CN115887570A

CN115887570A - 延龄草提取物在制备肠黏膜损伤后的再生和修复的产品中的应用

Info

Publication number: CN115887570A
Application number: CN202111163002.9A
Authority: CN
Inventors: 李艳华; 裴雪涛; 马百平; 宋妃灵; 王思涵; 陈晓娟; 庞旭; 张博文; 张洁
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2021-09-30
Filing date: 2021-09-30
Publication date: 2023-04-04
Anticipated expiration: 2041-09-30
Also published as: CN115887570B

Abstract

本发明涉及医药领域，提出了延龄草提取物在制备肠黏膜损伤后的再生和修复的产品中的应用，所述延龄草提取物的制备方法包括：步骤1：将延龄草根茎粉碎，得到延龄草粉末；步骤2：用第一乙醇溶液浸泡所述延龄草粉末，煎煮或回流提取，过滤，收集滤液，浓缩干燥，得到所述延龄草提取物，其中，所述第一乙醇溶液浓度为0～75体积％。延龄草的提取物具有肠黏膜再生和修复的作用，对于肠黏膜损伤的科学研究和预防或治疗相关疾病具有重要意义。

Description

延龄草提取物在制备肠黏膜损伤后的再生和修复的产品中的应用

技术领域

本发明涉及医药领域。具体地，本发明涉及延龄草提取物在制备肠黏膜损伤后的再生和修复的产品中的应用。

背景技术

随着科学技术的不断进步和发展，核能的应用愈来愈广泛，辐射对人体健康的影响逐渐引起人们的广泛关注。如有突发核事故，将极有可能对其相关人员造成健康损害甚至死亡。此外，在临床上，患者接受医学诊疗期间尤其是肿瘤放射治疗过程中，其健康组织也会受到一定程度的放射损伤。人体不同组织细胞对辐射的敏感性存在差异，其中，肠道是放射损伤敏感的组织之一。高剂量电离辐射容易引发急性胃肠道综合征(acutegastrointestinal syndrome,AGS)，极大地威胁受辐射人群的生存质量。对于盆腔肿瘤放疗的病人来说，这也极大限制射线的使用剂量。目前，临床上AGS防治的方法主要是对症治疗，包括营养支持、止泻解痉、抗感染、外科手术等。近年来，研究人员在开发肠辐射损伤防护剂或缓解剂方面取得了一系列研究进展，但临床上对预防或治疗电离辐射等诱发的肠黏膜上皮损伤尚无有效的且不良反应小的药物。

除了放射线会造成肠黏膜组织的损伤外，化疗药物如5-氟尿嘧啶等也会造成肠黏膜的损伤。缺氧、酸中毒、氧自由基、炎性因子等众多因素也能引起肠黏膜上皮细胞的损伤、坏死脱落，通透性增加等。临床医生缺乏有效地促进肠黏膜上皮再生修复的药物。

现阶段，国内外多个实验室都在致力于开发有效的肠辐射防护剂或缓解剂。例如，研究发现，生长抑素类似物(如SOM230等)可通过预防辐照后胰酶依赖性肠自身消化而改善肠道辐射损伤修复，生长因子及类生长因子制剂(如胰高血糖素样肽2、LPA、肠干细胞生长因子等)可通过抑制PUMA依赖性细胞凋亡和诱导肠细胞再生来改善辐照后肠上皮的修复，TLR5激动剂(如CBLB502、MKP-7等)可降低肠细胞对辐射诱导的细胞凋亡的敏感性，内皮细胞保护剂(如鞘脂神经酰胺等)可减轻辐射引起的微血管内皮细胞凋亡或缓解内皮功能障碍，维生素E类似物(如α-生育酚、γ-生育三烯酚等)可改善肠隐窝细胞的存活率及恢复辐射受损的肠黏膜。但是，目前的肠上皮细胞再生修复药物研究仍有待发展。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够用于制备肠黏膜再生修复的产品。具体地，本发明提供了延龄草提取物的新用途——在制备肠黏膜再生修复产品中的应用。

本发明提出了延龄草提取物在制备产品中的用途。根据本发明的实施例，所述产品用于肠黏膜损伤后的再生和修复。

延龄草(学名：Trillium tschonoskii Maxim)是百合科延龄草属植物，在治疗头晕目眩、高血压、脑振荡后遗症、头晕头痛、失眠等方面有其独特的疗效，目前有利用其疗效研制专治失眠症的保健品或药物。发明人意外发现，延龄草的提取物具有肠黏膜再生和修复的作用，对于肠黏膜损伤的科学研究和预防或治疗相关疾病具有重要意义。

根据本发明的实施例，所述延龄草提取物在制备产品中的用途还可以具有下列附加技术特征：

根据本发明的实施例，本发明对于肠黏膜损伤的原因不做严格限定，可以包括但不限于电离辐射、化疗药物、炎症、缺血性疾病等造成的肠黏膜上皮的损伤。根据本发明的实施例，所述肠黏膜损伤是因辐射所造成的。延龄草提取物对因辐射(例如γ射线、X射线照射)所造成肠黏膜损伤具有明显的促修复作用。

