CN115813971A - 一种用于治疗急性中耳炎的黄芪饮片及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黄芪饮片，其制备方法如下：(1)黄芪浸提：将黄芪药材加工成薄片，加入2.5倍质量的纯水，保持90℃浸提6小时，期间翻动数次；(2)菌种活化；(3)微生物发酵炮制：将浸提后的黄芪作为培养基，95℃巴氏加热20min杀菌处理后，自然冷却至37℃，接种活化的植物乳杆菌X7021和长双歧杆菌CGMCC 15014；(4)干燥。
Description
技术领域
本发明涉及一种黄芪饮片及其制备方法，属于中药技术领域。
背景技术
黄芪为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根。我国山西、陕西、甘肃、黑龙江、辽宁、河北、内蒙古等省多有产出。黄芪是一种常见的中药材，具有补气升阳，固表止汗，利水消肿，生津养血，行滞通痹，托毒排脓，敛疮生肌的功效。除了药用外，还经常用于食用，比如泡茶泡水。研究显示黄芪多糖能够对多种细菌具有抑制作用，例如对痢疾杆菌、肺炎双球菌、溶血性链球菌以及金黄色葡萄球菌等。
急性中耳炎(AOM)患者多为儿童，在发达国家约80％以上的三岁前儿童都曾患过中耳炎。中耳反复感染会引起患儿鼓室硬化粘连性中耳炎以及中耳胆脂瘤,从而导致患儿听力进行性下降，甚至会延迟行为、语言和才能的发育。经过广泛的临床试验发现肺炎链球菌是引起急性中耳炎的最主要病原菌，黄芪多糖在防治感染性疾病中有至关重要的作用，中草药特别是单体中药具有明显优势，且有些中草药间还显示出了协同作用。中草药来源于大自然，药源广泛，药物不良反应小于抗生素治疗。
微生物发酵对中药有一定影响，主要是微生物对中药的有效成分和药效的改变，以及中药成分对微生物次生代谢的影响。在微生物发酵中药过程中，由于微生物代谢和微生物本身的活性酶，伴随着生物转化反应的发生，能够实现对中药活性成分的修饰和转化。
本发明旨在提供一种由新型的微生物发酵方法炮制而成的黄芪饮片，可以提高其免疫促进的活性，能够治疗急性中耳炎。该饮片制备简单，对细胞损伤小，抗菌能力强，具有很好的市场前景。
发明内容
本发明旨在提供一种由新型的微生物发酵方法炮制而成的黄芪饮片，可以治疗急性中耳炎。该饮片制备简单，对正常细胞损伤小，抗菌能力强，具有很好的市场前景。
大量体内外实验及临床研究表明,黄芪具有增强机体免疫功能、强心降压、抗菌、抗肿瘤、抗病毒等多种药理功效。
中国专利201610317032.3公开过一株植物乳杆菌X7021，所述菌株已于2015年1月16日，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC M2015039。该菌株的已知功能为能够有效降解亚硝酸盐。本发明所用植物乳杆菌X7021来自华东理工大学研究人员赠送。
本发明所用长双歧杆菌CGMCC 15014购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期是2004年9月3日，保藏号是CGMCC 15014。本发明团队在研究和实践过程中，发现长双歧杆菌CGMCC 15014可以有效的提升植物乳杆菌X7021有对黄芪饮片的发酵作用，增加黄芪多糖的抗菌能力。
植物乳杆菌和长双歧杆菌均为安全的益生菌，目前尚不清楚该植物乳杆菌X7021和长双歧杆菌CGMCC 15014如何增强卷黄芪饮片的抗菌能力的，推测在微生物发酵中药过程中，由于微生物代谢和微生物本身的活性酶，伴随着生物转化反应的发生，能够实现对中药活性成分的修饰和转化。提升了黄芪多糖多急性中耳炎的抗菌能力。
本发明所需要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现。
一种黄芪饮片，其制备方法如下：
(1)黄芪浸提：
将黄芪药材200g加工成2-3mm的薄片，加入500g的纯水，保持90℃浸提6小时，期间翻动数次；
(2)菌种活化：
植物乳杆菌X7021(CCTCC M 2015039)：取一环乳杆菌接种到MRS固体培养基中划线，37℃厌氧培养24h。挑取平板中长势较好的单菌落接种至MRS液体培养基中活化，厌氧培养成108cfu/ml植物乳杆菌X7021种子液。
