CN115807110A - 用于检测fbxo32基因突变的引物及牦牛肉品质鉴别方法 - Google Patents
用于检测fbxo32基因突变的引物及牦牛肉品质鉴别方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物科学技术领域，公开了一种用于检测FBXO32基因突变的引物、牦牛肉品质鉴别方法及其应用，针对FBXO32基因的5′UTR、exon1、exon8、3′UTR区共检测到7个SNPs位点，通过连锁不平衡共构建了5种单倍型，关联性分析发现7个SNPs和单倍型组合与牦牛嫩度、失水率和熟肉率相关。单倍型组合分析发现，H2H2与降低牦牛肌肉嫩度、肌肉失水率和提高肌肉熟肉率密切有关；H1H2与降低牦牛肌肉失水率和提升眼肌面积密切相关。因此，FBXO32基因可作为改善牦牛肉质性状的遗传标记基因，同时本发明的结果也可为其他品种牦牛的分子辅记选育提供参考依据，为丰富牦牛肉品质性状分子遗传研究提供理论依据。
Description
技术领域
本发明属于生物科学技术领域，尤其涉及一种用于检测FBXO32基因突变的引物、牦牛肉品质鉴别方法及应用。
背景技术
牦牛(Bosgrunniens)是以青藏高原为起源地的特产家畜。中国牦牛存栏量1300余万头，占世界牦牛总数90％以上，国内牛存栏总数的1/7。牦牛肉富含蛋白质，以及维生素B1、维生素B2和锌、钙、铁等多种矿物质，且脂肪、胆固醇含量低，风味独特。但与同龄普通牛肉品质相比，牦牛肉肌纤维较粗、肌内脂肪沉积少，肌肉嫩度较差。随着人们生活水平不断提高，对牛肉的需求从“量”上升为“质”，肌内脂肪含量丰富、细嫩多汁的高品质牛肉成为消费者首选。因此，提高牦牛肉品质是当前牦牛重要的选育方向。
牦牛肉品质受遗传、生理、营养和环境等多种因素影响，其中遗传调控是首要影响因素。动物肌肉发育实际是肌蛋白等分解与合成平衡积累的结果，泛素－蛋白酶体途径(UPP)是真核生物细胞内一种高效的蛋白质降解途径，也是降解肌蛋白的主要途径之一。肌肉萎缩盒蛋白32(F-boxprotein32，FBXO32)是一种E3泛素蛋白连接酶，属于F-box蛋白家族成员，在UPP中发挥重要特异性识别作用。研究发现，FBXO32基因参与肌细胞凋亡，除了靶向介导肌肉发育过程中的功能蛋白外，还靶向磷酸酶-1(MKP-1)进行蛋白酶降解过程。FBXO32基因在各种原因引起的肌肉萎缩中起着关键作用，蛋鸡和肉鸡FBXO32基因高表达会加快肌肉蛋白降解速率；FBXO32基因参与调节肌肉发育的起始进程，敲除该基因可降低肌肉萎缩率。此外，FBXO32基因的表达影响动物肌肉发育和肌肉蛋白分解；通城纯种、长白纯种、大白纯种，长大通、大长通猪群FBXO32基因第五内含子突变与猪6-7肋间背膘厚、腿臀肉骨率显著相关；新疆蝎牛和哈萨克牛全转录组测序中发现FBXO32基因是差异表达基因，影响氨基酸的转运代谢，可能是影响肉品质的关键侯选基因。
目前，FBXO32基因的研究大多集中在癌症以及一些肌肉疾病方面，其与牛肉品质性状的相关性研究未见报道。以FBXO32基因作为牦牛肉品质性状的侯选基因，应用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)混池测序和竞争性等位基因特异性PCR(kompetitive allele specific PCR，KASP)分型技术，检测甘南牦牛FBXO32基因相应区域的突变位点，结合甘南牦牛肉品质测定数据，分析FBXO32基因突变与甘南牦牛肉质性状的相关性，丰富牦牛肉质性状分子遗传研究基础。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
现有的技术仅限于对牦牛和肉牛肉品质性状候选基因部分区域进行了突变位点检测并针对肉品质性状进行了关联分析，其结果缺乏代表性。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于检测FBXO32基因突变的引物、牦牛肉品质鉴别方法及应用。
本发明是这样实现的，一种用于检测FBXO32基因突变的引物，所述用于检测FBXO32基因突变的引物包括8对，分别表示为P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8，用于扩增FBXO32基因5′UTR、外显子和3′UTR区域；