根据本发明的实施例，所述产品用于促进小肠干细胞和肠上皮细胞的增殖。

根据本发明的实施例，所述产品用于增加肠类器官的数量、出芽数量和表面积，增加肠绒毛长度和隐窝高度。

根据本发明的实施例，所述产品用于使下列至少之一的基因表达量提高：Ascl2、Bmi1、Mam1、Cyclin D1、Myc、Fos和Jun。

根据本发明的实施例，所述产品用于提高肠隐窝中Lgr5 mRNA的表达。

根据本发明的实施例，所述产品用于促进小肠绒毛及肠隐窝的修复。

根据本发明的实施例，所述产品用于使小肠BrdU、肠隐窝中Ki67和Cyclin D1、肠隐窝中Sox9的阳性细胞数增加。

根据本发明的实施例，所述延龄草提取物的制备方法包括：步骤1：将延龄草根茎粉碎，得到延龄草粉末；步骤2：用第一乙醇溶液浸泡所述延龄草粉末，煎煮或回流提取，过滤，收集滤液，浓缩干燥，得到所述延龄草提取物，其中，所述第一乙醇溶液浓度为0～75体积％。采用上述提取方法所获得的延龄草提取物可以更好地用于肠黏膜损伤后的再生和修复，尤其是因辐射所造成的肠黏膜损伤。

根据本发明的实施例，所述延龄草根茎的药材来源为百合科延龄草属植物，包括但不限于延龄草Trillium tschonoskii Maxim.、吉林延龄草Trillium kamtschaticumPall.ex Pursh和西藏延龄草Trillium govanianum Wall.ex Royle中的一种或多种。

根据本发明的实施例，进行所述浓缩干燥之前，将所述滤液进一步进行如下操作：将所述滤液加入到层析柱中，用第二乙醇溶液进行洗脱，收集流出液，将所述浓缩液进行所述浓缩干燥，得到所述延龄草提取物，其中，所述第二乙醇溶液浓度为0～30体积％。

发明人发现，采用柱层析方式以更好地分离出利于肠黏膜再生修复的提取物。进一步地，发明人发现，滤液中的寡糖对于肠黏膜的再生修复具有极佳的效果，进而，发明人为了获得更多的寡糖进行研究发现，采用0～30体积％乙醇溶液洗脱后，流出液中寡糖含量较高，由此，所获得的提取物具有很好的肠黏膜再生修复功效。

根据本发明的实施例，进行所述浓缩干燥之前，将所述流出液再次加入层析柱中，用第三乙醇溶液进行洗脱，收集流出液，将所述浓缩液进行所述浓缩干燥，得到所述延龄草提取物，其中，所述第三乙醇溶液的浓度为0～20体积％。由此，以便于将获得的寡糖再次纯化，以进一步提高提取物中寡糖纯度。

根据本发明的实施例，所述层析柱中填充有大孔吸附树脂，优选地，所述大孔吸附树脂为非极性或弱极性大孔吸附树脂，更优选型号为AB-8型、D-101型、SP825型或HP20型。由此，可以更好地吸附滤液中除寡糖以外的其他组分，减少寡糖的吸附，从而可以更好地获得富含寡糖的提取物。

需要说明的是，本发明所描述的“产品”可以为食品、药物、保健品等。

需要说明的是，本发明对于药物的剂型不受特别限制，只要能够使前述延龄草提取物发挥再生修复肠黏膜的作用即可，具体可以包括颗粒剂、口服液、胶囊、片剂、泡腾片、粉针剂、水针剂或注射剂或各种剂型制剂。根据本发明的一个实施例，该药物的剂型可为口服剂，具体地，口服剂的溶剂为灭菌蒸馏水。

需要说明的是，本发明对于药物的给药剂量不受特别限制，只要能够使前述延龄草提取物发挥再生修复肠黏膜的作用即可，例如，给药量为1.25-10mg/kg体重，优选2.5mg/kg。在辐射损伤前或者损伤后立即给药，一般提前2天开始灌胃给药，每天一次，剂量和疗程都可根据实际情况调整。由此，能够有效修复辐射损伤的肠黏膜。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了正常小鼠小肠隐窝分离及小肠类器官培养的流程图及形态学变化图(1～6天)；

