CN115851899A

CN115851899A - 一种3m综合征致病基因cul7复合杂合突变位点的应用及其诊断试剂

Info

Publication number: CN115851899A
Application number: CN202210823132.9A
Authority: CN
Inventors: 曾桥; 刘亚宁; 伊宁
Original assignee: Hunan Jiahui Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Hunan Jiahui Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2022-07-13
Filing date: 2022-07-13
Publication date: 2023-03-28
Anticipated expiration: 2042-07-13
Also published as: CN115851899B

Abstract

本发明提供了一种3M综合征致病基因CUL7复合杂合突变位点的应用及其诊断试剂，属于基因诊断技术领域。本发明首次确认CUL7:NM_014780.5:exon3:c.616C>A和exon7:c.1825G>A位点复合杂合突变可以导致3M综合征。因此，本发明提供了一种3M综合征致病基因CUL7复合杂合突变位点c.616C>A和c.1825G>A在制备3M综合征诊断试剂或制备预防和/或治疗3M综合征靶点药物中的应用。本发明还提供了相应诊断试剂可以用于3M综合征的遗传学诊断和优生优育指导。

Description

一种3M综合征致病基因CUL7复合杂合突变位点的应用及其诊断试剂

技术领域

本发明属于基因诊断技术领域，具体涉及一种3M综合征致病基因CUL7复合杂合突变位点的应用及其诊断试剂。

背景技术

3M综合征(OMIM 273750)是于1975年由5位科学家报道，并以前3位作者(MillerJD，McKusick VA，Malvaux P)名字的首字母命名。该病是一种罕见的常染色体隐性遗传病，其最显著的临床特征是从宫内开始的严重的生长迟缓，出生身长大多为40～42cm，头围大，生后无追赶性生长，最终身高低于正常均值5～6倍标准差。女性性腺功能正常，男性睪丸体积小及精液异常，可存在性腺功能紊乱及生育功能低下或是不孕，少数男性可有尿道下裂。颌面部特点：三角脸，前额突出，上颌骨发育不全，高颧弓，眉毛浓密，鼻头厚，长人中，突唇，尖下巴，舌体中间裂缝，牙齿萌出延迟及牙釉质钙化不全。影像学特点：长骨干骺端压缩变形，高位椎体缩短，胸椎椎体前楔入，胸椎后侧凸，隐形脊柱裂，小骨盆，小髂翼，伴有纤细水平肋的宽胸骨，骨龄稍微延迟。其他特点：颈部短宽，斜方肌突出，胸骨畸形，方肩，翼状肩胛骨，脊柱前凸，小指短，脚踝突出，关节松动。冠状缝扁平化，眼距缩短，肘关节发育不全，尺骨短，第二掌骨假骨骺，小指弯曲，髋关节脱位。有研究通过对3M综合征患者下一代测序进行产前及早期诊断，显示中国3M综合征患者新的临床表现，如早期的运动发育延迟，下眼睑脂肪垫，骨龄为延迟。

3M综合征致病基因包括CUL7(Cullin7)、OBSL1(Obscurin-Like 1)和CCDC8(Coiled-coil domain containing 8，CCDC8/P90)，其中CUL7基因突变导致的3M综合征占84％。研究表明CUL7基因是3M综合征最常见的、首位致病候选基因。CUL7基因(MIM 609577)是定位于染色体6p21.1，基因长16.2kb，包含26各外显子和25个内含子，编码1668个氨基酸。CUL7、OBSL1、CCDC8在一个信号通路中，该信号通路与人类的生长发育有重要联系。下调CUL7后，细胞的有丝分裂出现诸如微管运动障碍、前中期停滞、出现4倍体、有丝分裂细胞死亡等问题。这种现象在CUL7突变的3M综合症细胞中也出现，但在野生型细胞中没有。提示3M综合症蛋白复合物与有丝分裂中微管运动和基因组的完整性出现问题有关，也就可以解释3M综合症中出现的身体畸形现象。一定程度的GH抵抗或缺乏可能与3M综合征有关，3M综合征可能与GH、IGF1和IGF结合蛋白的失调有关，或许这是其矮小的原因。