长双歧杆菌CGMCC 15014：活化菌种方法同植物乳杆菌X7021。最后配置成108cfu/ml长双歧杆菌CGMCC 15014种子液。
(3)微生物发酵炮制：
将浸提后的黄芪作为培养基，加入50g的蔗糖溶解均匀，95℃巴氏加热20min杀菌处理后，自然冷却至37℃，调节pH为6.5，接种步骤(2)活化的植物乳杆菌X7021菌液10ml，于37℃摇床厌氧发酵3小时后，调节pH为6.5，接种步骤(2)活化的长双歧杆菌CGMCC 1501410ml，降温至37℃继续恒温静置发酵10小时；
(4)干燥：
在70℃下干燥2h得到黄芪饮片。
本发明的优点：
本发明黄芪饮片，制备简单，对正常细胞损伤小，抗菌能力强，能提升免疫能力，具有很好的市场前景。可以直接做成口服液，也可以做成滴耳液，具有非常重要的意义和广阔的前景。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明的具体实施例如以下说明。
实施例1
一种黄芪饮片，其制备方法如下：
(1)黄芪浸提：
将黄芪药材200g加工成2-3mm的薄片，加入500g的纯水，保持90℃浸提6小时，期间翻动数次；
(2)菌种活化：
植物乳杆菌X7021(CCTCC M 2015039)：取一环乳杆菌接种到MRS固体培养基中划线，37℃厌氧培养24h。挑取平板中长势较好的单菌落接种至MRS液体培养基中活化，厌氧培养成108cfu/ml植物乳杆菌X7021种子液；
长双歧杆菌CGMCC 15014：活化菌种方法同植物乳杆菌X7021。最后配置成108cfu/ml长双歧杆菌CGMCC 15014种子液；
(3)微生物发酵炮制：
将浸提后的黄芪作为培养基，加入50g的蔗糖溶解均匀，95℃巴氏加热20min杀菌处理后，自然冷却至37℃，调节pH为6.5，接种步骤(2)活化的植物乳杆菌X7021菌液10ml，于37℃摇床厌氧发酵3小时后，调节pH为6.5，接种步骤(2)活化的长双歧杆菌CGMCC 1501410ml，降温至37℃继续恒温静置发酵10小时；
(4)干燥：
在70℃下干燥2h得到黄芪饮片。
实施例2
一种黄芪饮片，只含有植物乳杆菌X7021发酵,其制备方法如下：
(1)黄芪浸提：
将黄芪药材200g加工成2-3mm的薄片，加入500g的纯水，保持90℃浸提6小时，期间翻动数次；
(2)菌种活化同实施例1；
(3)微生物发酵炮制：
将浸提后的黄芪作为培养基，加入50g的蔗糖溶解均匀，95℃巴氏加热20min杀菌处理后，自然冷却至37℃，调节pH为6.5，接种步骤(2)活化的植物乳杆菌X7021菌液10ml，于37℃摇床厌氧发酵13小时；
(4)干燥：
在70℃下干燥2h得到黄芪饮片。
实施例3
一种黄芪饮片，只含有长双歧杆菌CGMCC 15014发酵,其制备方法如下：
(1)黄芪浸提：
将黄芪药材200g加工成2-3mm的薄片，加入500g的纯水，保持90℃浸提6小时，期间翻动数次；
(2)菌种活化同实施例1；
(3)微生物发酵炮制：
将浸提后的黄芪作为培养基，加入50g的蔗糖溶解均匀，95℃巴氏加热20min杀菌处理后，自然冷却至37℃，调节pH为6.5，接种步骤(2)活化的长双歧杆菌CGMCC 1501410ml，降温至37℃继续恒温静置发酵13小时；
(4)干燥：
在70℃下干燥2h得到黄芪饮片。
实施例4
一种黄芪饮片，植物乳杆菌CGMCC 1.9087代替植物乳杆菌X7021，其制备方法如下：
(1)黄芪浸提：
将黄芪药材200g加工成2-3mm的薄片，加入500g的纯水，保持90℃浸提6小时，期间翻动数次；
(2)菌种活化：
植物乳杆菌CGMCC 1.9087：购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。活化菌种方法同实施例1。厌氧培养成108cfu/ml植物乳杆菌CGMCC 1.9087种子液。
长双歧杆菌CGMCC 15014：活化菌种方法同实施例1。
(3)微生物发酵炮制：