所述P1的引物序列为：F:CGACCCTCTACCGTGCGTTC，R:CACTCGTGCTCTGGCGACATC，退火温度为60℃，产物长度为482bp，扩增区域为5′UTR、Exon 1；
所述P2的引物序列为：F:TGAGGAGCACATATGATTGAG，R:GAGTGCAGAGATCCCTGTAAC，退火温度为59℃，产物长度为392bp，扩增区域为Exon 2；
所述P3的引物序列为：F:TTGCATCCCCTTAGACTGTCA，R:AACTCTGATGGTTGGCTAGG，退火温度为59℃，产物长度为316bp，扩增区域为Exon3；
所述P4的引物序列为：F:TCTGCACCCCCTGTTTTCATATTCA，R:TCCATTTTCTGCTTTCCTCAAGATG，退火温度为60℃，产物长度为263bp，扩增区域为Exon 4；
所述P5的引物序列为：F:CCCTGTCTGCCATTTATCTCT，R:AGTCATTCATTTCCATCCACT，退火温度为59℃，产物长度为339bp，扩增区域为Exon 5；
所述P6的引物序列为：F:ACCAGTGAGAAAGAAGACCAT，R:GTACCCGAGCAGAGCCATCTA，退火温度为59℃，产物长度为468bp，扩增区域为Exon 6；
所述P7的引物序列为：F:TGCTCCAGGCTGTTCTTTGTG，R:TAGAAACTCCTCGGACTGCTT，退火温度为60℃，产物长度为509bp，扩增区域为Exon 7；
所述P8的引物序列为：F:GGTAGAGATCAGAAGCGACAT，R:CTGACCCAGGGATTGAACAAG，退火温度为59℃，产物长度为704bp，扩增区域为Exon 8、3′UTR。
本发明的另一目的在于提供一种实施所述用于检测FBXO32基因突变的引物及在牦牛肉品质预测和鉴别中的应用。包括以下步骤：
步骤一，选取试验样品；
步骤二，准备试剂及仪器；
步骤三，测定肉品质性状；
步骤四，提取基因组DNA；
步骤五，设计与合成所述用于检测FBXO32基因突变的引物；
步骤六，对混合池进行测序；
步骤七，进行基因型检测以及数据统计分析。
进一步，所述步骤一中试验样品包括：
于甘南藏族自治州夏河县、玛曲县屠宰场采集593头甘南牦牛背最长肌肉样，现场测定胴体重、肌肉嫩度、失水率、熟肉率等胴体和肉品质性状；同时记录每头牛所属牧场(户)、性别、年龄等信息；并采集血样10mL，ACD抗凝，-70保存，用于基因组DNA提取。
进一步，所述步骤二中试剂及仪器包括：
血液基因组DNA提取试剂盒，离心柱型，购自天根生化科技(北京)有限公司；琼脂糖购自Biowest公司；DL2000DNA Marker购自艾科瑞生物公司；9700型梯度PCR仪(SensoQuest)；电泳仪；钢环膨胀压力仪。
进一步，所述步骤三中测定牦牛肉品质性状的具体过程为：
甘南牦牛胴体重为屠宰后热胴体重。眼肌面积用硫酸纸描下甘南牦牛胴体12～13肋骨间眼肌横断面，用求积仪测定其面积；
从宰后牦牛眼肌处取鲜肉样品，现场测定嫩度、失水率及熟肉率；
嫩度用C-LM3型数显式嫩度仪测定剪切力值并参照《肉嫩度的测定剪切力值测定法》(NY/T 1180—2006)进行校正；失水率测定是将肉样置于35kg钢环膨胀压力仪5min，肉样前后的质量差与加压前的质量比值则为失水率；熟肉率测定是将肉样称重，放入蒸锅加盖蒸30min，取出冷却2h后称重的质量与蒸煮前质量的比值则为熟肉率。
进一步，所述步骤四的具体过程为：
牦牛血样解冻后，按照血液基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)操作说明书提取DNA，分别用1.5％琼脂糖凝胶电泳和超微量分光光度计进行DNA完整性、浓度和纯度检验，选择条带完整、明亮且浓度、纯度均符合要求的样本用于基因突变检测。
进一步，所述步骤五的具体过程为：
从GenBank数据库中查询牦牛FBXO32基因序列(GenBank NW_005393335.1)，应用Primer Premier 5.0软件设计所述用于检测FBXO32基因突变的引物。
进一步，所述步骤六的具体过程为：
从试验牦牛基因组DNA中随机选择30个无亲缘关系的样本，扩增FBXO32基因5′UTR、外显子和3′UTR区；PCR反应体系20μL，包括：DNA模板(100ng/μL)0.8μL，上、下游引物(10μmol/L)各0.8μL，Taq DNA聚合酶10μL，ddH2O2加至20μL；