基因突变是导致疾病发生发展的重要遗传基础，基因诊断是确诊3M综合征的重要遗传学标准。临床上需要针对不同突变建立相应的检测技术用于明确病因和疾病诊断。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种3M综合征致病基因CUL7复合杂合突变位点的应用及其诊断试剂，可将3M综合征患者、携带者和正常人群区分开。

本发明提供了一种3M综合征致病基因CUL7复合杂合突变位点c.616C>A和c.1825G>A在制备3M综合征诊断试剂或制备预防和/或治疗3M综合征靶点药物中的应用。

本发明提供了一种用于3M综合征基因诊断的试剂，所述试剂是扩增CUL7复合杂合突变位点c.616C>A和c.1825G>A的引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的CUL7-1F、核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的CUL7-1R、核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的CUL7-2F、核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的CUL7-2R。

优选的，所述试剂包括测序引物；所述测序引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的CUL7-Seq1F、核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的CUL7-Seq1R、核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的CUL7-Seq2F、核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示的CUL7-Seq2R。

本发明提供了，所述试剂包括PCR扩增试剂。

本发明提供了所述的试剂在制备3M综合征诊断试剂盒中的应用。

优选的，所述诊断的方法为利用所述诊断试剂盒检测样本中基因突变位点的基因型来诊断个体是否患有3M综合征，所述基因突变位点是CUL7:NM_014780.5:exon3:c.616C>A和exon7:c.1825G>A；检测结果为“c.616C>A和c.1825G>A”复合杂合突变，则诊断受试个体为3M综合征。

优选的，所述样本为血液。

本发明提供了一种3M综合征诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括所述的试剂。

本发明提供了一种3M综合征致病基因CUL7复合杂合突变位点c.616C>A和c.1825G>A在制备3M综合征诊断试剂或制备预防和/或治疗3M综合征靶点药物中的应用。本发明通过外显子组测序技术首次发现了CUL7:NM_014780.5:exon3:c.616C>A和exon7:c.1825G>A位点突变可以导致3M综合征发病。一方面，通过检测受试者是否携带有上述突变，用于筛查或诊断3M综合征的遗传学诊断，以指导治疗。特别地，本发明所提供的诊断试剂盒可用于快速、有效地预测或诊断3M综合征。另一方面，本发明为3M综合征的发病机制研究奠定了重要基础，为3M综合征患者的治疗提供全新的理论依据。第三方面，本发明可以为治疗3M综合征提供可能的药物靶点。

附图说明

图1为3M综合征1号家系遗传图谱；其中，

表示男性携带者，

表示女性携带者，●表示女性患者，

表示先证者。

图2为利用Sanger测序检测1号家系CUL7:NM_014780.5:exon3:c.616C>A位点基因型的结果图，1号家系中先证者、先证者父亲、先证者妹妹为c.616C>A杂合突变(测序图中箭头所指为突变发生位置)；

图3为利用Sanger测序检测1号家系CUL7:NM_014780.5:exon7:c.1825G>A位点基因型的结果图，1号家系中先证者及先证者母亲为c.1825G>A杂合突变(测序图中箭头所指为突变发生位置)；

图4为3M综合征2号家系遗传图谱。其中，

表示男性携带者，

表示女性携带者，●表示女性患者，

表示先证者；

图5为利用试剂盒检测2号家系CUL7:NM_014780.5:exon3:c.616C>A位点基因型的结果图，2号家系中先证者、先证者母亲为c.616C>A杂合突变(测序图中箭头所指为突变发生位置)；

图6为利用试剂盒检测2号家系CUL7:NM_014780.5:exon7:c.1825G>A位点基因型的结果图，2号家系中先证者及先证者父亲为c.1825G>A杂合突变(测序图中箭头所指为突变发生位置)。

具体实施方式

在本发明中，致病基因CUL7的突变体核苷酸序列如SEQ ID NO：11(CTGAGCCAAAAAGAAGCCATT)和SEQ ID NO：12(AAAGTGGAAAGTGGGTGCCAG)所示，基因全长参见登录号为NM_014780.5的序列。致病基因CUL7复合杂合突变位点c.616C>A和c.1825G>A表示在616位点碱基由C突变为A，同时在1825位碱基由G突变为A。致病蛋白CUL7的突变体氨基酸序列如SEQ ID NO：13(LSQKEAI)和SEQ ID NO：14(KVESGCQ)所示。