将浸提后的黄芪作为培养基，加入50g的蔗糖溶解均匀，95℃巴氏加热20min杀菌处理后，自然冷却至37℃，调节pH为6.5，接种步骤(2)活化的植物乳杆菌CGMCC 1.9087菌液10ml，于37℃摇床厌氧发酵3小时后，调节pH为6.5，接种步骤(2)活化的长双歧杆菌CGMCC15014 10ml，降温至37℃继续恒温静置发酵10小时；
(4)干燥：
在70℃下干燥2h得到黄芪饮片。
实施例5
一种黄芪饮片，普通长双歧杆菌代替长双歧杆菌CGMCC 15014，其制备方法如下：
(1)黄芪浸提：
将黄芪药材200g加工成2-3mm的薄片，加入500g的纯水，保持90℃浸提6小时，期间翻动数次；
(2)菌种活化：
植物乳杆菌X7021(CCTCC M 2015039)：取一环乳杆菌接种到MRS固体培养基中划线，37℃厌氧培养24h。挑取平板中长势较好的单菌落接种至MRS液体培养基中活化，厌氧培养成108cfu/ml植物乳杆菌X7021种子液。
普通长双歧杆菌：长双歧杆菌CICC6201，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。活化菌种方法同实施例1。最后配置成108cfu/ml普通长双歧杆菌种子液。
(3)微生物发酵炮制：
将浸提后的黄芪作为培养基，加入50g的蔗糖溶解均匀，95℃巴氏加热20min杀菌处理后，自然冷却至37℃，调节pH为6.5，接种步骤(2)活化的植物乳杆菌X7021菌液10ml，于37℃摇床厌氧发酵3小时后，调节pH为6.5，接种步骤(2)活化的普通长双歧杆菌10ml，降温至37℃继续恒温静置发酵10小时；
(4)干燥：
在70℃下干燥2h得到黄芪饮片。
实施例6
一种黄芪饮片，不进行微生物发酵，其制备方法如下：
(1)黄芪浸提：
将黄芪药材200g加工成2-3mm的薄片，加入500g的纯水，保持90℃浸提6小时，期间翻动数次；
(2)干燥：
将浸提后的黄芪培养基，加入50g的蔗糖，95℃巴氏加热20min杀菌处理后，自然冷却恒温静置13小时；在70℃下干燥2h得到黄芪饮片。
实施例7
将实施例1-6制得的黄芪饮片用沸水500ml提取3次,每次30min,合并3次滤液，最后使用旋转蒸发器浓缩至150ml，各组浓缩滤液过0.22um滤膜，4度保存。
实施例8
使用MTT测定实施例7所得浓缩滤液的细胞毒性。
调整生长状态良好的对数生长期HEI-OC1细胞悬液密度至1×104个/ml，96孔板中每孔加入100uL细胞悬液，贴壁培养24小时后再加入20uL实施例7所得各组浓缩滤液继续培养24小时，其余按照常规的MTT基本实验操作进行，结果显示实施例7所得的浓缩滤液的对耳蜗细胞没有明显的细胞毒性。
实施例9
急性中耳炎模型的建立：实验组C57BL/6小鼠腹腔注射1.5％戊巴比妥全身麻醉，清理双侧外耳道，乙醇消毒，鼓室注射1×108CFU/ml 4型肺炎链球菌0.1ml进行造模。造模前后的观察及检测指标：小鼠耳腔内有脓液，中耳腔分泌物细菌培养为原接种菌者定为成功的中耳炎模型。
经过造模成功后，将小鼠随机分为9组(每组5只)分组给药，随机分为空白组(正常小鼠)、阴性对照组(建模组)、阳性对照组(氧氟沙星组)、实施例1-6组。
之后各组小鼠处理具体如下：
空白组：无造模的正常小鼠鼓室注射每天注射100ulPBS，同时每只小鼠每次给予0.2mlPBS灌胃；
阴性对照组：建模小鼠鼓室注射每天注射100ulPBS，同时每只小鼠每次给予0.2mlPBS灌胃；
阳性对照组：建模小鼠鼓室注射每天注射100ul 0.2％的氧氟沙星，同时每只小鼠每次给予0.2ml氧氟沙星(80mg/kg)灌胃；
实施例1组：建模小鼠鼓室注射每天注射100ul实施例7制得的实施例1浓缩滤液，同时每只小鼠每次给予0.2ml实施例1浓缩滤液灌胃；
实施例2组：建模小鼠鼓室注射每天注射100ul实施例7制得的实施例2浓缩滤液，同时每只小鼠每次给予0.2ml实施例2浓缩滤液灌胃；
实施例3组：建模小鼠鼓室注射每天注射100ul实施例7制得的实施例3浓缩滤液，同时每只小鼠每次给予0.2ml实施例3浓缩滤液灌胃；
实施例4组：建模小鼠鼓室注射每天注射100ul实施例7制得的实施例4浓缩滤液，同时每只小鼠每次给予0.2ml实施例4浓缩滤液灌胃；