PCR扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，退火30s(各引物的退火温度见表1)，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。30个样本的扩增产物各取2μL，每对引物扩增区各分别建成混合池后，送上海生工生物工程有限公司完成序列测定。
进一步，所述基因型检测的具体过程为：
各引物扩增区域经混池测序确定突变位点后，牦牛基因组样品进行KASP基因分型。即应用带有2种通用标签并连接SNP位点的2条正向引物和1条反向引物构成Primermix、带有不同荧光信号的2条检测引物构成Master mix，经3次PCR反应进行SNP位点荧光检测。PCR反应I：DNA模板变性，与相符合的KASP引物结合，退火延伸后，检测引物的序列被加上；PCR反应II：合成等位基因特异性的末端序列的互补链；PCR反应III：特异序列对应的检测引物随PCR反应进行指数性增长，荧光信号产生并被检测。反应结束后，使用具有荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)功能的酶标仪读取荧光数据，并使用LGC-OMEGA软件生成基因分型图谱。
进一步，所述数据统计分析
利用Popgene软件分析牦牛FBXO32基因SNPs等位基因频率、基因型频率、纯合度(Ho)、遗传杂合度(He)、有效等位基因数(Ne)，利用Little Programe软件计算多态信息含量(PIC)。SHEsis软件分析SNPs位点单倍型及连锁不平衡程度，将发生频率高于3％的单倍型保留。采用SPSS26.0软件的一般线性模型分析基因型、单倍型组合和单倍型存在/缺失对甘南牦牛肉品质性状的影响，模型如下：
Yijkl＝μ+Hi+Aj+Sk+Fl+eijkl及Yijkl＝μ+Gi+Aj+Sk+Fl+eijkl
式中，Yijkl为性状表型值；μ为总体均值；Hi为单倍型组合效应，Gi为基因型效应；Aj为年龄效应；Sk为性别效应；Fl为场效应；eijkl为随机误差。
单倍型存在/缺失检验中，单一单倍型模型用于检验单倍型是否与肉质性状存在关联。在初始单一模型中任何P<0.2的单倍型被认为可能与胴体重和肉质性状相关，纳入随后的多单倍型模型中进行检验，由此确定单倍型效应。对频率大于2％的纯合单倍型，采用和测试单倍型(存在/缺失)相同的GLM方式进行单倍型(拷贝数)检验，同样邦费罗尼(Bonferroni)程序进行多重比较。
结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
本发明针对牦牛FBXO32基因5′UTR、exon1、exon8和3′UTR区检测到7个SNPs位点，通过连锁不平衡分析构建了5种单倍型，关联性分析发现7个SNPs和单倍型组合与牦牛肉嫩度、失水率和熟肉率相关。单倍型组合H2H2与降低牦牛肌肉嫩度、失水率和提高肌肉熟肉率密切有关；H1H2与降低牦牛肌肉失水率和提升眼肌面积密切相关。因此，牦牛FBXO32基因可作为改善牦牛肉品质性状的遗传标记基因。
本发明提供的检测FBXO32基因突变的引物及其在牦牛肉品质性状预测和鉴别方法中的应用，参照GenBank中牦牛FBXO32基因序列，设计特异性引物P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8，用于扩增FBXO32基因5′UTR、外显子和3′UTR区域，筛选FBXO32基因检测区域的突变位点，结合甘南牦牛肉生产性能测定数据，分析FBXO32基因突变对其肉品质性状的影响，以丰富牦牛重要经济性状候选基因分子遗传研究数据，从而预测牦牛的肉品质性状，其优点是反应灵敏、特异性强、操作简单、精确度高，基因检测区域广。
本发明的技术方案填补了国内外业内技术空白：针对牦牛肉质嫩度较普通牛差的特点，应用PCR混池测序和KASP分型技术，研究FBXO32基因分子遗传特征，开发牦牛肉品质性状分子遗传标记。牦牛FBXO32基因影响其肉质性状，相应区域突变可以作为牦牛肉性状潜在分子遗传标记应用于牦牛选育改良。
附图说明
图1是本发明实施例提供的牦牛FBXO32基因SNPs位点图；
图2是本发明实施例提供的牦牛FBXO32基因SNPs位点KASP分型图；
