CN115873967A - 核酸分子及其应用和检测禽毛滴虫核酸样本中基因组污染的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种核酸分子，至少含有一个内含子片段，所述内含子区域至少大于50bp；所述内含子的核苷酸序列如SEQ ID:NO.1所示。通过观察禽毛滴虫核酸样本的扩增产物在琼脂糖凝胶电泳分离结果中是否存在预期条带，可以直观判断样品的RNA是否存在基因组DNA污染，也适用于禽毛滴虫cDNA样品中基因组DNA污染的检测。本发明通过对禽毛滴虫核酸样品的基因组污染检测，操作简单，重复性高，特异性强。

Description

核酸分子及其应用和检测禽毛滴虫核酸样本中基因组污染的 方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及核酸分子及其应用和检测禽毛滴虫核酸样本中基因组污染的方法。

背景技术

鸽毛滴虫病(又称“鸽癀”)也是养鸽场高发的消耗性寄生虫病，对肉鸽生产性能和幼鸽存活率均具有重要危害性。最常见的特征变化是口腔和咽喉黏膜形成粗糙钮扣状的黄色沉着物；湿润者，称为湿性溃疡；呈干酪样或痂块状则称为干性溃疡。脐部感染时，皮下形成肿块，呈干酪样或溃疡性病变；波及内脏器官时，便引起黄色粗糙界线明显的干酪样病灶，结果导致实质器官组织坏死。病鸽因口腔溃疡而妨害采食，在幼鸽和生长期鸽中可引起很高的死亡率。鸽毛滴虫病的病原是禽毛滴虫，属鞭毛亚门，动鞭毛纲，多鞭毛目，毛滴虫科，毛滴虫属。实验室诊断一般通过显微镜检查口腔、食道、嗉囊分泌物涂片发现虫体，或刮取病变处黏液制成涂片，染色镜检见到典型虫体。禽毛滴虫虫体呈瓜子形或梨形，虫体前端有毛基体伸出4根鞭毛，使虫体可迅速移动。在虫体的一侧有波动膜，其起始于虫体的前端，终止于虫体稍后方虫体前部有1椭圆形的核，虫体前部与波动膜相对，一侧有胞口，虫体中央有一根细长的轴柱自前向后伸延至虫体后缘之外。虫体凭借在体液中作螺旋式运动，以分裂方式增殖，约4小时便可增殖一世代。目前对于该病原的致病机制研究仍很少，究其原因，在于缺乏有效的基因水平检测手段。

聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。逆转录是指以RNA为模板合成与其互补的cDNA的过程。逆转录PCR是将RNA的逆转录(ReverseTranscription)和cDNA的聚合酶链式反应(PCR)相结合的技术，故逆转录称为RT-PCR或反转录PCR。逆转录PCR实验原理是，提取组织或细胞中的总RNA，以RNA为模板，利用逆转录酶反转录成cDNA，再以cDNA链为模板进行PCR扩增，从而获得大量拷贝。逆转录PCR的出现使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。逆转录PCR的用途广泛，可用于分析基因的转录产物、检测细胞中RNA病毒的含量、合成cDNA探针、直接克隆特定基因的cDNA序列等。如在临床上RT-PCR可以用于遗传病诊断、癌症检测、检测病人标本中的RNA病毒，如HAV、HCR、HIV等。在植物方面RT-PCR常用于研究环境胁迫对植物基因表达的影响，以及在特定的环境或生长阶段中植物体不同部位基因表达的差异性。使用RT-PCR检测分析RNA转录产物具有以下突出的优点：理论上可以检测几乎任何基因的转录产物；可以实现极为微量RNA样品(ng级别)的检测；样品耐受性好，未经纯化的粗制生物样品也可以用于检测。