图2显示了致死剂量射线照射小鼠小肠类器官后添加延龄草提取物的寡糖部位(命名为TT-2)，经继续培养3天后小肠类器官的生长及出芽情况；

图3显示了6Gy射线照射小鼠小肠类器官后立即添加延龄草提取物的寡糖部位TT-2，经继续培养3天后小肠类器官中EdU阳性细胞及Lgr5阳性细胞比例变化情况；

图4显示了6Gy射线照射小鼠小肠类器官后立即添加延龄草提取物的寡糖部位TT-2，经继续培养3天后小肠类器官中增殖相关基因的表达情况；

图5显示了致死剂量射线照射小鼠经延龄草提取物治疗后的肠黏膜组织修复结果；

图6显示了致死剂量射线照射小鼠经延龄草提取物治疗后的小肠组织中肠黏膜上皮细胞的增殖情况；

图7显示了致死剂量射线照射小鼠经延龄草提取物治疗后的小肠组织中肠干细胞的增殖情况。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

在该实施例中，按照下列方法制备延龄草提取物：

将6kg延龄草根茎粉碎成粗粉，用50％乙醇浸泡1小时，10倍量溶剂加热回流提取3次，每次2小时，过滤，合并滤液。上述滤液于65-70℃减压浓缩至1.0g生药材/ml，0-4℃冷藏过夜，过滤，滤液上SP825大孔吸附树脂柱富集，用15％乙醇洗脱，得到洗脱物。减压浓缩洗脱物至小体积，再次上HP20大孔吸附树脂，用15％乙醇洗脱，树脂洗脱物浓缩后用冷冻干燥机干燥，收集水洗脱物冻干粉即为延龄草纯化寡糖。将以上延龄草纯化寡糖配制成适量浓度的水溶液备用。

实施例2

一、延龄草提取物的寡糖部位TT-2促进小鼠小肠类器官的辐射损伤再生

1.小鼠小肠类器官的培养

1.1实验方法

发明人对小鼠小肠隐窝进行分离及小肠类器官进行培养。具体如下：

(1)提前30分钟打开紫外灭菌灯照射超净工作台，颈椎脱臼法处死小鼠，并于75％乙醇中消毒小鼠皮肤，将镊子、眼科剪等器械于75％乙醇中消毒后烘干待用，将24孔板放入CO₂恒温细胞培养箱中预热，预冷离心机(温度设定为4℃)。

(2)提起小鼠腹部皮肤，剪开腹部皮肤，暴露小鼠腹部组织器官，在靠近胃一端剪下约20cm的小肠，分成4～5小段，在盛有冷的PBS(含100单位/mL或100μg/mL的青霉素/链霉素)的培养皿中冲洗肠段。

(3)镊子夹住肠壁，移液器吸取PBS，枪头伸入肠腔中，冲洗肠段内容物。

(4)利用眼科剪纵向剖开肠段，并将肠段剪成2mm长的小肠段，并落入预先添加有30mL冷的PBS的50mL离心管中，反复上下吹打清洗小肠段，静置30秒后弃上清液，再添加30mL冷的PBS，上下吹打清洗小肠段，至上清液中无可见杂质，静置30秒后弃上清液，留下足够液体以没过小肠段。

(5)另取一50mL离心管，加入30mL冷的2.5mM EDTA消化液，将小肠段转移至消化液中，将离心管放入4℃冰箱中的摇床上，消化孵育30分钟。

(6)取出离心管，静置30秒，弃消化液(尽量弃干净)，添加30mL含0.1％BSA的PBS，离心收集沉淀(290g，5分钟)。

(7)取出离心管，弃上层液体，加入10mL的含0.1％BSA的PBS重悬沉淀，上下吹打沉淀，至显微镜下观察有较多离体的长条形隐窝。

(8)通过70μm细胞筛网收集隐窝至另一50mL离心管，回收筛网内沉淀物至原离心管中，继续加入10mL的含0.1％BSA的PBS重悬，手动摇晃后再次过滤，重复操作至收集30mL的滤过液(内含隐窝)，离心收集沉淀(200g，5分钟)。

(9)取出离心管，弃上层液体，加入30mL含0.1％BSA的PBS重悬，离心收集沉淀(800rpm，5分钟)。

(10)取出离心管，弃上层液体，加入30mL含0.1％BSA的PBS重悬，离心收集沉淀(600rpm，5分钟)，重复离心数次，至上层液体基本清澈。

(11)取出离心管，弃上清，加10mL冷的DMEM/F-12培养基重悬沉淀，取10μL重悬液，平铺在培养皿中，计数隐窝。

(12)按60μL/孔(约200个隐窝)取出所需重悬液体积，离心收集沉淀(600rpm，5分钟)。

(13)取出离心管，弃上清，将室温(15～25℃)配置完全的IntestiCult^TM类器官生长培养基(小鼠)与冷的

Matrix按1：1的比例混合均匀后重悬沉淀，迅速接种至提前预热(37℃)的24孔板的中间孔中，孔内形成dome结构，并设立对照组和实验组，3个复孔/组，于CO₂恒温细胞培养箱中静置10～15分钟。

(14)取出24孔板，贴壁加入600μL/孔的室温(15～25℃)配置完全的IntestiCult^TM类器官生长培养基(小鼠)培养，周边孔中添加等体积的PBS，每周更换3次新鲜培养基。