图3是本发明实施例提供的牦牛FBXO32基因连锁不平衡分析图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。
本发明实施例提供的肉质鉴别方法包括如下步骤：
步骤一，选取试验样品；
步骤二，采用的主要试剂及仪器；
步骤三，测定肉质性状；
步骤四，提取基因组DNA；
步骤五，设计与合成引物；
步骤六，对混合池进行测序；
步骤七，进行基因型检测以及数据统计分析。
进一步，所述试验样品包括：
甘南藏族自治州夏河县、玛曲县屠宰场采集593头甘南牦牛背最长肌肉样，现场测定胴体重、肌肉嫩度、失水率、熟肉率等胴体和肉质性状；同时记录每头牛所属牧场(户)、性别、年龄等信息；并采集血样10mL，ACD抗凝，-70保存，用于基因组DNA提取。
进一步，所述主要试剂及仪器包括：
血液基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)购自天根生化科技(北京)有限公司；琼脂糖购自Biowest公司；DL2000DNA Marker购自艾科瑞生物公司；9700型梯度PCR仪(SensoQuest)；电泳仪。
进一步，所述测定肉质性状的具体过程为：
甘南牦牛胴体重为屠宰后热胴体重。眼肌面积用硫酸纸描下胴体12～13肋骨间眼肌横断面，用求积仪测定其面积。从宰后牦牛眼肌处取鲜肉样品，现场测定嫩度、失水率及熟肉率。嫩度用C-LM3型数显式嫩度仪测定剪切力值并参照《肉嫩度的测定剪切力值测定法》(NY/T 1180—2006)进行校正；失水率测定是将肉样置于35kg钢环膨胀压力仪5min，肉样前后的质量差与加压前的质量比值则为失水率；熟肉率测定是将肉样称重，放入蒸锅加盖蒸30min，取出冷却2h后称重的质量与蒸煮前质量的比值则为熟肉率。
进一步，所述步骤四的具体过程为：
牦牛血样解冻后，按照血液基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)操作说明书提取DNA，分别用1.5％琼脂糖凝胶电泳和超微量分光光度计进行DNA完整性、浓度和纯度检验，选择条带完整、明亮且浓度、纯度均符合要求的样本用于基因突变检测。
进一步，所述步骤五的具体过程为：
从GenBank数据库中查询牦牛FBXO32基因序列(GenBank NW_005393335.1)，应用Primer Premier 5.0软件设计8对引物，用于扩增FBXO32基因5′UTR、外显子和3′UTR区域，引物序列见表1。
表1引物序列信息
进一步，所述步骤六的具体过程为：
从试验牦牛基因组DNA中随机选择30个无亲缘关系的样本，扩增FBXO32基因5′UTR、外显子和3′UTR区。PCR反应体系20μL，包括：DNA模板(100ng/μL)0.8μL，上、下游引物(10μmol/L)各0.8μL，Taq DNA聚合酶10μL，ddH2O加至20μL。PCR扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，退火30s(各引物的退火温度见表1)，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。30个样本的扩增产物各取2μL，每对引物扩增区各分别建成混合池后，送上海生工生物工程有限公司完成序列测定(序列测定结果见图1)。
进一步，所述基因型检测的具体过程为：
各引物扩增区域经混池测序确定突变位点后，牦牛基因组样品送景肽生物(中国武汉)进行KASP基因分型。即应用带有2种通用标签并连接SNP位点的2条正向引物和1条反向引物构成Primer mix、带有不同荧光信号的2条检测引物构成Mastermix，经3次PCR反应进行SNP位点荧光检测。PCR反应I：DNA模板变性，与相符合的KASP引物结合，退火延伸后，检测引物的序列被加上；PCR反应II：合成等位基因特异性的末端序列的互补链；PCR反应III：特异序列对应的检测引物随PCR反应进行指数性增长，荧光信号产生并被检测。反应结束后，使用具有荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)功能的酶标仪读取荧光数据，并使用LGC-OMEGA软件生成基因分型图谱(分型结果见图2)。
进一步，所述数据统计分析