但是，RNA样本中基因组DNA的残留，不仅影响RNA浓度定量，也对抑制荧光定量的扩增效率，因此，基因组DNA的污染对荧光定量的准确性影响很大。目前，市面上RNA提取和cDNA制备试剂盒都没有专门用于毛滴虫开发的，当研究者按照试剂盒操作说明进行RNA提取或cDNA制备时，虽然都完全按照试剂盒要求进行DNase消化步骤，但DNA是否清理彻底，无法估计。目前原生生物仍旧很少关注这个污染问题，特别毛滴虫，目前都没有相关检测技术，而禽毛滴虫缺乏有效的参考基因组和转录组序列，更加难以设计相关检测技术规避禽毛滴虫RNA或cDNA样品的基因组污染问题。

发明内容

基于此，为了解决上述问题，有必要提供一种适合作为禽毛滴虫DNA和RNA界定的参考基因，并根据cDNA和基因组片段差别，设计相关引物，建立一种检测禽毛滴虫核酸样本中基因组污染的方法。

本发明的第一目的在于提供一种核酸分子，其特征在于，至少含有一个内含子片段，所述内含子区域至少大于50bp；所述内含子的核苷酸序列如SEQID:NO.1所示。

本发明的第二目的在于提供了一种检测所述的核酸分子的试剂在制备禽毛滴虫核酸检测产品中的应用。

在其中一个实施例中，所述试剂包括扩增所述核酸分子的PCR引物对。

在其中一个实施例中，所述PCR引物对的序列如SEQ ID:NO.2和SEQID:NO.3所示。

本发明的第三目的在于提供了一种禽毛滴虫核酸检测试剂盒，包括定义的试剂。

在其中一个实施例中，所述检测试剂盒还包括样本核酸提取试剂和扩增试剂中的一种或者多种。

在其中一个实施例中，所述扩增试剂包括扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg²⁺中的一种或者多种。

本发明的第四目的在于提供了一种检测禽毛滴虫核酸样本中基因组污染的方法，包括以下步骤：

提供待测禽毛滴虫核酸样本；

以提取的核酸样本作为模板，加入所述的PCR引物对进行PCR扩增反应，制备PCR扩增反应产物；

检测所述PCR扩增反应产物，并根据所得检测结果确定待测禽毛滴虫核酸样本是否存在基因组污染。

所述核酸样本选自禽毛滴虫DNA样本、禽毛滴虫RNA样本和禽毛滴虫cDNA样本中的一种或多种。

在其中一个实施例中，检测所述PCR扩增反应产物的方法为凝胶电泳。

可选地，根据所得检测结果确定待测禽毛滴虫核酸样本是否存在基因组污染，包括：

若样本中检测出禽毛滴虫DNA条带，确定待测禽毛滴虫核酸样本存在基因组污染；

若样本中未检测出禽毛滴虫DNA条带，确定待测禽毛滴虫核酸样本不存在基因组污染。

与传统技术相比，本发明的有益效果为：

本发明能够根据扩增产物在琼脂糖凝胶电泳分离结果中是否存在基因组核酸条带，不仅可以直观判断样品的RNA是否存在基因组污染，也适用于禽毛滴虫cDNA样品中基因组污染的检测。本发明对禽毛滴虫核酸样品的基因组DNA污染检测，操作简单，重复性高，特异性强。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1禽毛滴虫CAMK基因含内含子DNA片段和对应mRNA片段的扩增结果；其中，泳道M为DL500；泳道1为未经DNase处理的cDNA扩增产物；泳道2为禽毛滴虫CAMK基因基因组DNA扩增产物；泳道3为禽毛滴虫CAMK基因cDNA扩增产物；

图2为本发明实施例1中禽毛滴虫CAMK基因含内含子的DNA片段和对应mRNA片段的序列比对结果；其中，下标箭头横线区域为检测引物预期匹配区域；

图3为本发明实施例2中有DNAase消化步骤时基因组DNA污染检测结果；其中，泳道M为DL500；泳道1～8为不同分离株经过试剂盒带DNAase消化步骤提取得到的RNA样本，再经反转录和基因组DNA污染检测结果；

图4为本发明实施例2中无DNAase消化步骤时基因组DNA污染检测结果；其中，泳道M为DL500；泳道1～8分别为不同分离株利用试剂盒不带DNAase消化步骤提取得到的RNA样本，再经反转录和基因组DNA污染检测结果。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。