本发明提供了一种用于3M综合征基因诊断的试剂，所述试剂是扩增CUL7复合杂合突变位点c.616C>A和c.1825G>A的引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1(GATACAAGCCCTGTCCTC)所示的CUL7-1F、核苷酸序列如SEQ ID NO:2(TCCCCACTCAACTCCTC)所示的CUL7-1R、核苷酸序列如SEQ ID NO:3(CTCCTTGATGGCAGATTC)所示的CUL7-2F、核苷酸序列如SEQ ID NO:4(TTTACATCCTCCTTCATTCT)所示的CUL7-2R。

在本发明中，所述试剂优选包括测序引物；所述测序引物优选包括核苷酸序列如SEQ ID NO:5(TGTGGTGGCAAAAGGATT)所示的CUL7-Seq1F、核苷酸序列如SEQ ID NO:6(TCCACCTTGTCCCAGTTT)所示的CUL7-Seq1R、核苷酸序列如SEQ ID NO:7(AACCAAGCCTACCCATCCC)所示的CUL7-Seq2F、核苷酸序列如SEQ ID NO:8(CCTTCATTCTTTGAGGGAACAC)所示的CUL7-Seq2R。所述试剂包括PCR扩增试剂。所述PCR扩增试剂包括但不限于dNTP、PCR缓冲液、镁离子和Tap聚合酶。

在本发明中，所述诊断的方法优选为利用所述诊断试剂盒检测样本中基因突变位点的基因型来诊断个体是否患有3M综合征，所述基因突变位点是CUL7:NM_014780.5:exon3:c.616C>A和exon7:c.1825G>A；检测结果为“c.616C>A和c.1825G>A”复合杂合突变，则诊断受试个体为3M综合征。所述样本为血优选液。所述诊断试剂盒检测样本中基因突变位点的基因型的方法优选提取样本的基因组DNA，利用扩增引物进行PCR扩增，PCR产物经过DNA测序，根据测序结果确定616位和1825位基因型，若616位同时存在和A，说明616基因型为“c.616C>A”杂合子，若616位点仅为A，说明基因突变位点未突变，属于野生型，若1825位同时存在G和A，说明1825位基因型为“c.1825G>A”杂合子，若1825位仅为G，说明该基因突变位点未发生突变，属于野生型。

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学和分子生物学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内的广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

文中术语“诊断”包括疾病风险的预测、疾病发病与否的诊断、还包括对疾病预后的评估。

文中术语“突变”是指野生型的多核苷酸序列发生改变，成为变异体，变异体可以是天然发生的或非天然发生的。

在本发明中，术语“复合杂合突变”是指是指等位基因均出现1处或以上的杂合突变，也就是双等位突变，每条染色体均突变。

在本发明中，“引物”指用于在PCR反应中扩增靶标核酸的多核苷酸片段，其通常为寡核苷酸，例如含有至少5个碱基，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或者更多个碱基的多核苷酸片段。引物不必与待扩增的目的基因或其互补链完全互补，只要其能够特异性扩增目的基因。如本文中所使用的，

术语“特异性扩增”是指引物能够通过PCR反应扩增目的基因，而不扩增其他基因。例如，特异性扩增CUL7基因是指，在PCR反应中引物只扩增CUL7基因，而不扩增其他基因。

下面结合实施例对本发明提供的一种3M综合征致病基因CUL7复合杂合突变位点的应用及其诊断试剂进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