利用Popgene软件分析牦牛FBXO32基因SNPs等位基因频率、基因型频率、纯合度(Ho)、遗传杂合度(He)、有效等位基因数(Ne)，利用Little Programe软件计算多态信息含量(PIC)。SHEsis软件分析SNPs位点单倍型及连锁不平衡程度，将发生频率高于3％的单倍型保留。采用SPSS26.0软件的一般线性模型分析基因型、单倍型组合和单倍型存在/缺失对甘南牦牛肉品质性状的影响，模型如下：
Yijkl＝μ+Hi+Aj+Sk+Fl+eijkl及Yijkl＝μ+Gi+Aj+Sk+Fl+eijkl
式中，Yijkl为性状表型值；μ为总体均值；Hi为单倍型组合效应，Gi为基因型效应；Aj为年龄效应；Sk为性别效应；Fl为场效应；eijkl为随机误差。
单倍型存在/缺失检验中，单一单倍型模型用于检验单倍型是否与肉质性状存在关联。在初始单一模型中任何P<0.2的单倍型被认为可能与胴体重和肉质性状相关，纳入随后的多单倍型模型中进行检验，由此确定单倍型效应。对频率大于2％的纯合单倍型，采用和测试单倍型(存在/缺失)相同的GLM方式进行单倍型(拷贝数)检验，同样邦费罗尼(Bonferroni)程序进行多重比较。
为了证明本发明的技术方案的创造性和技术价值，该部分是对权利要求技术方案进行具体产品上或相关技术上的应用实施例。
以593头甘南牦牛为研究对象，采用PCR混池测序和KASP基因分型技术，检测FBXO32基因多态位点，分析基因突变对甘南牦牛肉品质性状影响。在593头甘南牦牛中共检测到7个SNPs位点，分别为5′UTR区SNP1(g.267A>C)、exon1区SNP2(g.326G>T)、exon8区SNP3(g.30231G>C)、3′UTR区SNP4～SNP7(g.31352G>A，g.31424C>T，g.31503A>C，g.31504A>G)，在该群体中AC、GT、GC、AG、CT、AA、AA分别为优势基因型；7个SNPs位点在593头甘南牦牛群体中分别构建了5种有效单倍型和9种单倍型组合。SNP1、SNP4、SNP5和SNP6与肌肉嫩度显著相关(P<0.05)，SNP3、SNP6、SNP7与失水率显著相关(P<0.05)，SNP1、SNP2、SNP3、SNP4、SNP5、SNP7与眼肌面积显著相关(P<0.05)，SNP2、SNP5与胴体重显著相关(P<0.05)；单倍型组合H1H2与降低肌肉失水率、提高熟肉率和眼肌面积显著相关(P<0.05)，H2H2与降低肌肉剪切力、失水率和提高熟肉率显著相关(P<0.05)，H1H2、H2H2为优势单倍型组合；单倍型H1存在与增加牦牛眼肌面积显著相关(P<0.05)，H2存在与降低失水率显著相关(P<0.05)，H5存在与提高肌肉剪切力和失水率显著相关(P<0.05)。因此，牦牛FBXO32基因7个突变位点可作为甘南牦牛肉品质性状潜在的分子遗传标记。
本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果，和现有技术相比的确具备很大的优势，下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。
1、牦牛FBXO32基因的遗传特征
甘南牦牛FBXO32基因测序发现7处SNPs，分别位于5′UTR、exon 1、exon 8和3′UTR区(图1)，分别命名为SNP1(g.267A>C)、SNP2(g.326G>T)、SNP3(g.30231G>C)、SNP4(g.31352G>A)、SNP5(g.31424C>T)、SNP6(g.31503A>C)和SNP7(g.31504A>G)。图2中每个SNP位点2张图分别为前半部分和后半部分样品分型结果。
甘南牦牛FBXO32基因突变位点的基因型频率、等位基因频率及群体遗传多态性见表2。g.267A>C、g.326G>T、g.30231G>C、g.31352G>A、g.31424C>T的优势基因型分别为AC、GT、GC、AG和CT；g.31503A>C、g.31504A>G位点的优势基因型均为AA；χ2检验表明，7个SNPs位点在甘南牦牛群体中均处于哈代温伯格平衡状态(P>0.05)。g.267A>C、g.326G>T、g.30231G>C、g.31352G>A、g.31424C>和g.31504A>G多态信息含量均为中度多态(0.25<PIC<0.5)，g.31503A>C为低度多态(PIC<0.25)。
表2牦牛FBXO32基因遗传多态性分析