术语解释

“引物”指寡核苷酸，无论其是在经纯化的限制性消化物中天然存在或是合成产生的，所述寡核苷酸当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下时(例如，存在核苷酸和诱导剂诸如DNA聚合酶和在合适的温度和pH下)，所述寡核苷酸能够作为合成的起始点而起作用。引物优选是单链的，以用于扩增的最大效率，但可选地也可以是双链的。如果是双链的，则在用于制备延伸产物前，首先将引物处理以分开其链。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物应足够长，以在诱导剂存在的情况下引发延伸产物的合成。引物的精确长度将取决于许多因素，包括温度、引物来源和方法的使用。例如，在一些实施方案中，引物范围为10～100或更多个核苷酸(例如10～300、15～250、15～200、15～150、15～100、15～90、20～80、20～70、20～60、20～50个核苷酸等)。

“内含子”又称间隔顺序，指一个基因或mRNA分子中无编码作用的片段。是真核生物细胞DNA中的间插序列。这些序列被转录在前体RNA中，经过剪接被去除，最终不存在于成熟RNA分子中。内含子和外显子的交替排列构成了割裂基因。在前体RNA中的内含子常被称作“间插序列”。在转录后的加工中，它比外显子有更多的突变。内含子是一段特殊的DNA序列。

“逆转录”即反转录，是以RNA为模板，通过逆转录酶，合成DNA的过程，是DNA生物合成的一种特殊方式。逆转录酶的作用是以dNTP为底物，以RNA为模板，tRNA(主要是色氨酸tRNA)为引物，按5’→3’方向，合成一条与RNA模板互补的DNA单链，这条DNA单链叫做互补DNA(complementary DNA,cDNA)，它与RNA模板形成RNA-DNA杂交体。随后又在逆转录酶的作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA链。至此，完成由RNA指导的DNA合成过程。

“逆转录PCR”是将RNA的逆转录(reverse transcription)和cDNA的聚合酶链式反应(PCR)相结合的技术，故逆转录称为RT-PCR或反转录PCR。逆转录PCR实验原理是，提取组织或细胞中的总RNA，以RNA为模板，利用逆转录酶反转录成cDNA，再以cDNA链为模板进行PCR扩增，从而获得大量拷贝。逆转录PCR的出现使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。

本发明中，涉及“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。

本发明中，涉及“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。

本发明中，涉及“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本发明保护范围的限制。

本发明中，涉及“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等中，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。

本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。

本发明的第一目的在于提供一种核酸分子，其特征在于，至少含有一个内含子片段，所述内含子区域至少大于50bp；所述内含子的核苷酸序列如SEQID:NO.1所示。

本发明的第二目的在于提供了一种检测所述的核酸分子的试剂在制备禽毛滴虫核酸检测产品中的应用。

可选地，所述试剂包括扩增所述核酸分子的PCR引物对。

可选地，所述PCR引物对的序列如SEQ ID:NO.2和SEQ ID:NO.3所示。

本发明的第三目的在于提供了一种禽毛滴虫核酸检测试剂盒，包括定义的试剂。

可选地，所述检测试剂盒还包括样本核酸提取试剂和扩增试剂中的一种或者多种。

可选地，所述扩增试剂包括扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg²⁺中的一种或者多种。

可选地，所述试剂盒还包括逆转录酶和逆转录引物，从而便于提取待测样本的RNA并进行逆转录得到cDNA。

可选地，DNA聚合酶为热启动Taq酶。

可选地，dNTPs包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP以及dUTP。

可选地，试剂盒包括2×Taq PCR Master Mix、所述PCR引物对和超纯水。其中，2×Taq PCR Master Mix购自TAKARA公司，所述PCR引物对分别为10μmol/L，超纯水为低于18.30MΩ·CM反渗透用水。