样本获取

发明人发现了一个3M综合征家系(简称CUL7家系)，该CUL7家系部分成员的临床信息见表1。图1显示了CUL7家系图谱，其中，

表示男性携带者，

表示女性携带者，●表示女性患者，

表示先证者。

1.诊断标准：

可参照《人类单基因遗传疾病》2010版和《矮小症诊治指南》2008版：

3-M综合征的诊断包括：①低出生体重；②严重的生长迟缓；③临床特点及影像学特点；④3种基因突变(CUL7、OBSL1、CCDC8)。

表1 3M综合征家系成员的临床信息

如图1所示，编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。

家系人员Ⅰ1(父亲)、Ⅰ2(母亲)、Ⅱ1(先证者)、Ⅱ2(妹妹)外周血DNA用于测序分析。

实施例2外显子测序

1.仪器设备如表2所示。

表2仪器设备一览表

2.试剂耗材

人类全外显子测序试剂盒(Agilent)、DNA 1000试剂盒(Agilent)、96孔板(Axygen)、不同型号枪头(Axygen)、200μL离心管(Eppendorf)、1.5mL离心管(Eppendorf)、毛细管电泳缓冲液(Thermo)、测序标准物(Thermo)、无水乙醇(Thermo)、BigDyeTerminatorV3.1(Thermo)、外周血gDNA提取试剂盒(TIANGEN)、琼脂糖(TIANGEN)、EB染液(Amresco)。

3.试剂配方

5×TBE电泳液贮存液按照表3配制。

表3 5×TBE电泳液配方

试剂	体积/重量
		Tris	5.4g
硼酸	750mg
		EDTA(pH8.0,0.5mol/L)	2mL
ddH₂O	90mL

用ddH₂O将最终体积调整为100mL。

0.5×TBE电泳液工作液，用ddH₂O稀释10倍即可。

10×红细胞裂解液按照表4配制。

表4 10×红细胞裂解液配方

试剂	体积/重量
		NH₄Cl	82.9g
KHCO₃	10g
		EDTA	0.37g
加dH₂O	至1000mL

高压灭菌，4℃保存。

1×细胞核裂解液按照表5配制。

表5 1×细胞核裂解液配方

试剂	体积/重量
		2MTris-HCl,pH8.2	0.5mL
4MNaCl	10mL
		2mMEDTA	0.4mL

4.实验步骤

签署知情同意书后，采集家系中Ⅰ1(父亲)、Ⅰ2(母亲)、Ⅱ1(先证者)、Ⅱ2(妹妹)等成员的外周血3～5mL。

4.1样本DNA提取

1)如为肝素抗凝外周血样本，则将外周血3-5mL装入15mL离心管中，加2～3倍体积的1×红细胞裂解液，混匀，冰上静置30分钟，直至溶液变透明。

2)4℃，3000转/分钟离心10分钟，小心去上清液。沉淀中加1mL 1×细胞核裂解液，混匀，再加2mL 1×细胞核裂解液和150μL 20％SDS，摇匀，至出现粘稠透明状。加10μL20mg/mL蛋白酶K，摇匀。37℃消化6小时以上或过夜。

3)加等体积饱和酚，轻摇混匀，室温3000转/分钟离心10分钟。

4)小心移上清至另一离心管，加等体积酚/氯仿(1:1v/v)混匀，室温3000转/分钟离心10分钟。

5)小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。

6)将上清移入另一离心管中，加二倍体积无水乙醇，摇匀，见白色絮状DNA。用火焰灭菌的玻璃钩针将DNA钩出，70％乙醇洗二次，室温干燥5分钟，再将DNA溶于200μL 1×TE中，转鼓溶解过夜。紫外测OD值。

7)TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置-70℃保存。

4.2外显子测序

1)取2μg DNA，机械打断，使片段大小在200bp左右，切胶回收150-250bp片段；

2)DNA片段做末端修复和3’末端加A；

3)连接测序接头，对连接产物进行纯化，再行PCR扩增，扩增产物纯化；

4)Agilent试剂盒探针加入纯化后的扩增产物进行杂交捕获，杂交产物经洗脱回收后做PCR扩增，再行最终产物回收，取小样行琼脂糖凝胶电泳进行质控分析；

5)NextSeq500测序仪测序和数据分析。

4.3结果

最终得到2个具有致病意义的基因突变CUL7:NM_014780.5:exon3:c.616C>A和exon7:c.1825G>A；c.616C>A突变造成第206谷氨酰胺变为赖氨酸，c.1825G位于7号外显子最后一个碱基，c.1824_1825位点与后面7号内含子初始2个碱基(c.1825+1，c.1825+2)共同组成剪切位点，c.1825G>A突变破坏了剪切位点序列，造成剪切信号异常，进而造成mRNA剪切异常。在家系患者个体中CUL7:NM_014780.5:exon3:c.616C>A和exon7:c.1825G>A位点的基因型是“c.616C>A和c.1825G>A”复合杂合突变，在CUL7家系在携带者个体中基因型是“c.616C>A”或“c.1825G>A”单个杂合突变。

