经CeO₂修饰后，纳米粒子的形态发生显著变化，“扇贝”形状消失，“橄榄球”的形状出现，且表面不平整(图2b)。经ZnO₂修饰后，纳米粒子的形貌再次发生变化，由于ZnO₂涂层的存在，纳米球的表面变得更加紧凑，这表明，复合纳米颗粒最终被成功制备，且经ICG修饰后，纳米颗粒表面发生了微小变化，外围附着有ICG，形成FCZI(图2c)。

2、元素映射图

元素映射图由高分辨率透射电子显微镜(HRTEM)测定。由图2可知，FCZI由Fe、P、Ce和Zn元素组成(图2d)。

3、EDS光谱

EDS光谱由EDS能谱仪测定。由图2可知，EDS光谱直接证明了FCZI是由CeO₂和ZnO₂修饰而成的(图2e)。

4、XPS图

XPS图由X射线光电子能谱仪(XPS)测定。由图2可知，在宽扫描光谱(图2f)中，FCZI存在C、O、P、Ce、Fe和Zn，其中，C 1s的结合能(284.79eV，图3a)被用作XPS分析中所有其他光谱的校准。在Fe 2p的高分辨率光谱(图2g)中，以711.15eV和724.8eV为中心的峰值可分别归因于Fe 2p_3/2和Fe 2p_1/2；Fe 2p_1/2的峰值比Fe 2p_3/2弱，因为Fe 2p_3/2有4种简并态，而Fe2p_1/2只有2种，这表明，FePOs纳米酶中Fe元素的价态是Fe³⁺。P 2p和O1s的峰值(图2h和图3b)分别为133.0eV和531.0eV，这与表明FePOs纳米酶制备成功的报告值非常吻合。Ce 3d电子核心层的XPS光谱在Ce 3d光离子化过程中被多个最终态(Ce³⁺和Ce⁴⁺)复合并溶解成两个多态(图2i)；Ce 3d_3/2和Ce 3d_5/2的峰值说明Ce⁴⁺和Ce³⁺的存在，这表明FePOs被CeO₂成功修饰，形成FC。图2j表明，ZnO₂纳米粒子(FCZ)被成功合成。

5、XRD图

此外，图4中还显示了FePOs、FZ和FCZ的X射线衍射峰(XRD)，其中，可见ZnO₂峰(PDF#13-0311)的晶体衍射峰(111)，归属于FZ；可见CeO₂峰(PDF#43-1002)的晶体衍射峰(111)，归属于FCZ。

综合上述分析，本发明成功合成了含有FePOs、CeO₂、ZnO₂和ICG的级联纳米结构(FCZI)。

(二)理化性能

1、Zeta电势图

选取FePOs、FC、FCZ以及FCZI，进行Zeta电位测定。测定结果如图5a所示，各复合纳米粒子均携带有负电荷，这使其能够与带正电荷的物质相结合。从而能够在抑制携带有正电荷的细菌方面发挥重要作用。

2、ESR光谱

将40mg FePOs与5mL GSH(10mM)和0.5mL H₂O₂(10mM)混合孵育2h，测定反应产物的ESR光谱。测定结果如图5b所示，GSH和H₂O₂能够促进FePOs进一步释放羟自由基(·OH)。羟自由基的增加可进一步加强氧化应激，促进感染部位的细菌死亡，并促进伤口愈合。

3、亚甲基蓝降解曲线

羟自由基会使亚甲基蓝(MB)降解。FePOs与GSH和H₂O₂共孵后，会产生羟自由基并导致MB降解。使用紫外分光光度计检测MB在不同pH值下的降解程度，同时在最优pH值下检测不同时间内亚甲基蓝的降解程度。

由图5c可知，当溶液的pH值为6.5时，MB更容易降解，其吸光度降低，这表明FePOs在微酸性环境中容易破裂，并释放出用于细菌杀灭的活性成分。由图5d可知，在轻度酸性环境(pH＝6.5)下，随时间监测MB溶液与含GSH(10mM)和H₂O₂(10mM)的FePOs溶液(1mg/mL)共孵育的MB溶液的吸光度，结果表明MB溶液的吸光度在50min内显著下降。上述结果表明，GSH和H₂O₂的加入可以使FePOs释放出足够的羟基自由基(·OH)，并导致MB的降解，这与上述ESR结果一致。

4、热重分析

将FCZ、FCZI、ICG三种材料研制成细碎粉末，置于铝坩埚内，使用热重分析仪进行实验。

热重(TG)分析结果如图5e所示。根据重量变化计算，FCZI中ICG的载药率为6.7％。FCZI在808nm激光照射下可以有效地释放单线态氧(¹O₂)和羟基自由基(·OH)，正如图5f和图5g所述电子自旋共振(ESR)所展示的结果那样，其可以通过ICG的光动力学疗法(PDT)促进细菌凋亡。

