CN115843929A - 一种复合多肽饲料在调控鸡卵巢颗粒细胞中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种复合多肽饲料在调控鸡卵巢颗粒细胞中的应用，属于饲料制备技术领域。本发明所提供的复合多肽的制备原料为贻贝、白蚬子和蛏子。其中，按照质量比计，贻贝：白蚬子：蛏子为5:2:3。本发明所制备的复合多肽能够有效的调控鸡卵巢颗粒细胞的凋亡。因此，可以将本发明所提供的复合多肽制备成复合多肽饲料来调控鸡卵巢颗粒细胞，从而调控鸡的产蛋。
Description
本案为分案申请，原申请的发明名称为：一种复合多肽在制备促进鸡产蛋饲料中的应用，原申请的申请日为：2020-09-02，原申请的申请号为：CN202010908497.2。
技术领域
本发明属于畜牧饲料技术领域，尤其涉及一种复合多肽饲料在调控鸡卵巢颗粒细胞中的应用。
背景技术
养鸡业的主要产品是鸡蛋和鸡肉。其中，鸡蛋是一种低价并且高效的动物性蛋白来源，鸡蛋中含有丰富的营养物质，且鸡蛋中的氨基酸比例适合人体的需要，因此深受广大消费者喜爱。同时，鸡蛋也是鸡用来繁殖下一代的重要载体。因此，在现代商业化生产中，鸡蛋的产蛋性能对于肉用鸡和蛋用鸡均具有重要的影响。研究表明，家禽的产蛋性能很大程度上是由卵泡的发育状况决定的。
颗粒细胞是构成卵泡的重要细胞，它来源于内胚层上皮细胞。在卵泡发育成熟的过程中，颗粒细胞的分化和生长与卵泡的发育过程密切相关。在卵泡选择前后，颗粒细胞会迅速从未分化进入分化状态，颗粒细胞可以通过合成激素和生长因子来调控卵泡的发育，故，颗粒细胞对调节卵泡的募集、卵泡的选择，卵泡的生长发育及成熟起着重要的作用。因此，有效的促进颗粒细胞的发育能够有效的促进鸡卵泡的发育，促进鸡的产蛋率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种复合多肽在制备鸡蛋产蛋饲料中的应用。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
本发明提供了一种复合多肽在制备促进鸡产蛋饲料中的应用，所述复合多肽的制备原料为：贻贝、白蚬子和蛏子。
优选地，所述制备原料中，按照质量比计，贻贝：白蚬子：蛏子为5:2:3。
优选地，所述复合多肽的制备方法为：
(1)将贻贝，白蚬子，蛏子洗净干燥后，按照5:2:3的质量比加入到粉碎机中，粉碎为粉末后，加入3倍量的水，制成复合匀浆液；
(2)在所述复合匀浆液中，调节PH为5-6，温度为50-60℃，加入0.1-0.2倍量的木瓜蛋白酶，酶解5-6小时；
(3)调节温度为95-98℃，灭酶15-25min后，室温冷却；
(4)离心收集上清，使用0.25μm的超滤膜过滤，得到复合多肽液；
(5)真空冷冻干燥，得到复合多肽。
此外，本发明提供了复合多肽在制备促进鸡卵巢颗粒细胞增殖促进剂中的应用，所述复合多肽的制备方法为：
(1)将贻贝，白蚬子，蛏子洗净干燥后，按照5:2:3的质量比加入到粉碎机中，粉碎为粉末后，加入3倍量的水，制成复合匀浆液；
(2)在所述复合匀浆液中，调节PH为5-6，温度为50-60℃，加入0.1-0.2倍量的木瓜蛋白酶，酶解5-6小时；
(3)调节温度为95-98℃，灭酶15-25min后，室温冷却；
(4)离心收集上清，使用0.25μm的超滤膜过滤，得到复合多肽液；
(5)真空冷冻干燥，得到复合多肽。
此外，本发明提供了复合多肽在制备抑制鸡卵巢颗粒细胞凋亡抑制剂中的应用，所述复合多肽的制备方法为：
(1)将贻贝，白蚬子，蛏子洗净干燥后，按照5:2:3的质量比加入到粉碎机中，粉碎为粉末后，加入3倍量的水，制成复合匀浆液；
(2)在所述复合匀浆液中，调节PH为5-6，温度为50-60℃，加入0.1-0.2倍量的木瓜蛋白酶，酶解5-6小时；