实施例3

Sanger测序验证

对于外显子组测序结果进一步利用Sanger测序法，对CUL7:NM_014780.5:exon3:c.616C>A和exon7:c.1825G>A位点进行验证。分别对实施例1中的Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅱ1、Ⅱ2等家系人员和100名家系外正常人进行CUL7:NM_014780.5:exon3:c.616C>A和exon7:c.1825G>A位点基因型检测。

具体方法步骤如下：

1、DNA提取

按照实施例1的方法提基因组DNA。

2、候选引物设计、验证及优选

2.1引物设计参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3，引物序列由上海生工生物技术公司合成。

2.2针对c.616C>A和c.1825G>A位点分别设计15对候选引物(见表6)，并利用PCR实验来验证和评价各对候选引物的优劣情况

表6各对候选引物基本情况和验证实验结果一览表

注：正常PCR扩增结果电泳后只有一条特异性条带，若出现引物二聚体条带、非特异产物条带均是引物异常反应的结果；目标引物尽可能避免这类情况。另外参考如下原则来综合评价和选择最优引物对：

①引物长度为15-30nt，常用为20nt左右；

②G+C含量以40-60％为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布；

③避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照；

④引物内部不应出现互补序列；

⑤两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3`端的互补重叠；

⑥引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70％，引物3`末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增；

2.3候选引物PCR验证反应

按照表7中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上；每对引物设置8个反应测试管(表7中序号1至8)。

表7引物检测PCR反应体系

反应条件：将上述测试反应管放入PCR仪，执行以下反应程序：

第一步：95℃，5分钟；

第二步：30个循环(95℃，30秒→Tm，30秒→72℃，60秒)；(根据表6中各引物Tm值设置PCR扩增参数，如为双引物则取Tm平均值)。

第三步：72℃，7分钟；

第四步：4℃直至取样时。

2.4候选引物PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳检测，以评估引物反应的有效性、特异性：

1)用胶带将洗净干燥的凝胶成样器两端封好，置于一水平台面上，在成样器的一端约1cm处放置梳子。

2)称量2g琼脂粉末于一锥形瓶中，加入100mL 0.5×TBE电泳缓冲液，摇匀后置微波炉或电炉上(加石棉网)加热，沸腾后取出摇匀，再加热，直至凝胶完全熔解，取出室温冷却。

3)待凝胶冷却至50℃左右，倒入封好的凝胶成样器，使厚度在5mm左右。

4)凝胶凝固拆除胶带，将凝胶与成样器一起放入电泳槽中。

5)加入电泳缓冲液，使液面高于胶面1-2mm，向上拔出梳子；用微量移液器将样品和DNA大小标准品分别与载样液混匀后，加入各加样孔内，由于载样液中蔗糖比重较大，DNA沉入孔底。

6)盖上电泳槽，接通电源，调至适当电压，开始电泳。根据载样液中溴酚蓝的指示，判断样品的大概位置，决定是否终止电泳。

7)切断电源，取出凝胶，放入0.5g/ml的EB水溶液中染色10-15分钟。

8)将凝胶放到透射式紫外照射仪下观察结果，波长254nm，并用加红色滤色片的相机照相或用凝胶扫描系统记录电泳结果。

2.5结果评价：

1)如果7号管仅出现一条明亮清晰目的条带，无其它条带，则判断该对引物和发应体系有效性好和特异性强；

2)如果7号管没有出现目的条带，则判断该对引物和反应体系无效；

3)如果7号管出现目的条带外的引物引物二聚体带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体带，则判断该对引物和反应体系有效性差；