5、光热转化

分别采用相同辐照密度、不同材料浓度以及相同材料浓度、不同辐照密度进行光热转化实验，使用紫外分光光度计检测ICG在780nm下的吸光度，并使用热成像仪记录实验过程中的温度变化。

由图5h可知，当808nm辐照的密度为1W/cm²时，光热转换效率是与FCZI的浓度相关的；而且，当FCZI浓度为2mg/mL时，体系温度在10min时即可达54～55℃。由图5i可知，当FCZI浓度为1mg/mL时，光热转换效率是与808nm照射的功率相关的。此外，更重要的是，FCZI在重复激光照射三次后仍显示出优异的光热循环性，如图5j所示。上述结果说明，修饰有ICG的FCZI表现出较高的光热转化效率。

6、红外热图像

本发明通过红外热像仪图像记录了PBS溶液和FCZI溶液(1mg/mL)在1W/cm²的激光密度下的温度变化，如图5k所示。当FCZI浓度为1mg/mL时，体系温度在10min时可达44～45℃，这表明，FCZI能通过ICG的光热治疗法(PTT)进一步促进细菌凋亡。

因此，可将1mg/mL的FCZI浓度和1W/cm²的激光密度，作为生物体治疗的基准，来避免高温所引起的伤口周围外周组织的灼伤以及炎症并发症等副作用，从而在获得最佳杀菌效果的同时，最大化减小副作用的产生。

实施例2

抗菌试验：

将金黄色葡萄球菌接种于TSB培养基中，在37℃和220r/min条件下孵育过夜。将白色念珠菌接种于YPD培养基中，在30℃和220r/min条件下孵育过夜。将上述两种菌液用TSB培养基稀释至浓度为1×10⁸CFU/mL，按等体积混合以形成混合菌液。

分别将2mg的ZnO₂、FC、ZC(ZnO₂和CeO₂混合物)、FZ、FCZ、FCZI材料溶于PBS缓冲液中，配制成浓度为2mg/mL的材料溶液。取上述材料溶液各100μL，分别加入到96孔板的孔中，并加入100μL混合菌液，使各材料的终浓度为1mg/mL。

本试验设置如下组别：

(1)ZnO₂组、FC组、ZC组、FZ组、FCZ组。(2)空白对照组(PBS组)：PBS缓冲液。(3)激光组：在PBS缓冲液的基础上进行激光照射。(4)“FCZI+激光”组：对FCZI孔进行激光照射。

本试验所述激光是采用808nm激光器进行照射，激光的功率密度为1.5W/cm²，照射时间为10min，照射距离控制在8cm。采用激光照射的目的：ICG是一种光敏剂，在激光的作用下，可发挥作用。

此外，在96孔板中设置FCZI浓度梯度：向其他孔中加入200μL 4mg/mL的FCZI纳米酶溶液，用双稀释法稀释两次后，分别加入100μL混合菌液，使孔中FCZI的最终浓度分别为2mg/mL、1mg/mL和0.5mg/mL，并进行激光照射。

将96孔板置于37℃培养箱中振荡培养24h。培养后，取出96孔板进行菌落计数并进行三次平行实验。与此同时，使用扫描电镜(SEM)观察菌体形态、检测其蛋白质泄漏量，检测其DNA损伤程度、测定其ROS产量以及其抗生物被膜效果。

试验结果如图6～图8所示：

1、图6展示的结果

采用扫描电镜观察PBS组和“FCZI+激光”组的混合菌株的形态变化。在PBS组中，金黄色葡萄球菌为球形，白色念珠菌为椭圆形，且两种细胞表面光滑而不破裂(图6a)。然而，在“FCZI+激光”组中，金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的细胞边缘粗糙，皱纹，变形，甚至破裂(图6b)。这种变形是由808nm激光刺激FCZI产生对细胞造成损伤的物质，导致细胞膜破裂，以及细菌内容物流出引起的。

图6c反映了各试验组的细菌存活率情况。由图6c可知，“FCZI+激光”组处理的混合细菌(金黄色葡萄球菌和白色念珠菌)的存活率仅为13.16％，这表明，在激光照射下，FCZI具有非常优异的灭菌活性。此外，FC、FZ、FCZ与对照组相比均具有一定的抗菌作用，这表明，FePOs、ZnO₂、CeO₂和ICG均具有相应的抗菌活性。激光组中的细菌存活率相对较高，因此，可以排除激光对细菌活性的显著影响。由图6d可知，随着FCZI浓度的增加，细菌存活率进一步降低。

本发明利用CLSM(活/死染色)图像分析了各实验组的抗生物膜效果，如图6e所示，在对照组中观察到较厚的绿色结构(活细胞)。而在其它试验组中，绿色结构逐渐减少。尤其是在“FCZI+激光”组中，不仅绿色结构大幅减少，而且红色结构显著增加，这证明，细胞已经死亡，其生物膜结构解体。同时，本发明还利用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮杂溴化物(MTT)分析了各实验组的抗生物膜效果，如图6f所示，“FCZI+激光”组仍展示出优异的生物膜抑制效果，这与上述活/死染色的结果一致。