1.2实验结果

通过进行正常C57BL/6小鼠体内分离小肠组织收集小肠隐窝，逐渐形成小肠类器官(如图1A所示)。经过培养发现，小鼠小肠隐窝接种入24孔板后的第1天，成活的小肠隐窝逐渐变为囊状的类圆球形结构，分布不均，大小不等，形态透亮，轮廓清晰可见。第2天开始，圆球形结构逐渐增大，内部类似于小肠腔的中空结构。当小肠隐窝培养3天，在圆球形结构的外侧会有少量的芽状的上皮结构向各方向伸展突起。培养至第4天时，隐窝中的细胞逐渐发育形成较为完整的小肠类器官结构。随着培养天数的延长，小肠类器官的出芽数量也逐渐增加。原代小肠类器官培养至第6天，其出芽特征更为明显，此时，小肠类器官体积及表面积较大(如图1B所示)，通常需要传代培养。

2.延龄草提取物的寡糖部位TT-2促进⁶⁰Co射线源(γ射线)照射的小肠类器官的生长及出芽

2.1实验方法

(1)将步骤1.1获得的小鼠小肠隐窝培养4天以形成小肠类器官。

(2)将小肠类器官暴露于6Gy辐射处理(如图2A所示)。

(3)照射后，将实验组的小肠类器官在含TT-2的完全培养基中培养3天，对照组培养基中不添加TT-2。

(4)在显微镜下对6Gy照射后第3天的小肠类器官进行形态学成像，并随机统计各小肠类器官的形成数量、出芽数量及表面积大小。

2.2实验结果

通过形态学成像发现，与6Gy照射后第3天的对照组(形成数量21±1.927个，出芽数量2.47±0.834个，表面积79.80±3.913μm²×10³)相比，TT-2处理组显著增加了小肠类器官的形成数量(35.40±2.028个)、出芽数量(7.13±1.125个)和表面积(171.20±6.178μm²×10³)(如图2B所示)。以上结果提示，延龄草提取物TT-2可能具有促进γ射线照射的小肠类器官生长的作用。

3.延龄草提取物的寡糖部位TT-2促进γ射线照射的小肠类器官中小肠干细胞及肠上皮细胞的增殖

3.1实验方法

按照2.1实验方法分离Lgr5-EGFP-IRES-creERT2小鼠小肠隐窝并培养形成小肠类器官，而后建立实验组和对照组。按照以下步骤分别处理实验组和对照组的小肠类器官，具体如下：

(1)提前2小时向小肠类器官的培养基中添加EdU(10μM，试剂A)孵育。

(2)取出培养有小鼠小肠类器官的24孔板，弃24孔板中的旧培养基，各孔中加入500μL cell recovery solution，静置于冰上20分钟。

(3)按照如下配方，配置消化液：7.5mL Collagenase IV，7.5mL Dispase II，45mLDMEM/F-12with 15mM HEPES，0.2mg/mL DNase I，10％FBS。

(4)利用PBS充分润湿50mL离心管，使用1mL移液器吹散孔内dome结构，将孔中内容物全部转移至50mL离心管中，离心收集沉淀(600rpm，5分钟)。

(5)取出离心管，弃上清，沉淀用冷的DMEM/F-12培养基重悬，离心收集沉淀(600rpm，5分钟)。

(6)取出离心管，弃上清，沉淀用提前配置好的消化液重悬，使用1mL移液器充分吹打混匀，于37℃水浴锅中孵育30分钟，每隔10分钟取出离心管，再次充分吹打混匀，至显微镜下观察到绝大多数小肠类器官已分散为单个细胞。

(7)通过40μm细胞筛网收集细胞至另一50mL离心管，离心收集沉淀(2000rpm，5分钟)，沉淀即为单个细胞。

(8)添加3mL的1％BSA的PBS洗涤细胞，2000rpm离心5分钟，弃上清液。

(9)添加100μL的

fixative(试剂D)重悬细胞，混匀后于室温下避光孵育15分钟。

(10)添加3mL的含1％BSA的PBS洗涤细胞，2000rpm离心5分钟，弃上清液。

(11)添加100μL的

saponin-based permeabilization and washreagent(试剂E)重悬细胞，混匀后于室温下避光孵育15分钟。

(12)将

EdU buffer additive(试剂G)按1:9制备成

EdUbuffer additive。

(13)根据下表制备

Plus reaction cocktails，添加0.5mL的

Plus reaction cocktails，吹打混匀细胞，于室温下避光孵育30分钟。

表1

Plus reaction cocktails配置参考

(14)添加3mL的

saponin-based permeabilization and washreagent(试剂E)，洗涤细胞，2000rpm离心5分钟，弃上清液。

(15)加入1mL的PBS重悬细胞，2000rpm离心5分钟，弃上清，加入250μL的PBS重悬，利用70μm细胞筛网将细胞滤过至96孔板内，于流式细胞仪中检测细胞中EdU掺入情况。