4)如果7号管出现目的条带外的非特异性带，并在5、6号部分管中也同样出现非特异性带，则判断该对引物和反应体系特异性差；

5)如果7号管出现目的条带外的引物二聚体和非特异性带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体和非特异性带，则判断该对引物和反应体系有效性和特异性差。

2.6根据表6验证测试后统计的结果，选择其中最优一对(表6中1号对)作为突变家系检测用引物，针对c.616C>A位点的扩增引物序列如下所示：针对CUL7:NM_014780.5:exon3:c.616C>A位点的引物序列如下所示：

5’-GATACAAGCCCTGTCCTC-3’(SEQ ID NO：1)

5’-TCCCCACTCAACTCCTC-3’(SEQ ID NO：2)

针对CUL7:NM_014780.5:exon7:c.1825G>A位点的引物序列如下所示：

5’-GATACAAGCCCTGTCCTC-3’(SEQ ID NO：3)

5’-TCCCCACTCAACTCCTC-3’(SEQ ID NO：4)

3、1号家系人员和100名家系外人员突变位点PCR扩增

按照表8中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上。

表8突变位点PCR反应体系

试剂	体积
		10×PCR缓冲液	2.0μL
10mmol/LdNTPs	0.4μL
		100ng/μLCUL7-F	0.5μL
100ng/μLCUL7-R	0.5μL
		100ng/μL外周血抽提DNA	1.0μL
5u/μLTaq酶	0.2μL
		ddH₂O	15.4μL

反应条件：将反应体系放入PCR仪，执行以下反应程序：

第一步：95℃，5分钟；

第二步：30个循环(95℃，30秒→51℃，30秒→72℃，60秒)；

第三步：72℃，7分钟；

第四步：4℃直至取样时。

4、琼脂糖凝胶电泳检测

参照上述2.4步骤。

5、PCR产物酶解法纯化：5μL PCR产物中分别加入0.5μL核酸外切酶I(Exo I)，1μL碱性磷酸酶(AIP)，37℃消化15分钟，85℃使酶失活15分钟。

6、BigDye反应

BigDye反应体系见表9。

表9 BigDye反应体系

测序PCR循环条件：

第一步：96℃，1分钟；

第二步：33个循环(96℃，30秒→55℃，15秒→60℃，4分钟)；

第三步：4℃直至取样时。

7、BigDye反应产物纯化：

1)每管加入1μL 125mM EDTA(pH8.0)，加到管底，再加入1μL 3mol/LNaAc(pH5.2)；

2)加入70μL 70％酒精，震荡混匀4次，室温放置15分钟；

3)3000g，4℃离心30分钟；马上倒置96孔板，185g离心1分钟；

4)室温放置5分钟，让残余的酒精在室温挥发干，加入10μL Hi-Di甲酰胺溶解DNA，96℃变性4分钟，迅速置冰上4分钟，上机测序。

8、测序

将纯化后的BigDye反应产物进行DNA测序，测序引物则在上述PCR优选引物的基础上设计巢式引物(第二组引物是在第一组引物扩增得到的产物序列范围内设计的)作为测序引物，针对CUL7:NM_014780.5:exon3:c.616C>A位点的引物序列如下所示：

5’-TGTGGTGGCAAAAGGATT-3’(SEQ ID NO：5)

5’-TCCACCTTGTCCCAGTTT-3’(SEQ ID NO：6)

将纯化后的BigDye反应产物进行DNA测序，针对CUL7:NM_014780.5:exon7:c.1825G>A位点的引物序列如下所示：。

5’-AACCAAGCCTACCCATCCC-3’(SEQ ID NO：7)

5’-CCTTCATTCTTTGAGGGAACAC-3’(SEQ ID NO：8)

9、结果分析

图2的Sanger测序结果显示，家系3名人员CUL7:NM_014780.5:exon3:c.616C>A位点基因型是“c.616C>A”杂合突变。图2测序图中箭头所指位置显示A、C和D层CUL7:NM_014780.5:exon3:c.616C>A位点基因型是“c.616C>A”杂合突变，图B层该基因位点为野生型。