注：PIC>0.5为高度多态；0.25<PIC≤0.5为中度多态；PIC≤0.25为低度多态；P>0.05表示多态位点处于哈代温伯格平衡状态。
2、FBXO32基因连锁不平衡分析和单倍型构建
应用SHEsis软件分析牦牛FBXO32基因7个SNPs位点连锁不平衡状态(见表3、表4和图3)。D′值和r2值是衡量连锁不平衡的两个常用参数，其中连锁不平衡区域内重组事件的发生概率通过D′值反映，而连锁分析的效力与r2相关。由表5可知，FBXO32基因除g.30231G>C和g.31352G>A，以及g.30231G>C和g.31424C>T外，其他SNPs位点的D′>0.8，均处于强连锁不平衡状态。由表6可知，除g.31503 A>C与其他SNPs之间，其他SNPs位点间r2＞0.33，即两个SNPs表现为紧密连锁遗传。
D′对基因频率变化不敏感，当其中一个位点的一个等位基因频率比较低的时候，r2比D′更可靠。g.31503A>C位点等位基因C频率仅为0.7％，r2值来判断与其它SNPs的连锁不平衡更准确。g.31503A>C位点分别与其他位点D′值均等于或约等于1，但r2<0.33，所以这个位点与其他位点间不存在强连锁不平衡。D′值反映LD区域内重组事件发生的频率，但r2的效应比D′的效应更大。其余6个SNPs综合分析D′和r2，存在强连锁不平衡状态。
表3牦牛FBXO32基因突变位点间连锁不平衡系数D'
表4FBXO32基因突变位点间连锁不平衡系数r2
构建单倍型需要进行连锁不平衡分析，若2个SNPs位点不处于连锁不平衡状态，说明2个SNPs位点之间是相互独立的，互不影响，构建单倍型也就无意义。由于牦牛g.31503A>C位点与其他SNPs关联性较弱(r2<0.33)，因此没有参与形成单倍型。应用SHEsis软件分析牦牛FBXO32基因其余6个SNPs的单倍型，共检测到5种频率大于3.00％单倍型，分别为H1～H5(表5)。单倍型H1的发生频率最高为53.5％，其次为H221.0％；H3、H4、H5发生频率较低，分别为8.5％、7.0％、7.3％。
表5FBXO32基因突变位点单倍型分析
3、牦牛FBXO32基因型与牦牛肉质性状的关联分析
甘南牦牛FBXO32基因型与肉质性状的关联分析见表6。不同基因型分别影响牦牛胴体重、肌肉嫩度、失水率和眼肌面积。SNP1的AC型、SNP4的AG型、SNP5的CT型和SNP6的AC型个体肌肉嫩度显著高于其他基因型个体(P<0.05)；SNP3的GG型、SNP6的AC型、SNP7的AA型个体失水率显著高于其他基因型个体(P<0.05)；SNP1的AA型、SNP2的GG型、SNP3的CC型、SNP4的GG型、SNP5的CC型和SNP7的GG型个体眼肌面积显著低于其他基因型个体(P<0.05)；SNP2和SNP5的TT型个体胴体重显著高于其他基因型个体(P<0.05)。
表6牦牛FBXO32基因型与胴体及肉质性状关联分析
注：表中数值为“平均值±标准差”,同列数据后标不同小写字母表示同位点不同基因型间差异显著(P<0.05),“胴体重”括号中数字单独代表胴体重样品数。
4、FBXO32基因单倍型组合对甘南牦牛肉品质的影响
FBXO32基因单倍型组合与肉品质性状关联分析见表7。FBXO32基因H1～H5种单倍型共有15种单倍型组合，其中牦牛头数大于10的单倍型组合与肉质性状进行关联分析。结果表明，牦牛肉质性状在各个单倍型组合间存在显著差异，其中H1H2、H1H4、H2H5、H1H5个体肌肉剪切力值显著高于H2H2个体(P<0.05)；H1H1、H1H2、H1H4、H2H2个体肌肉熟肉率显著高于H1H5个体(P<0.05)；H1H3、H1H5、H2H5个体肌肉失水率显著高于H2H2、H1H2、H1H4、H2H3个体(P<0.05)；H1H1、H1H2个体眼肌面积显著高于H1H3、H1H3、H2H2、H2H4个体(P<0.05)。未发现任何单倍型组合与牦牛胴体重相关。综合评价各单倍型组合对牦牛肉品质的影响，单倍型组合H2H2和H1H2可能是影响牦牛肉品质的优势单倍型组合。
表7单倍型组合对甘南牦牛肉质及胴体性状的影响
注：①表中数值为“平均值±标准差”。同列数据后标不同小写字母表示同位点不同单倍型间差异显著(P<0.05),②括号中数字表示个体数。
5、FBXO32基因单倍型存在/缺失对甘南牦牛肉质性状的影响