3.2实验方法

通过进行流式细胞术检测实验。结果显示，与对照组(14.8±1.4％)相比，TT-2处理组显著增加了小肠类器官的EdU阳性细胞的比例(22.2±0.7％)(如图3B所示)。同时流式细胞术检测小肠类器官中Lgr5-EGFP阳性细胞比例，结果显示，与对照组(2.6±0.6％)相比，TT-2处理组显著增加了小肠类器官的Lgr5-EGFP阳性细胞比例(7.6±1.6％)(如图3A所示)。表明延龄草提取物TT-2可能是通过促进γ射线照射的小肠类器官中小肠干细胞及肠上皮细胞的增殖而促进小肠类器官的生长。

4.延龄草提取物的寡糖部位TT-2促进γ射线照射的小肠类器官中小肠干细胞及增殖相关基因的表达并抑制凋亡相关基因的表达

4.1实验方法

按照以下步骤分别处理实验组和对照组的小肠类器官，具体如下：

(1)提前30分钟打开紫外灭菌灯照射超净工作台。

(2)从CO₂恒温细胞培养箱中取出24孔板，贴壁吸出24孔板中的旧培养基。

(3)各孔中加入500μL的cell recovery solution，静置于冰上20分钟。

(4)移液器吹散孔内dome结构，将孔中内容物全部转移至已提前润湿的50mL离心管中，离心收集沉淀(600rpm，5分钟)。

(5)取出离心管，弃上清，加入10mL冷的PBS重悬沉淀，并转移至1.5mL EP管中，离心收集沉淀(600rpm，5分钟)。

(6)取出1.5mL EP管，弃上清，加入1mL的Trizol，充分裂解小肠类器官，可暂存入-80℃冰箱中。

(7)预冷离心机(温度设定为4℃)，向1.5mL EP管中添加0.2mL的三氯甲烷(氯仿)，涡旋15秒，室温静置3分钟，4℃12000rpm离心15分钟。

(8)离心后1.5mL EP管中液体分为3层，从上到下分别为：无色水相(内含RNA)、蛋白层、氯仿层，小心吸取400μL的上层液体，转移至新的1.5mL EP管中，注意勿吸中间层。

(9)向新的1.5mL EP管中添加0.5mL的预冷的异丙醇，混匀，冰上静置10分钟，4℃12000rpm离心15分钟。

(10)取出1.5mL EP管，弃上清，添加0.5mL的75％乙醇洗涤沉淀1次，混匀，4℃12000rpm离心10分钟。

(11)取出1.5mL EP管，弃上清，小心吸干1.5mL EP管壁残留的乙醇，于通风橱中吹干1.5mL EP管中液体(注意时间不宜过长)。

(12)添加DNase/RNase-Free water溶解RNA沉淀，具体添加的体积可以根据沉淀的量进行调节。

(13)利用Nanodrop软件，测量RNA浓度，可存于-80℃保存待用。

(14)进行RNA预变性：将RNA(一般多加些样品量)在65℃加热5分钟，而后放置在冰上急冷2分钟，低速离心使RNA沉于管底。

(15)进行反转录：取出PCR管，于冰上配置以下的反转录体系，充分混匀，运行程序为：37℃15分钟，50℃5分钟，98℃5分钟，4℃维持。结束程序后可将反转录得到的cDNA暂存于-20℃冰箱。

表2反转录体系

RNA变性溶液	800ng
		5×RT Master Mix	4uL
DNase/RNase-Free water	补全至20uL

(16)添加DNase/RNase-Free water溶解引物，并按1：10比例稀释引物。引物序列如表所示。

表3各基因所用引物序列(2)

(17)添加DNase/RNase-Free water按1：10比例稀释模板。

(18)取PCR管，按以下反应体系配置，并充分混匀。

表4反应体系

SYBR Green PCR Master Mix	10μL
		DNase/RNase-Free water	7μL
前引物	0.5μL
		后引物	0.5μL
cDNA	2μL
		反应总体积	20μL

(19)运行Bio-Rad iQ5仪器，反应条件：95℃3min；(95℃，10s；退火，30s；72℃，30s；80℃，10s)，40cycles；55℃，10s(8cycles，每0.5℃读一次数，end temperature 95℃)；4℃，∝。

(20)反应结束后，整理实验台并关闭iQ5仪器。

4.2实验结果

通过对小肠类器官基因表达情况进行分析。结果表明，与对照组相比，TT-2处理组显著上调了受照的小肠类器官中ISC相关基因(Ascl2，Bmi1，Mam1)和增殖相关基因(CyclinD1，Myc，Fos，Jun)的表达(如图4所示)。这些结果表明TT-2具有在体外促进小肠类器官的生长和ISC增殖等作用。