(3)调节温度为95-98℃，灭酶15-25min后，室温冷却；
(4)离心收集上清，使用0.25μm的超滤膜过滤，得到复合多肽液；
(5)真空冷冻干燥，得到复合多肽。
除此之外，本发明提供了一种复合多肽，所述复合多肽的制备原料为贻贝、白蚬子和蛏子；
按照质量比计，贻贝：白蚬子：蛏子为5:2:3；
所述复合多肽的制备方法为：
(1)将贻贝，白蚬子，蛏子洗净干燥后，按照5:2:3的质量比加入到粉碎机中，粉碎为粉末后，加入3倍量的水，制成复合匀浆液；
(2)在所述复合匀浆液中，调节PH为5-6，温度为50-60℃，加入0.1-0.2倍量的木瓜蛋白酶，酶解5-6小时；
(3)调节温度为95-98℃，灭酶15-25min后，室温冷却；
(4)离心收集上清，使用0.25μm的超滤膜过滤，得到复合多肽液；
(5)真空冷冻干燥，得到复合多肽；
所述复合多肽用于制备促进鸡产蛋饲料。
本发明的有益效果在于：
本发明所制备的复合多肽能够有效的促进剂鸡卵巢颗粒细胞增殖；抑制鸡卵巢颗粒细胞的凋亡。由于颗粒细胞可以有效的促进鸡卵泡发育，因此，本发明所制备的复合多肽可以用于制备促进鸡产蛋的饲料。
附图说明
图1不同浓度复合多肽A对于鸡卵巢颗粒细胞增殖的影响。
图2 100mg/ml复合多肽A对于鸡卵巢颗粒细胞CDK-2基因表达的影响。
图3 100mg/ml复合多肽A对于鸡卵巢颗粒细胞Cyclin-E基因表达的影响。
图4 100mg/ml复合多肽A对于鸡卵巢颗粒细胞凋亡荧光强度的影响。
图5 100mg/ml复合多肽A对于鸡卵巢颗粒细胞凋亡相关蛋白Caspase3和Bcl-2的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1
(1)将500g贻贝，200g白蚬子，300g蛏子洗净干燥后，加入到粉碎机中，粉碎为粉末后，加入3000g的水，制成复合匀浆液；
(2)在所述复合匀浆液中，调节PH为5，温度为50℃，加入0.1倍量的木瓜蛋白酶，酶解6小时；
(3)调节温度为95℃，灭酶25min后，室温冷却；
(4)离心收集上清，使用0.25μm的超滤膜过滤，得到复合多肽液；
(5)真空冷冻干燥，得到复合多肽A。
实施例2
(1)将500g贻贝，200g白蚬子，300g蛏子洗净干燥后，加入到粉碎机中，粉碎为粉末后，加入3000g的水，制成复合匀浆液；
(2)在所述复合匀浆液中，调节PH为6，温度为60℃，加入0.1倍量的木瓜蛋白酶，酶解6小时；
(3)调节温度为98℃，灭酶15min后，室温冷却；
(4)离心收集上清，使用0.25μm的超滤膜过滤，得到复合多肽液；
(5)真空冷冻干燥，得到复合多肽B。
实施例3
(1)将500g贻贝，200g白蚬子，300g蛏子洗净干燥后，加入到粉碎机中，粉碎为粉末后，加入3000g的水，制成复合匀浆液；
(2)在所述复合匀浆液中，调节PH为5，温度为55℃，加入0.1倍量的木瓜蛋白酶，酶解6小时；
(3)调节温度为96℃，灭酶15min后，室温冷却；
(4)离心收集上清，使用0.25μm的超滤膜过滤，得到复合多肽液；
(5)真空冷冻干燥，得到复合多肽C。
实施例3
检测复合多肽A对于鸡卵巢颗粒细胞细胞增殖的影响
1.制备鸡卵巢颗粒细胞
(1)将母鸡处死，去除鸡腹部鸡毛消毒后小心取出卵泡，置于装有PBS缓冲液的无菌培养基中，使用加入双抗的PBS缓冲液去血污，漂洗3次；
(2)将卵泡置于加入双抗的PBS缓冲液混合，将卵泡外膜、结缔组织及血管网等完全去除，按照Gilbert et al.1977的方法分离膜层和颗粒层；
(3)将分离的颗粒细胞层使用加入双抗的PBS清洗干净，剪切为1mm2大小的组织块，置于离心管中；
(4)加入1mg/ml的胶原酶II，37℃消化5-10min至离心管没有明显的组织块，加入5ml的4℃预冷的M199培养基终止消化；