单倍型存在/缺失与牦牛肉品质之间的关系见表8。在单单倍型模式下，单倍型H5存在与增加肌肉剪切力相关(P<0.05)；单倍型H2存在与降低失水率相关(P<0.05)；单倍型H4和H5缺失与增加失水率相关(P<0.05)；单倍型H3和H4存在与降低眼肌面积相关(P<0.05)。当其他P<0.2的单倍型被纳入模型时，只有H2和H5存在与失水率显著相关(P<0.05)，H5存在与剪切力依然相关(P<0.05)。对纯合子个体数大于2％的单倍型进行(拷贝数)比较，单倍型H3、H4、H5纯合子个体数均未达到10个以上，只对单倍型H1和H2进行比较。结果见表9，单倍型H1和H2不同拷贝数对眼肌面积有显著影响(P<0.05)，H2不同拷贝数对失水率有显著影响(P<0.05)。
表8牦牛FBXO32基因单倍型存在/缺失与胴体和肉质性状的相关性注：表中数值为“平均值±标准误”。P值有一般线性混合模型(GLMMs)得出。
表9牦牛FBXO32单倍型拷贝数与胴体和肉质性状的相关性
注：表中数值为“平均值±标准误”。P值有一般线性混合模型(GLMMs)得出。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明
的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于检测FBXO32基因突变的引物，其特征在于，所述用于检测FBXO32基因突变的引物包括8对引物，P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8，用于扩增FBXO32基因5′UTR、外显子和3′UTR区域；
所述P1的引物序列为：F:CGACCCTCTACCGTGCGTTC，R:CACTCGTGCTCTGGCGACATC，退火温度为60℃，产物长度为482bp，扩增区域为5′UTR、Exon1；
所述P2的引物序列为：F:TGAGGAGCACATATGATTGAG，R:GAGTGCAGAGATCCCTGTAAC，退火温度为59℃，产物长度为392bp，扩增区域为Exon2；
所述P3的引物序列为：F:TTGCATCCCCTTAGACTGTCA，R:AACTCTGATGGTTGGCTAGG，退火温度为59℃，产物长度为316bp，扩增区域为Exon3；
所述P4的引物序列为：F:TCTGCACCCCCTGTTTTCATATTCA，R:TCCATTTTCTGCTTTCCTCAAGATG，退火温度为60℃，产物长度为263bp，扩增区域为Exon4；
所述P5的引物序列为：F:CCCTGTCTGCCATTTATCTCT，R:AGTCATTCATTTCCATCCACT，退火温度为59℃，产物长度为339bp，扩增区域为Exon5；
所述P6的引物序列为：F:ACCAGTGAGAAAGAAGACCAT，R:GTACCCGAGCAGAGCCATCTA，退火温度为59℃，产物长度为468bp，扩增区域为Exon6；
所述P7的引物序列为：F:TGCTCCAGGCTGTTCTTTGTG，R:TAGAAACTCCTCGGACTGCTT，退火温度为60℃，产物长度为509bp，扩增区域为Exon7；
所述P8的引物序列为：F:GGTAGAGATCAGAAGCGACAT，R:CTGACCCAGGGATTGAACAAG，退火温度为59℃，产物长度为704bp，扩增区域为Exon8、3′UTR。
2.一种实施如权利要求1所述用于检测FBXO32基因突变的引物的肉质鉴别方法，其特征在于，所述肉质鉴别方法包括：
步骤一，选取试验样品；
步骤二，准备试剂及仪器；
步骤三，测定肉质性状；
步骤四，提取基因组DNA；
步骤五，设计并合成所述用于检测FBXO32基因突变的引物；
步骤六，对混合池进行测序；
步骤七，进行基因型检测以及数据统计分析。
3.如权利要求2所述肉质鉴别方法，其特征在于，所述步骤一中试验样品包括：
于甘南藏族自治州夏河县、玛曲县屠宰场采集593头甘南牦牛背最长肌肉样，现场测定胴体重、肌肉嫩度、失水率、熟肉率和肉质性状；同时记录每头牛所属牧场、性别、年龄信息；并采集血样10mL，ACD抗凝，-70℃保存，用于基因组DNA提取。
4.如权利要求2所述肉质鉴别方法，其特征在于，所述步骤二中试剂及仪器包括：
血液基因组DNA提取试剂盒，离心柱型，购自北京天根生化科技有限公司；琼脂糖，购自Biowest公司；DL2000DNAMarker购自艾科瑞生物公司；9700型梯度PCR仪(SensoQuest)；电泳仪；求积仪；C-LM3型数显式嫩度仪；钢环膨胀压力仪。