二、延龄草提取物的寡糖部位TT-2促进辐射损伤小鼠模型小肠上皮细胞修复

1.腹部照射(Abdominal irradiation,ABI)小鼠模型的建立

1.1实验方法

按照以下方法建立实验组和对照组小鼠，具体如下：

(1)将小鼠随机分成对照组和实验组，3只/组，于照射前2天开始进行TT-2灌胃给药处理，300μL/只，对照组给予同体积的H₂O。

(2)照射当天，利用γ射线照射小鼠，照射剂量为14Gy，剂量率为68.652cGy/min。

(3)照射完毕，继续饲养小鼠，并每天于相同时间点进行灌胃给药，共计给药7天(如图5A所示)。

1.2小肠隐窝高度及绒毛长度的检测

按照以下H&E染色实验分别处理实验组和对照组小肠切片，并统计分析小肠隐窝高度及绒毛长度，具体如下：

(1)小鼠照射后第4天，颈椎脱臼法处死小鼠，分离小肠组织，包埋后制成小肠石蜡切片。

(2)将小肠石蜡切片放入烤片机中60℃熔化脱蜡60分钟。

(3)将切片趁热放入二甲苯中浸泡10分钟×3次；去除多余的液体后，依次放置于100％、90％、70％乙醇中各浸泡5分钟。

(4)将切片浸泡于Mayer苏木素中染核5分钟，后经自来水洗涤。

(5)将切片浸泡于1％氨水中返蓝1分钟，后经自来水洗涤。

(6)将切片放入95％乙醇中浸泡2分钟。

(7)将切片浸泡于酸化伊红乙醇液静置2～5分钟，后经自来水洗涤。

(8)脱水、透明：将切片放入90％乙醇中浸泡30秒～1分钟；去除多余的液体后，迅速转移至100％乙醇中浸泡4分钟；去除多余的液体后，放入二甲苯中透明10～20分钟。

(9)封片：取出切片，去除多余的液体，于通风橱内滴加中性树胶，小心盖上盖玻片，避免产生气泡，于通风橱内晾干。

(10)观察结果：于光学显微镜下观察染色结果。

1.3实验结果

据研究报道，隐窝基底部中的ISC最初处于非活跃状态，通常在辐照后数小时至4天内被激活启动，并且在隐窝的再生中发挥着重要的作用。因此，我们选择在ABI后4天收集肠道组织，并将其制成小肠石蜡切片。通过对小肠石蜡切片进行H&E染色实验，以对小肠进行组织学分析。结果表明，ABI后4天，与对照组(绒毛长度207.10±10.493μm，隐窝高度56.30±5.106μm)相比，添加TT-2处理组显著增加了肠绒毛长度(346.3±12.811μm)和隐窝高度(113.28±5.634μm)(如图5B所示)。以上结果表明，口服TT-2可以显著促进ABI小鼠小肠绒毛及隐窝的修复。

2.延龄草提取物的寡糖部位TT-2促进腹部照射损伤小鼠小肠隐窝细胞的增殖

2.1实验方法

按照以下免疫组化染色实验方法分别处理实验组和对照组小肠切片，具体如下：

(1)小鼠照射后第4天，颈椎脱臼法处死小鼠，分离小肠组织，包埋后制成石蜡切片。

(2)将小肠石蜡切片放入烤片机中60℃熔化脱蜡60分钟。

(3)将切片趁热放入二甲苯中浸泡5分钟×2次；去除多余的液体后，置于100％乙醇中浸泡3分钟×2次；去除多余的液体后，置于95％乙醇中浸泡3分钟；去除多余的液体后，置于70％乙醇中浸泡3分钟。

(4)配置Tris-EDTA抗原修复液，将切片放入配好的Tris-EDTA抗原修复液中，放入微波炉内中火修复8分钟，而后自然冷却至室温。

(5)将切片取出，用吸水纸吸干周围水分，用免疫组化笔在组织周围画圈，以便使后续滴加的液体停留在圈内。

(6)在圆圈内组织上滴加100μL内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育10分钟，PBS冲洗3分钟×3次。

(7)用抗原修复液稀释抗体至适当浓度，根据组织大小，滴加100μL的一抗，于37℃孵育60分钟，PBS冲洗3分钟×3次。

(8)滴加100μL反应增强液(试剂2)，室温孵育20分钟，PBS冲洗3分钟×3次。

(9)滴加100μL增强酶标山羊抗兔IgG聚合物(所选用一抗为兔克隆抗体)，室温孵育20分钟，PBS冲洗3分钟×3次。

(10)DAB显色：加入适量新鲜配制的DAB显色液，室温孵育，并根据光学显微镜下观察到的染色结果控制染色时间，阳性染色结果呈现灰黑色。或使用其他显色液，如VECTORNovaRED Peroxidase Substrate Kit，阳性染色结果呈现褐色。