本发明的第四目的在于提供了一种检测禽毛滴虫核酸样本中基因组污染的方法，包括以下步骤：

提供待测禽毛滴虫核酸样本；

以提取的核酸样本作为模板，加入所述的PCR引物对进行PCR扩增反应，制备PCR扩增反应产物；

检测所述PCR扩增反应产物，并根据所得检测结果确定待测禽毛滴虫核酸样本是否存在基因组污染。

可选地，所述核酸样本选自禽毛滴虫DNA样本、禽毛滴虫RNA样本和禽毛滴虫cDNA样本中的一种或多种。可选地，所述PCR扩增反应的条件为94℃预变性3min～5min；94℃变性25s～35s，52℃退火25s～35s，72℃延伸15s～25s，34～36个循环；72℃延伸4min～6min。

所述PCR扩增反应的条件可以根据缓冲液盐离子浓度以及变性核酸的长度和核苷酸组成、反应特征和核酸长度等具体确定和调整，如在一个优选的具体示例中，可按照如下程序进行：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸20s，35个循环；72℃延伸5min。

可选地，所述PCR扩增反应的体系包括模板、所述PCR引物对、2×Taq PCR MasterMix。

进一步地，所述PCR扩增反应的体系包括模板50ng～200ng、所述PCR引物对分别为2μL、2×Taq PCR Master Mix 25μL、超纯水补充体积至50μL。

可选地，检测所述PCR扩增反应产物的方法为凝胶电泳。

可选地，根据所得检测结果确定待测禽毛滴虫核酸样本是否存在基因组污染，包括：

若样本中检测出禽毛滴虫DNA条带，确定待测禽毛滴虫核酸样本存在基因组污染；

若样本中未检测出禽毛滴虫DNA条带，确定待测禽毛滴虫核酸样本不存在基因组污染。

以下结合具体实施例进行进一步说明，以下具体实施例中所涉及的原料，若无特殊说明，均可来源于市售，所使用的仪器，若无特殊说明，均可来源于市售，所涉及到的工艺，如无特殊说明，均为本领域技术人员常规选择。

以下为具体实施例。

实施例1

钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶(Calcium/CalmodμLin-dependent proteinkinases，CAMK)是一种丝氨酸/苏氨酸特性的蛋白激酶，被钙/钙调蛋白复合物所调节。钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶与多种生命活动相关。目前禽毛滴虫的CAMK基因未有公开报道，阻碍了对该病原的基因水平检测及其致病机制研究的进展。

禽毛滴虫CAMK基因的DNA片段和cDNA片段获取与测序

1.模板的制备

1.1禽毛滴虫样本的制备

挑选1个禽毛滴虫分离株，取(1～5)×10⁶个禽毛滴虫8000g离心2分钟，去掉培养基，加入800μL PBS润洗3遍，离心去掉上清，制备禽毛滴虫样本，将所述禽毛滴虫样本平等分为3份。

1.2提取禽毛滴虫RNA，逆转录制备禽毛滴虫cDNA

取2份步骤(1)所述禽毛滴虫样本，参照Omega E.Z.N.A SE Total RNA plus kitI(R6836-01)试剂盒操作，获得禽毛滴虫RNA样本，-40℃下保存备用。

将所述禽毛滴虫RNA样本平等分为2份，取1份所述禽毛滴虫RNA样本1，参照TAKARAPrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit(6110A)反转录试剂盒说明书，制备禽毛滴虫cDNA样本1，并置于-40℃下保存备用。另1份所述禽毛滴虫RNA样本2，参照TAKARAPrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit(6110A)反转录试剂盒说明书操作，但跳过DNase I酶消化处理步骤，制备禽毛滴虫cDNA样本2，并置于-40℃下保存备用。

1.3提取禽毛滴虫总DNA

取1份步骤(1)所述禽毛滴虫样本，参照QIAamp DNA Stool Mini Kit(51504)试剂盒操作，提取禽毛滴虫总DNA样本，置于-40℃下保存备用。

2.PCR扩增反应

使用禽毛滴虫的钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶(Calcium/calmodulin-dependent protein kinases，CAMK)作为检测靶标，该检测靶标至少含有一个内含子片段，所述内含子区域至少大于50bp，所述检测靶标区域(见图2)，所述内含子区域为SEQ ID:NO.1：GTATGTATTATTTTATTTACGGACTGGAGTGATTATTTTTGCTCCAGTTCGTGATTTTTTGGTTTATTACTAACACACAG。根据所述检测靶标的内含子区域设计引物TgaIden-F：SEQID:NO.2和TgaIden-R：SEQ ID:NO.3。