5.如权利要求2所述肉质鉴别方法，其特征在于，所述步骤三的具体过程为：
甘南牦牛胴体重为屠宰后热胴体重，眼肌面积为用硫酸纸描下甘南牦牛胴体12～13肋骨间眼肌横断面，用所述求积仪测定其面积；
从宰后牦牛眼肌处取鲜肉样品，现场测定嫩度、失水率及熟肉率；
利用所述C-LM3型数显式嫩度仪测定剪切力值得到所述嫩度，并基于肉嫩度的测定-剪切力值测定法(NY/T1180—2006)进行校正；将所述鲜肉样品置于35kg钢环膨胀压力仪5min，肉样前后的质量差与加压前的质量比值则为所述失水率；将所述鲜肉样品称重，放入蒸锅加盖蒸30min，取出冷却2h后称重的质量与蒸煮前质量的比值则为熟肉率。
6.如权利要求2所述肉质鉴别方法，其特征在于，所述步骤四的具体过程为：
牦牛血样解冻后，利用所述血液基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，分别用1.5％琼脂糖凝胶电泳和超微量分光光度计进行基因组DNA完整性、浓度和纯度检验，选择条带完整、明亮且浓度、纯度均符合要求的样本用于基因突变检测。
7.如权利要求2所述肉质鉴别方法，其特征在于，所述步骤五的具体过程为：
从GenBank数据库中查询牦牛FBXO32基因序列(GenBank NW_005393335.1)，应用PrimerPremier5.0软件设计并合成所述用于检测FBXO32基因突变的引物。
8.如权利要求2所述肉质鉴别方法，其特征在于，所述步骤六的具体过程为：
从所述基因组DNA中随机选择30个无亲缘关系的样本，扩增FBXO32基因5′UTR、外显子和3′UTR区；PCR反应体系20μL，包括：0.8μL浓度为100ng/μL的DNA模板，浓度为10μmol/L上、下游引物各0.8μL，TaqDNA聚合酶10μL，ddH2O加至20μL；
PCR扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存；
30个样本的扩增产物各取2μL，每对引物扩增区各分别建成混合池后，送上海生工生物工程有限公司完成序列测定。
9.如权利要求2所述肉质鉴别方法，其特征在于，所述基因型检测的具体过程为：
各引物扩增区域经混合池测序确定突变位点后，牦牛基因组样品送中国武汉景肽生物进行KASP基因分型；
应用带有2种通用标签并连接SNP位点的2条正向引物和1条反向引物构成Primermix、带有不同荧光信号的2条检测引物构成Mastermix，经3次PCR反应进行SNP位点荧光检测；
PCR反应I：DNA模板变性，与相符合的KASP引物结合，退火延伸后，检测引物的序列被加上；
PCR反应II：合成等位基因特异性的末端序列的互补链；
PCR反应III：特异序列对应的检测引物随PCR反应进行指数性增长，荧光信号产生并被检测；
反应结束后，使用具有荧光共振能量转移功能的酶标仪读取荧光数据，并使用LGC-OMEGA软件生成基因分型图谱。
10.如权利要求2所述肉质鉴别方法，其特征在于，所述数据统计分析的具体过程为：
利用Popgene软件分析牦牛FBXO32基因SNPs等位基因频率、基因型频率、纯合度(Ho)、遗传杂合度(He)、有效等位基因数(Ne)，利用LittlePrograme软件计算多态信息含量(PIC)；SHEsis软件分析SNPs位点单倍型及连锁不平衡程度，将发生频率高于3％的单倍型保留；采用SPSS26.0软件的一般线性模型分析基因型、单倍型组合和单倍型存在/缺失对甘南牦牛肉品质性状的影响，模型如下：
Yijkl＝μ+Hi+Aj+Sk+Fl+eijkl及Yijkl＝μ+Gi+Aj+Sk+Fl+eijkl
式中，Yijkl为性状表型值；μ为总体均值；Hi为单倍型组合效应，Gi为基因型效应；Aj为年龄效应；Sk为性别效应；Fl为场效应；eijkl为随机误差；
单倍型存在/缺失检验中，单一单倍型模型用于检验单倍型是否与肉质性状存在关联；在初始单一模型中任何P<0.2的单倍型被认为可能与胴体重和肉质性状相关，纳入随后的多单倍型模型中进行检验，由此确定单倍型效应；对频率大于2％的纯合单倍型，采用和测试单倍型相同的GLM方式进行单倍型检验，同样邦费罗尼(Bonferroni)程序进行多重比较。
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