(11)复染：自来水冲洗多余的显色液，滴加苏木素染色液孵育30秒；滴加PBS冲洗返蓝。

(12)脱水、透明：将小肠石蜡切片放入70％乙醇中浸泡2分钟；去除多余的液体后，置于95％乙醇中浸泡2分钟；去除多余的液体后，置于100％乙醇中浸泡2分钟×2次；去除多余的液体后，置于二甲苯中浸泡8分钟×2次。

(13)封片：取出切片，去除多余的液体，于通风橱内滴加中性树胶，小心盖上盖玻片，避免产生气泡，于通风橱内晾干。

(14)观察结果：于光学显微镜下观察染色结果。

2.2实验结果

通过进行了12小时的5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU)示踪实验，以评价ABI小鼠小肠上皮细胞的增殖情况。将小鼠于14Gy ABI后第3天进行腹腔注射BrdU(注射剂量为100mg/kg)，辐射后第4天时颈椎脱臼法处死小鼠，收集小肠组织，制成小肠石蜡切片，添加抗BrdU抗体标记后进行免疫组织化学染色。结果显示，与ABI后4天的对照组(21.142±5.793个)相比，TT-2处理组的小鼠小肠切片中的BrdU的阳性细胞数(66.58±3.907个)明显增加(如图6A小肠组织切片的褐色染色所示)。同时，对小肠石蜡切片进行增殖相关蛋白(Ki67,Cyclin D1)的免疫组织化学染色实验，结果表明，与对照组(Ki67：13.88±2.803个，Cyclin D1：5.70±1.636个)相比，TT-2处理组的小鼠隐窝中Ki67(52.88±7.849个，如小肠组织切片的褐色染色所示)和Cyclin D1(20.80±3.560个，如小肠组织切片的灰黑色染色所示)的阳性细胞数量显著增加(如图6B和C所示)。

3.延龄草提取物的寡糖部位TT-2促进ABI小鼠小肠干细胞的增殖

3.1实验方法

按照以下原位杂交实验方法分别处理实验组和对照组小肠切片，具体如下：

(2)将小肠石蜡切片放入烤片机中60℃熔化脱蜡60分钟。

(3)将切片趁热放入二甲苯中浸泡5分钟×2次；去除多余的液体后，放置于新鲜的100％乙醇中浸泡1分钟×2次；取出切片，正面朝上置于吸水纸上，室温风干切片至完全干燥。