所述PCR反应体系具体如表1所示，模板100ng，2μL TgaIden-F，2μLTgaIden-R，25μL 2×Taq PCR Master Mix，最后用超纯水补至体积为50μL。

表1

试剂	使用量
		2X Taq PCR Master Mix	25μL
TgaIden-F	2μL
		TgaIden-R	2μL
模板	100ng
		H<sub>2</sub>O	补至体积为50μL。

所述PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸20s，35个循环；72℃延伸5min。PCR结束后，取6μL产物用3％琼脂糖凝胶和DL500作为marker进行电泳分析并观察拍照。以3％琼脂糖凝胶和DL500作为marker进行电泳分析，50bp是肉眼可见的电泳条带差异，故将内含子区域筛选标准定义为大于50bp。

使用TgaIden-F/TgaIden-R分别以所述禽毛滴虫cDNA样本1、禽毛滴虫cDNA样本2和禽毛滴虫DNA样本为PCR扩增模板进行所述PCR扩增反应。结果见图1所示，其中，泳道M为DL500；泳道1为未经DNase处理的cDNA扩增产物；泳道2为禽毛滴虫CAMK基因基因组DNA扩增产物；泳道3为禽毛滴虫CAMK基因cDNA扩增产物；经DNAase酶处理后的cDNA样本1的PCR产物可以看到248bp左右的特征条带，DNA样本的PCR产物可以看到168bp左右的特征条带，未经DNAase酶处理后的cDNA样本2的PCR产物可以看到248bp左右和168bp左右的两条特征条带。未经DNAase酶处理的cDNA样本2有基因组污染。

对经DNAase酶处理后的cDNA样本1的PCR产物和DNA样本的PCR产物进行核酸测序，将测序结果进行比对，结果见图2。其中TgaCAMK_DNA是以DNA为模板的扩增产物测序结果；TgaCAMK_cDNA是以禽毛滴虫cDNA为模板的扩增产物测序结果。其中TgaCAMK_DNA有一段80bp左右的内含子区域。

实施例2

禽毛滴虫样本中cDNA基因组污染的检测

挑选8个禽毛滴虫分离株，每个虫株均准备两批，按照实施例1中1.1所述的禽毛滴虫样本的制备步骤制备禽毛滴虫样本批次1和禽毛滴虫样本批次2。禽毛滴虫样本批次1中的8个禽毛滴虫样本，均按照Omega E.Z.N.A SE Total RNA plus kit I(R6836-01)试剂盒的操作，获得禽毛滴虫批次1的RNA样本，-40℃下保存备用。取所述禽毛滴虫批次1中RNA样本，分别采用TAKARA PrimeScript^TM 1st Strand cDNA Synthesis Kit(6110A)反转录试剂盒的操作，制备禽毛滴虫批次1的cDNA样本。

禽毛滴虫样本批次2中8个禽毛滴虫样品，同样按照Omega E.Z.N.A SE Total RNAplus kit I(R6836-01)试剂盒的操作，但在提取RNA过程中，均跳过DNase I酶消化处理步骤。取所述禽毛滴虫批次2的RNA样本，分别采用TAKARA PrimeScript^TM 1st StrandcDNASynthesis Kit(6110A)反转录试剂盒说明书，制备禽毛滴虫批次2的cDNA样本。

2.PCR扩增反应

使用禽毛滴虫的钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶(Calcium/calmodulin-dependent protein kinases，CAMK)作为检测靶标，该检测靶标至少含有一个内含子片段，所述内含子区域至少大于50bp，所述检测靶标区域(见图2)，所述内含子序列为SEQ ID:NO.1：GTATGTATTATTTTATTTACGGACTGGAGTGATTATTTTTGCTCCAGTTCGTGATTTTTTGGTTTATTACTAACACACAG。根据所述检测靶标的内含子区域设计引物TgaIden-F：SEQID:NO.2和TgaIden-R：SEQ ID:NO.3。