实施例5组：建模小鼠鼓室注射每天注射100ul实施例7制得的实施例5浓缩滤液，同时每只小鼠每次给予0.2ml实施例5浓缩滤液灌胃；
实施例6组：建模小鼠鼓室注射每天注射100ul实施例7制得的实施例6浓缩滤液，同时每只小鼠每次给予0.2ml实施例6浓缩滤液灌胃。
灌胃和鼓室注射每日1次，连续5天。各组小鼠在第三天用药后24h收集听泡灌洗液，将其调整到1ml并进行10倍倍比稀释，使用生理盐水混均,再依次进行10倍系列稀释,从原液开始选择103、104、105、106稀释度,LB琼脂培养基，37℃孵育48小时后进行菌落计数。通过对菌落计数,计算出相应的活菌数(cfu/ml),取对数后进行统计处理。
统计学处理：使用SPSS16.0,进行统计学分析，计量资料的结果表示为均值±标准差,采用组间t检验。
表1不同组别小鼠治疗后的菌群检测
| 肺炎链球菌 | |
| 空白组 | Not detect |
| 阴性对照组 | 7.59±0.77 |
| 阳性对照组 | 2.98±0.51 |
| 实施例1组 | 3.10±0.37<sup>1，2</sup> |
| 实施例2组 | 5.28±0.92<sup>1,2,3</sup> |
| 实施例3组 | 6.12±0.39<sup>1,2,3</sup> |
| 实施例4组 | 6.09±0.80<sup>1,2,3</sup> |
| 实施例5组 | 5.15±0.73<sup>1,2,3</sup> |
| 实施例6组 | 6.26±0.53<sup>1,2,3</sup> |
注：t检验,l：P<0.05(与空白组比较)；2：P<0.05(和阴性对照组比较)；3：P<0.05(和阳性对照组比较)
结果显示：实施例1和阳性对照组无显著性差异(>0.05)，说明通过植物乳杆菌X7021与长双歧杆菌CGMCC 15014双发酵得到的黄芪浓缩液效果最好，接近氧氟沙星抗菌药物组。而实施例1-6相对于空白组都有统计学差异，说明黄芪浓缩液是有效的，这个大量文献中的结论一致。单独进行植物乳杆菌X7021(实施例2)发酵黄芪饮片，可发现能够提高黄芪浓缩液的抗菌能力，植物乳杆菌X7021+其他普通长双歧杆菌(实施例3)未能明显提升黄芪浓缩液的抗菌能力。单独使用长双歧杆菌CGMCC 15014发酵(实施例3)和长双歧杆菌CGMCC 15014发酵+其他植物乳杆菌(实施例4)和不进行发酵(实施例6)抗菌能力类似。说明植物乳杆菌X7021与长双歧杆菌CGMCC 15014双发酵具有出乎预料的抗菌优势。
实施例10
于第6天将实施例9中的小鼠处死，剖开小鼠腹腔,采集小鼠的脾脏和胸腺。适量4％甲醛溶液(溶液的量需完全浸没组织),用以保存摘取的脾脏和胸腺。在密封、室温条件下,固定72h保存以备用。称量并记录各组的脾脏和体重,根据以下公式计算:胸腺、脾脏脏器系数＝胸腺、脾脏的湿重/小鼠胴体重量×100％。
表2不同组别小鼠脏器指数
| 脾脏指数 | 胸腺指数 | |
| 空白组 | 0.20±0.05 | 0.48±0.12 |
| 阴性对照组 | 0.36±0.11 | 0.57±0.09 |
| 阳性对照组 | 0.28±0.15 | 0.53±0.10 |
| 实施例1组 | 0.72±0.07<sup>1，2，3</sup> | 1.23±0.26<sup>1,2,3</sup> |
| 实施例2组 | 0.56±0.11<sup>1,2,3</sup> | 0.96±0.18<sup>1,2,3</sup> |
| 实施例3组 | 0.49±0.10<sup>1,2,3</sup> | 0.84±0.21<sup>1,2,3</sup> |
| 实施例4组 | 0.51±0.14<sup>1,2,3</sup> | 0.86±0.19<sup>1,2,3</sup> |
| 实施例5组 | 0.57±0.17<sup>1,2,3</sup> | 0.98±0.21<sup>1,2,3</sup> |
| 实施例6组 | 0.48±0.10<sup>1,2,3</sup> | 0.82±0.19<sup>1,2,3</sup> |