(4)提前30分钟打开杂交炉，设置温度为40℃；准备湿盒，放入吸水纸，加入蒸馏水将其彻底浸湿，放入杂交炉中预热30分钟。

(5)取出切片，滴加

Hydrogen Peroxide，室温孵育10分钟；在吸水纸上轻敲切片，去除多余的

Hydrogen Peroxide，立即插入盛满蒸馏水的清洗皿中，上下移动清洗切片3～5次。

(6)用蒸馏水将

Target Retrieval(10×)稀释为

TargetRetrieval(1×)，用锡箔纸或PE手套封口后放入微波炉中，高火4分钟至沸腾，后中低火中保温；将切片缓慢地放入

Target Retrieval(1×)中，再次用锡箔纸或PE手套封口，放入微波炉中，于中低火中修复15分钟。

(7)立即将热切片放入盛有蒸馏水的染色皿中，上下移动清洗切片3～5次。

(8)将切片放入新鲜的100％乙醇中清洗切片，室温风干切片至完全干燥。

(9)用免疫组化笔在组织周围画圈，以便使后续滴加的液体停留在圈内，在室温下完全干燥疏水圈或选择过夜干燥。

(10)在圆圈内组织上滴加

Protease Plus，使其完全覆盖组织，放入湿盒内，放回杂交炉，于40℃孵育30分钟。

(11)将切片放入蒸馏水中上下移动清洗切片3～5次。

(12)将

Wash Buffer(50×)在40℃预热10～20分钟，用蒸馏水稀释至

Wash Buffer(1×)，室温下可储存一个月。

(13)制备0.02％氨水，充分混匀，可用于苏木素染色后的返蓝。

(14)将

2.5HD Amp 1～6置于室温下，而杂交炉、湿盒则始终维持在40℃环境中，

Probe Mm-Lgr5每次使用前在40℃中加热10分钟，而后冷却至室温，轻缓涡旋混合。

(15)轻敲切片去除多余液体，滴加

Probe Mm-Lgr5覆盖切片，放入湿盒，置于杂交炉中40℃孵育2小时。

(16)滴加

Wash Buffer(1×)在室温下清洗切片2分钟×2次。

(17)滴加

2.5HD Amp 1于40℃孵育30分钟，后用

WashBuffer(1×)清洗切片2分钟×2次。

(18)滴加

2.5HD Amp 2于40℃孵育15分钟，后用

WashBuffer(1×)清洗切片2分钟×2次。

(19)滴加

2.5HD Amp 3于40℃孵育30分钟，后用

WashBuffer(1×)清洗切片2分钟×2次。

(20)滴加

2.5HD Amp 4于40℃孵育15分钟，后用

WashBuffer(1×)清洗切片2分钟×2次。

(21)滴加

2.5HD Amp 5于室温孵育30分钟，后用

WashBuffer(1×)清洗切片2分钟×2次。

(22)滴加

2.5HD Amp 6于室温孵育30分钟，后用

WashBuffer(1×)清洗切片2分钟×2次。

(23)按

Fast Red B：Red A＝1：60比例制备Red工作液，需在5分钟内避光使用。

(24)各切片滴加约120μL的Red工作液以覆盖组织，放入湿盒内室温孵育10分钟，立即将切片放入盛满蒸馏水的清洗皿中清洗2次。

(25)复染：滴加苏木素染色液孵育约2分钟，或可根据组织实际着色情况调整染色时间，切片应呈紫色，蒸馏水清洗切片，去除染色液。

(26)将切片放入0.02％氨水中，上下移动切片架2～3次，待切片组织变成蓝色，立即用蒸馏水清洗3～5次。

(27)封片：取出切片架，于60℃干燥箱中干燥切片约15分钟，至切片完全干燥；室温下冷却切片5分钟；滴加封片剂，小心将盖玻片放在组织切片上，避免形成气泡，而后将切片晾干保存。

(28)观察结果：于光学显微镜下观察着色情况。

3.2实验结果

通过检测了小鼠小肠切片中Lgr5 mRNA和Sox9蛋白的表达。Lgr5和Sox9是活跃的ISC的主要marker，在肠隐窝再生过程中发挥着至关重要的作用。通过Lgr5原位杂交实验发现，与对照组相比，TT-2给药组显著提高了肠隐窝中Lgr5 mRNA的表达(如图7A所示)。并且，通过对小肠石蜡切片的免疫组化染色发现，与ABI后4天的对照组(8.56±1.333个)相比，TT-2给药组显著提高了肠隐窝中Sox9的阳性细胞数(20.22±3.153个)(如图7B所示)，表明TT-2促进了ABI小鼠的小肠干细胞的增殖。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 延龄草提取物在制备肠黏膜损伤后的再生和修复的产品中的应用

<130> BI3211810

<160> 20

<170> PatentIn version 3.3

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tcagtcaacg ggggacataa a 21

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> Artificial

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ggtcggtgta gtggtgatgt 20

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> Artificial

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<212> DNA

<213> Artificial

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<212> DNA

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<210> 18

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<212> DNA

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<223> 20

<400> 20

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Claims

1.延龄草提取物在制备产品中的用途，其特征在于，所述产品用于肠黏膜损伤后的再生和修复。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肠黏膜损伤是因辐射所造成的。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述产品用于促进小肠干细胞和肠上皮细胞的增殖；

所述产品用于增加肠类器官的数量、出芽数量和表面积，增加肠绒毛长度和隐窝高度。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述产品用于使下列至少之一的基因表达量提高：Ascl2、Bmi1、Mam1、Cyclin D1、Myc、Fos和Jun；

所述产品用于提高肠隐窝中Lgr5 mRNA的表达。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述产品用于促进小肠绒毛及肠隐窝的修复。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述产品用于使小肠BrdU、肠隐窝中Ki67和Cyclin D1、肠隐窝中Sox9的阳性细胞数增加。

7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述延龄草提取物的制备方法包括：

步骤1：将延龄草根茎粉碎，得到延龄草粉末；

步骤2：用第一乙醇溶液浸泡所述延龄草粉末，煎煮或回流提取，过滤，收集滤液，浓缩干燥，得到所述延龄草提取物，其中，所述第一乙醇溶液浓度为0～75体积％；

任选地，所述延龄草根茎的药材来源为百合科延龄草属植物，包括但不限于延龄草Trillium tschonoskii Maxim.、吉林延龄草Trillium kamtschaticum Pall.ex Pursh和西藏延龄草Trillium govanianum Wall.ex Royle中的一种或多种。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，进行所述浓缩干燥之前，将所述滤液进一步进行如下操作：将所述滤液加入到层析柱中，用第二乙醇溶液进行洗脱，收集流出液，将所述浓缩液进行所述浓缩干燥，得到所述延龄草提取物，其中，所述第二乙醇溶液浓度为0～30体积％。

9.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，进行所述浓缩干燥之前，将所述流出液再次加入层析柱中，用第三乙醇溶液进行洗脱，收集流出液，将所述浓缩液进行所述浓缩干燥，得到所述延龄草提取物，其中，所述第三乙醇溶液的浓度为0～20体积％。

10.根据权利要求8或9所述的用途，其特征在于，所述层析柱中填充有大孔吸附树脂，优选地，所述大孔吸附树脂为非极性或弱极性大孔吸附树脂，更优选型号为AB-8型、D-101型、SP825型或HP20型。