(5)用70μm细胞滤网将上述细胞悬液过滤至新的50ml离心管中，1000rpm，离心10min；
(6)再次加入M199培养基重悬沉淀，1000rpm离心10min；
(7)将细胞接种于培养皿中，放入细胞培养箱中继续培养，得到鸡卵巢颗粒细胞。
2.检测复合多肽对于鸡卵巢颗粒细胞增殖的影响
(1)细胞分组：对照组，10mg/ml复合多肽A组，50mg/ml复合多肽A组，100mg/ml复合多肽A组，150mg/ml复合多肽A组；
(2)按照分组，将100μl处于对数生长期的2×104个细胞接种于96孔板，每组设置3个重复；
(4)放入细胞培养箱中，培养48h，使用CCK-8在450nm下测定吸光度。
结果如图1所示，从中可以看出，10mg/ml复合多肽A组(0.931±0.033),对于颗粒细胞增殖没有明显效果；50mg/ml复合多肽A组(1.177±0.027，P<0.001)组对于颗粒细胞增殖有较小的促进作用；100mg/ml复合多糖A组(1.450±0.068，P<0.001)对于颗粒细胞增殖具有显著的促进作用；150mg/ml复合多糖A组(1.485±0.034，P<0.0001)同样对于颗粒细胞增殖具有显著的促进作用，但是相对于100mg/ml并没有显著的上调，因此本发明选择100mg/ml复合多肽A进行后续实验。
实施例4
.检测复合多肽对于鸡卵巢颗粒细胞细胞增殖相关基因的影响
1.细胞分组和处理
(1)将鸡卵巢颗粒细胞接种于6孔板中，贴壁后，对照组不做处理，实验组加入100mg/ml复合多肽A，处理48h后，提取RNA。
2.2.RNA提取
(1)弃去培养基，加入1ml TriQuick Reagent，使用移液器吹打细胞，使细胞充分裂解，室温放置5min后将细胞转移至离心管中；
(2)将0.2ml氯仿加入到离心管中，混匀，室温反应5min，12000g 4℃离心10min；
(3)吸取上层的水相至新的离心管中，加入0.5ml异丙醇，颠倒混匀；
(4)室温放置10min，12000g 4℃离心10min；
(5)加入1ml 75％乙醇(DEPC水配置)溶解沉淀，12000g 4℃离心5min，去除上清；
(6)加入50μL DEPC水溶解RNA。
3.逆转录反应
(1)根据天根逆转录试剂盒去除gDNA
gDNA反应体系
| 组成成分 | 使用量 |
| 5×gDNA Buffer | 2μL |
| TotaL RNA | 1μg |
| RNase-Free ddH2O | 补足到10μL |
(2)小型离心机离心后，置于PCR仪中，42℃，孵育3min，置于冰上放置；
(3)配置逆转录反应体系
(4)将混合液置于普通PCR仪中，42℃，15min；95℃，3min。
4.实时荧光定量PCR
引物序列如下:
| 基因 | ID | 荧光定量引物序列(5’-3’) | 产物大小 |
| β-actin | NM_205518 | AATGGCTCCGGTATGTGCAA | 112 |
| GGCCCATACCAACCATCACA | |||
| CDK2 | NM_001199857 | CTGTGGACATCTGGAGCCTG | 107 |
| CGTGCGGAAGATACGGAAGA | |||
| Cyclin-E | NM_001031358 | GAACACCGAAGAGTGCTCCA | 149 |
| AGTTGTCAACAGGGGACAGC |
反应体系如下：
| 试剂 | 使用量 |
| cDNA | 1μL |
| 上游引物 | 0.5μL |
| 下游引物 | 0.5μL |
| SYBR Mix | 5μL |
| ddH2O | 3μL |
反应系统：
95℃1min；95℃15s，60℃30s，40个循环。
实验结果如图2和图3所示：