上述试验内容表明，FCZI不仅能杀死单个微生物细胞，而且对结构更致密、更复杂的生物膜还表现出了显著的抑制作用，这对于实际临床应用而言具有重要意义。

2、图7展示的结果

此外，本发明还对各实验组处理后的细菌进行了涂布，以观察细菌在涂布后的生长情况，如图7所示，经“FCZI+激光”组处理后的细菌，在涂布后的生长数量明显低于其它各组，尤其低于对照组和激光组，这说明，由本发明制备的FCZI对细菌具有较好的致死效果，应用前景广阔。

3、图8展示的结果

本领域技术人员知晓，高水平的活性氧(ROS)，例如，超氧阴离子(·O₂ ^-)、过氧化氢分子(H₂O₂)、羟基自由基(·OH)、氢过氧基(·HO₂ ^-)、烷过氧基(·ROO)、烷氧基(·RO)、氮氧自由基(·NO)、过氧亚硝酸盐(ONOO^-)、氢过氧化物(ROOH)和单线态氧(¹O₂)等，对细胞是致命的。

本发明以二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)为ROS探针，采用荧光显微镜观察ROS的生成情况，如图8a所示，“FCZI+激光”组中观察到亮绿色荧光，而对照组几乎没有观察到绿色荧光，这表明，FCZI触发了ROS的产生。此外，在FZ组中观察到的绿色荧光，其强度略强于FC组，这表明，ZnO₂可以促进FePOs产生ROS。根据上述结果，可知，ROS的生成与FePOs所具有的POD样酶性质以及ICG的光动力学疗法(PDT)有关。同时，ZnO₂的加入可以促进绿色荧光强度的增加，这证明，ZnO₂释放的H₂O₂有助于ROS的产生。

本发明还采用荧光分光光度计测定了各试验中金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的ROS产量，如图8b所示，其结果与CLSM图像一致。当高剂量的ROS超过金黄色葡萄球菌和白色念珠菌本身的抗氧化能力阈值时，这将会对细菌造成损害。

为了验证抗菌机制，通过蛋白质凝胶电泳，分析“FCZI+激光”组中金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的DNA损伤程度。如图8c所示，PBS组中混合细菌细胞的DNA为大分子量DNA，而“FCZI+激光”组中的混合细菌细胞的DNA被分解成小分子片段，在下端聚集；此外，随着FCZI浓度的增加，DNA断裂更明显甚至完全受损。

当细胞膜受损时，蛋白质等大分子物质会从细胞中泄漏出来。测定蛋白质浓度，可以反映细菌细胞膜的受损情况。由图8d可知，“FCZI+激光”组中的胞外蛋白含量显著高于PBS组。这表明，FCZI可以作用于细胞膜，诱导细胞膜破裂，并促使蛋白质等大分子物质泄漏，从而有效抑制细菌的生长。

基于上述分析，可以获得FCZI的抗菌机理，如图8e所示：ZnO₂在酸性环境中会释放H₂O₂，促进FePOs的POD样酶活性，并释放羟基自由基(·OH)。ICG在808nm激光的激发下，也会促进羟基自由基(·OH)和单线态氧(¹O₂)的产生。从而使环境中的ROS维持在高水平，增加氧化应激，在CeO₂的协同作用下，促进DNA损伤、膜通透性改变、大分子蛋白渗漏，进而诱导细菌凋亡。同时，ICG的光热转化能力可诱导环境温度升高，进一步加速细菌灭亡。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims

1.一种多功能级联纳米酶的制备方法，其特征在于，步骤如下：

（1）制备FePOs

（2）制备FC

（3）制备FZ或FCZ

A、制备FZ

B、制备FCZ

（4）制备FZI或FCZI

A、制备FZI

B、制备FCZI

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中的高温选自120~160℃；所述步骤（2）中的升温是指，升温至60~80℃。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述高温为140℃；所述步骤（2）中的升温是指，升温至70℃。

4.权利要求1~3任一项所述方法制备的多功能级联纳米酶。

5.权利要求4所述多功能级联纳米酶在以非诊疗目的的抗菌或抗生物被膜中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，在应用所述多功能级联纳米酶抗菌或抗生物被膜时，向多功能级联纳米酶提供808nm的近红外激光照射。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述激光照射的照射功率选自0.5~1.5W/cm²。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述激光照射的照射功率选自1W/cm²。

9.权利要求4所述多功能级联纳米酶在制备具有抗菌或抗生物被膜效果的药物或制剂中的应用。

10.根据权利要求5~9任一项所述的应用，其特征在于，所述菌为金黄色葡萄球菌或白色念珠菌。