所述PCR扩增反应均基于本发明设计的PCR反应体系和反应条件。其中，所述PCR反应体系具体如表2所示，模板100ng，2μL TgaIden-F，2μL TgaIden-R，25μL 2×Taq PCRMaster Mix，最后用超纯水补至体积为50μL。

表2

试剂	使用量
		2X Taq PCR Master Mix	25μL
TgaIden-F	2μL
		TgaIden-R	2μL
模板	100ng
		H<sub>2</sub>O	补至体积为50μL

所述PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸20s，35个循环；72℃延伸5min。PCR结束后，取6μL产物用3％琼脂糖凝胶和DL500作为marker进行电泳分析并观察拍照。以3％琼脂糖凝胶和DL500作为marker进行电泳分析，50bp是肉眼可见的电泳条带差异，故将内含子区域筛选标准定义为大于50bp。

结果见图3和图4所示。图3为有实施DNAase操作的对应检测结果，该结果出现一个核酸条带，为168bp的cDNA特征条带，说明批次1样品的PCR产物中没有出现DNA特征条带；图4为不实施DNAase操作的对应操作结果，该结果出现两个核酸条带，说明批次2样品的PCR产物包括168bp的cDNA特征条带和248bp的DNA特征条带。若电泳结果呈现大小为168bp的条带，则核酸中仅具有RNA的核酸。电泳结果呈现大小为248bp的条带，核酸中仅具有DNA的核酸。若电泳结果呈现两条条带，大小分别为168bp和248bp，则核酸中同时具有RNA和DNA，有基因组污染。

采用本发明的CAMK基因、CAMK基因相对应的引物分子以及检测禽毛滴虫核酸样本中基因组污染的方法，只用观察禽毛滴虫核酸样本的扩增产物在琼脂糖凝胶电泳分离结果中是否存在基因组DNA条带，可以直观判断样品的RNA是否存在基因组DNA污染，也适用于禽毛滴虫cDNA样品中基因组DNA污染的检测。本发明对禽毛滴虫核酸样品的基因组DNA污染检测，操作简单，重复性高，特异性强。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种核酸分子，其特征在于，至少含有一个内含子片段，所述内含子区域至少大于50bp；所述内含子的核苷酸序列如SEQ ID:NO.1所示。

2.检测权利要求1所述的核酸分子的试剂在制备禽毛滴虫核酸检测产品中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂包括扩增所述核酸分子的PCR引物对。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述PCR引物对的序列如SEQ ID:NO.2和SEQ ID:NO.3所示。

5.一种禽毛滴虫核酸检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求2至4任一项定义的试剂。

6.根据权利要求5所述的禽毛滴虫核酸检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括样本核酸提取试剂和扩增试剂中的一种或者多种。

7.根据权利要求6所述的禽毛滴虫核酸检测试剂盒，其特征在于，所述扩增试剂包括扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg²⁺中的一种或者多种。

8.一种检测禽毛滴虫核酸样本中基因组污染的方法，其特征在于，包括以下步骤：

提供待测禽毛滴虫核酸样本；

以提取的核酸样本作为模板，加入权利要求3或4中定义的所述的PCR引物对进行PCR扩增反应，制备PCR扩增反应产物；

检测所述PCR扩增反应产物，并根据所得检测结果确定待测禽毛滴虫核酸样本是否存在基因组污染。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述核酸样本选自禽毛滴虫DNA样本、禽毛滴虫RNA样本和禽毛滴虫cDNA样本中的一种或多种。

10.根据权利要求8或者9所述的方法，其特征在于，检测所述PCR扩增反应产物的方法为凝胶电泳；

可选地，根据所得检测结果确定待测禽毛滴虫核酸样本是否存在基因组污染，包括：

若样本中检测出禽毛滴虫DNA条带，确定待测禽毛滴虫核酸样本存在基因组污染；

若样本中未检测出禽毛滴虫DNA条带，确定待测禽毛滴虫核酸样本不存在基因组污染。

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