注：t检验,l：P<0.05(与空白组比较)；2：P<0.05(和阴性对照组比较)；3：P<0.05(和阳性对照组比较)
从以上结果可知：黄芪饮片组(实施例1-6)小鼠的胸腺、脾脏系数与对照组的胸腺、脾脏系数相比增加明显,对小鼠的免疫系统有强化提升的作用,使小鼠的免疫力增强。单独进行植物乳杆菌X7021(实施例2)发酵黄芪饮片，可发现能够提高黄芪浓缩液的免疫作用，植物乳杆菌X7021+其他普通长双歧杆菌(实施例3)未能明显进一步提升胸腺、脾脏脏器系数。单独使用长双歧杆菌CGMCC15014发酵(实施例3)和长双歧杆菌CGMCC 15014发酵+其他植物乳杆菌(实施例4)和不进行发酵(实施例6)提升能力类似。以上说明说明植物乳杆菌X7021与长双歧杆菌CGMCC 15014联合发酵得到的黄芪浓缩液对小鼠的免疫能力提升最多，两者具有明显的协同作用。
综上所述，本发明团队在研究和实践过程中，发现联合植物乳杆菌X7021与长双歧杆菌CGMCC 15014发酵可以有效提高黄芪饮片的抗菌能力，对小鼠的免疫能力明显的提升。目前尚不清楚该植物乳杆菌X7021和长双歧杆菌CGMCC15014如何增强卷黄芪饮片的抗菌能力和免疫能力的，推测在微生物发酵中药过程中，由于微生物代谢和微生物本身的活性酶，伴随着生物转化反应的发生，能够实现对中药活性成分的修饰和转化。提升了黄芪饮片的功效。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (6)
1.一种黄芪饮片，其制备方法如下：
(1)黄芪浸提：
将黄芪药材加工成薄片，加入纯水，保持90℃浸提6小时，期间翻动数次；
(2)菌种活化：
所述长双歧杆菌CGMCC 15014购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期是2004年9月3日，保藏号是CGMCC 15014；
所述植物乳杆菌X7021于2015年1月16日，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC M 2015039；
植物乳杆菌X7021和长双歧杆菌CGMCC 15014分别活化；
(3)微生物发酵炮制：
将浸提后的黄芪作为培养基，加入50g的蔗糖溶解均匀，95℃巴氏加热20min杀菌处理后，自然冷却至37℃，调节pH为6.5，接种步骤(2)活化的植物乳杆菌X7021和长双歧杆菌CGMCC 15014；
(4)干燥：
在70℃下干燥2h得到黄芪饮片。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述步骤(1)为：将黄芪药材加工成2-3mm的薄片，加入2.5倍数的纯水，保持90℃浸提6小时，期间翻动数次。
3.权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述步骤(2)为：植物乳杆菌X7021：取一环乳杆菌接种到MRS固体培养基中划线，37℃厌氧培养24h。挑取平板中长势较好的单菌落接种至MRS液体培养基中活化，厌氧培养成108cfu/ml植物乳杆菌X7021种子液；
长双歧杆菌CGMCC 15014：活化菌种方法同植物乳杆菌X7021。最后配置成108cfu/ml长双歧杆菌CGMCC 15014种子液。
4.权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述步骤(3)为：将浸提后的黄芪作为培养基，加入50g的蔗糖溶解均匀，95℃巴氏加热20min杀菌处理后，自然冷却至37℃，调节pH为6.5，接种步骤(2)活化的植物乳杆菌X7021菌液10ml，于37℃摇床厌氧发酵3小时后，调节pH为6.5，接种步骤(2)活化的长双歧杆菌CGMCC15014 10ml，降温至37℃继续恒温静置发酵10小时。
5.权利要求1-4所述的方法制备得到的黄芪饮片。
6.权利要求1-5任一项所述的黄芪饮片在制备药品上的应用。
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