图3的Sanger测序结果显示，家系2名人员CUL7:NM_014780.5:exon7:c.1825G>A位点基因型是“c.1825G>A”杂合突变。图3测序图中箭头所指位置显示B、C层个体CUL7:NM_014780.5:exon7:c.1825G>A位点基因型是“c.1825G>A”杂合突变，图A层和D层该位点基因型野生型。

实施例4

CUL7基因c.616C>A、c.1825G>A复合杂合突变诊断试剂盒及应用

1、试剂盒组成：

1)扩增引物：如实施例3所示

2)缓冲液

3)Taq酶

4)dNTPs

5)CUL7:c.616C>A、c.1825G>A阳性突变参考品DNA该参考品为一段双链DNA，c.616C>A阳性突变参考品DNA具体序列如下所示：

c.1825G>A阳性突变参考品DNA具体序列如下所示：

其中，加粗碱基为PCR扩增上下游引物，单下划线碱基为突变位点，双下划线碱基为上下游测序引物。

6)测序引物：如实施例3所示。

2、使用方法：

应用于2号家系基因突变检测。

表10 3M综合征2号家系成员的临床信息

如图4所示，编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。

2号家系人员Ⅰ1(父亲)、Ⅰ2(母亲)、Ⅱ1(先证者)外周血DNA用于试剂盒检测分析。

1)基因组DNA提取：提取样本基因组DNA。

2)先采用上述PCR扩增引物、Taq酶、缓冲液、dNTPs、样本基因组DNA等进行PCR扩增反应；

3)对PCR扩增产物进行纯化；

4)采用上述测序引物对纯化的PCR产物进行BigDye反应；

5)对BiyDye反应产物纯化；

6)对BiyDye反应产物测序，测序序列与正常序列相比较。

图5显示利用试剂盒检测2号家系CUL7:NM_014780.5:exon3:c.616C>A位点基因型的结果图，先证者、先证者母亲为c.616C>A杂合突变；其中2号家系CUL7:NM_014780.5:exon7:c.1825G>A位点基因型的结果图，先证者及先证者父亲为c.1825G>A杂合突变；检测结果确认先证者为3M综合征患者；检测结果提示先证者父母突变携带者，下次妊娠3M综合征患孩的概率是1/4，妊娠携带者的概率是1/2，出生正常个体的概率是1/4；推荐先证者父母下次计划生育二孩时，可去生殖医学中心行胚胎植入前遗传学诊断或去产前诊断机构行产前诊断。

由以上实施例结果可以看出，本发明发现了新的CUL7基因突变，且确认了新突变体与3M综合征的发病密切相关，所述致病突变体可用于3M综合征的分子诊断及与相关疾病的鉴别诊断。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种3M综合征致病基因CUL7复合杂合突变位点c.616C>A和c.1825G>A在制备3M综合征诊断试剂或制备预防和/或治疗3M综合征靶点药物中的应用。

2.一种用于3M综合征基因诊断的试剂，其特征在于，所述试剂是扩增CUL7复合杂合突变位点c.616C>A和c.1825G>A的引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的CUL7-1F、核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的CUL7-1R、核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的CUL7-2F、核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的CUL7-2R。

3.根据权利要求2所述用于3M综合征基因诊断的试剂，其特征在于，所述试剂包括测序引物；所述测序引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的CUL7-Seq1F、核苷酸序列如SEQID NO:6所示的CUL7-Seq1R、核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的CUL7-Seq2F、核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示的CUL7-Seq2R。

4.根据权利要求2所述用于3M综合征基因诊断的试剂，其特征在于，所述试剂包括PCR扩增试剂。

5.权利要求2～4任意一项所述的试剂在制备3M综合征诊断试剂盒中的应用。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述诊断的方法为利用所述诊断试剂盒检测样本中基因突变位点的基因型来诊断个体是否患有3M综合征，所述基因突变位点是CUL7:NM_014780.5:exon3:c.616C>A和exon7:c.1825G>A；检测结果为“c.616C>A和c.1825G>A”复合杂合突变，则个体为3M综合征。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述样本为血液。

8.一种3M综合征诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒包括权利要求2～4所述的试剂。