其中，CDK2的相对表达量为1.446±0.075，Cyclin-E的相对表达量为1.509±0.045，差异均具有统计学意义，说明本发明所制备的复合多肽A能够有效的促进增殖相关基因CDK2和Cyclin-E。
实施例5
检测复合多肽A对于鸡卵巢颗粒细胞凋亡的影响
使用上海生工Caspase 3/7Activity Apoptosis Assay Kit进行检测
(1)将2×104个卵巢颗粒细胞接种于96孔板中，过夜培养后，对照组不做处理，实验组更换为100mg/ml复合多糖A培养基，每组设置3个重复；
(2)处理24h后，使用PBS清洗细胞3次，每次5min；
(3)将50μL Caspase 3/7substrate(组分A)加入10ml Assay Buffer(组分B)混匀制成Caspase 3/7检测缓冲液；
(4)在每个检测的孔板中加入100μL Caspase 3/7检测缓冲液，加入缓冲液后避光室温孵育1h，检测490/525nm处的荧光强度，设置对照组的荧光强度为1，结果如图4。
从图中可以看出，100mg/ml复合多肽A组的相对荧光强度为0.642±0.040，差异具有统计学意义，因此，复合多肽A能够显著的降低鸡卵巢颗粒细胞的凋亡。
实施例6
1.实验处理
(1)将鸡卵巢颗粒细胞接种于6孔板中，贴壁后，对照组不做处理，实验组加入100mg/ml复合多肽A；
(2)放入细胞培养箱中，培养48h后，提取蛋白，进行Western Blot检测。
2.蛋白提取
(1)弃去培养基，加入1mlPBS清洗细胞，加入100μl使用细胞刮刀将细胞刮下，使用移液枪将细胞转移到EP管；
(2)冰上裂解30min，置于离心机中，4℃，12000rpm/min，离心15min；
(3)离心结束后，小心吸取上清，得到蛋白样品；
(4)使用BCA法测量蛋白浓度，并调整蛋白样品浓度为2μg/μl。
3.蛋白电泳
(1)配制12％分离胶，5％浓缩胶，每孔加入10μl蛋白样品和蛋白Marker；
(2)浓缩胶恒压90V，分离胶恒压120V，当溴酚蓝跑至凝胶的底部时停止电泳；
(3)小心取出凝胶，按照海绵垫，三层滤纸，PAGE胶，PVDF膜，三层滤纸，海绵垫的模式安装转印夹，将转印夹放入电转槽中，室温电转1.5小时；
(4)电转结束后，将PVDF膜取出，放入5％脱脂奶粉中，室温摇床封闭1h。
(5)封闭完成后，使用TBST洗膜3次，每次10分钟；
(6)根据相应蛋白条带大小，裁切PVDF膜，孵育Caspase3，Bcl-2和β-actin一抗，4℃，孵育过夜；
(7)一抗孵育结束后，使用TBST洗膜3次，每次10分钟，孵育相应的2抗，室温孵育1h；
(8)二抗孵育结束后，使用TBST洗膜3次，进行显影曝光。
结果如图5所示，从图中，可以看出，复合多肽A能够有效的降低促凋亡蛋白Caspase3活性并且促进抑凋亡蛋白Bcl-2的表达。
综上所示，本发明所制备的复合多肽能够有效的促进鸡卵巢颗粒细胞的增殖，并且能够有效的抑制鸡卵巢颗粒细胞的凋亡。因此，可将本发明所制备的复合多糖用于制备促进鸡产蛋饲料。
Claims (1)
1.复合多肽在制备抑制鸡卵巢颗粒细胞凋亡抑制剂中的应用，其特征在于，所述复合多肽的制备方法为：
(1)将贻贝，白蚬子，蛏子洗净干燥后，按照5:2:3的质量比加入到粉碎机中，粉碎为粉末后，加入3倍量的水，制成复合匀浆液；
(2)在所述复合匀浆液中，调节PH为5-6，温度为50-60℃，加入0.1-0.2倍量的木瓜蛋白酶，酶解5-6小时；
(3)调节温度为95-98℃，灭酶15-25min后，室温冷却；
(4)离心收集上清，使用0.25μm的超滤膜过滤，得到复合多肽液；
(5)真空冷冻干燥，得到复合多肽。
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