CN115792241B - 一种宫颈癌e7蛋白检测抗体抗原的检测盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种宫颈癌E7蛋白检测抗体抗原的检测盒及其检测方法，摆动组件还包括气囊、变形层、衬板、托板、转轴、连杆和滑轨，气囊镶嵌于滑块远离套管的一端，变形层镶嵌于气囊远离滑块的一端，衬板摆动于变形层远离气囊的一侧，托板滑动于衬板的上端，转轴铰接于托板下端的两侧，自研发抗体抗原应用基因重组和杂交瘤技术，将E7蛋白进行了原核表达和纯化，以此作为免疫原制备E7蛋白单克隆抗体，并进行初步鉴定，用于检测样品中的病毒，吸附层对试纸卡内部向下滴落的样本进行吸附，避免液体样本流动至底托的内部，影响底托重复利用，使得该种检测盒能够在试纸卡未使用时，避免试纸卡的表面被污染。
Description
技术领域
本发明涉及抗体抗原检测技术领域，尤其涉及一种宫颈癌E7蛋白检测抗体抗原的检测盒及其检测方法。
背景技术
E7是致癌基因，通过大量表达而产生E7癌蛋白，导致细胞发生高级别癌前病变直至癌变，癌前病变的正确处理是宫颈癌筛查质量保证的关键，癌前病变的正确处理是宫颈癌筛查质量保证的关键，因为宫颈癌筛查的重要目的不仅是找出宫颈癌，而且是及时发现癌前病变并阻断其进展为宫颈癌。不同级别的癌前病变都有三种发展趋势：转归、持续、进展，正确判定癌前病变的发展趋势，是高质量筛查治疗的关键，针对于检测盒的技术启示；
对于检测盒的研究发现了以下问题：
1.通过将宫颈刷对女性宫颈口刮取分泌物，因宫颈刷在宫颈中提取的分泌物中杂质太多，需要用抗原提取出来，而检测盒所用试剂在制备后，对稀释后的宫颈细胞进行检测，导致现有检测方法无法有效的检测病变细胞；
2.检测盒通过内部放置试纸卡对抗原样本进行检测，在检测盒内部放置试纸卡后，检测盒无法避免试纸卡表面被污染，且由于试纸卡为一次性用品，检测盒需要重复使用，而抗原样本通常为液体样本，液体样本在滴落至试纸卡的内部后，多余样本易流动至检测盒的内部，污染检测盒的内部，进而影响检测盒下次使用，从而导致该种检测盒无法在安装时方便对多余液体样本进行吸收；
目前，现有技术中的CN201911002446.7一种用于早期宫颈癌检测的组合物及试剂盒，公开了试剂盒，该发明进一步提高了灵敏度和精准性，整个检测过程无创伤、操作简便、易于判读，通用设备即可满足检测，PCR过程采用全封闭形式，避免了交叉污染的可能，同时对两个标志物的三个区段进行检测，结果更加精准，综上因素使该发明具有社会推广性，该检测的高灵敏性适用于无创宫颈癌早期筛查；
本发明主要能够解决检测盒无法在安装时方便对多余液体样本进行吸收的问题。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种宫颈癌E7蛋白检测抗体抗原的检测盒及其检测方法，以解决上述背景技术中描述问题。
本发明一种宫颈癌E7蛋白检测抗体抗原的检测盒及其检测方法，由以下具体技术手段达成：
本发明涉及一种宫颈癌E7蛋白检测抗体抗原的检测盒，包括顶盖和底托，底托与顶盖活动嵌套连接，所述顶盖和底托的夹层内部活动嵌套有试纸卡，所述底托的内侧活动贯穿有吸附层。
进一步的，所述顶盖的内部贯穿有观察口，底托的内部贯穿有孔洞，孔洞长度大于底托长度的二分之一，底托靠近顶盖的一侧开设有凹槽，试纸卡活动嵌套于凹槽的内部，底托的内侧设有快速托举的摆动组件。
进一步的，所述试纸卡的表面设有检测线和质控线，试纸卡为E7蛋白检测试纸卡，试纸卡上的测试试剂中含有抗体、抗原，用于检测样品中的病毒，试纸卡配套设有试管。
其中，试纸卡中的抗原的由来：样本释放剂中含有抗原，用于提取分泌物中的检测品，因为宫颈刷在宫颈中提取的分泌物中杂质太多，需要用抗原提取出来，最终放到试纸卡中检测。
进一步的，所述吸附层与试纸卡呈垂直贴合设置，吸附层厚度为0.2-0.8cm，吸附层为海绵材质制成。
进一步的，所述摆动组件包括套管、滑块、卡块和斜板，套管设于底托的两侧，滑块滑动并延伸至底托的内部，卡块设于顶盖的两侧，斜板镶嵌于卡块的两侧。
进一步的，所述套管呈圆环状设置，套管嵌入于底托的内侧，套管与卡块滑动嵌套，套管与滑块配套设置。
进一步的，所述滑块于套管的内部滑动嵌套，滑块呈垂直滑动，滑块的外侧壁与套管内壁滑动贴合。
进一步的，所述卡块与套管配套设置，卡块侧面呈梯形设置，顶盖通过卡块与套管滑动嵌套。
进一步的，所述斜板呈倾斜15-35°设置，斜板与套管的内壁滑动挤压贴合，斜板与卡块整体组合直径大于套管内部直径0.5-1cm，斜板为可变形材质制成，如橡胶材质。
进一步的，所述摆动组件还包括气囊、变形层、衬板、托板、转轴、连杆和滑轨，气囊镶嵌于滑块远离套管的一端，变形层镶嵌于气囊远离滑块的一端，衬板摆动于变形层远离气囊的一侧，托板滑动于衬板的上端，转轴铰接于托板下端的两侧，连杆摆动于转轴的一端，滑轨设于托板下方的两侧。
进一步的，所述气囊、变形层、衬板、托板、转轴、连杆和滑轨均设于底托的内部，气囊内壁厚度为0.5-1cm，而变形层厚度为0.2-0.4cm，气囊呈不规则形状设置。
进一步的，所述变形层与衬板配套设置，衬板呈向下倾斜15-35°设置，变形层呈半圆弧状设置，半圆弧角度为90°，衬板环绕有2-4个于变形层的侧面，变形层材质与斜板材质相同。
进一步的，所述托板的一端延伸至底托的内侧，同时托板的一端延伸至吸附层的下端，托板分布于吸附层下端的两侧，托板于底托的内侧呈垂直滑动。
进一步的，所述连杆远离转轴的一端滑动于滑轨的内部，托板处于静止状态时，连杆的一端处于滑轨的最下端，而托板整体向上滑动时，连杆于滑轨的内部向上滑动。
进一步的，所述滑轨呈倾斜35-50°设置，滑轨靠近连杆的一端开设有凹槽，滑轨整体呈半圆环状设置。
本发明还涉及前述试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
S1：首先构建包含E7编码序列的PET-32a表达质粒，转化大肠杆菌表达菌BL21（DE3），收集菌体，通过Ni柱纯化得到纯化后的E7重组蛋白；用制备的E7重组蛋白作为免疫原对Balb/c小鼠进行免疫，ELISA间接法检测小鼠血清效价超过1/8K后，取免疫小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，杂交瘤细胞通过ELISA间接法进行亚克隆筛选，得到分泌抗E7的单克隆杂交瘤细胞；将杂交瘤细胞注射小鼠腹腔，收集腹水经过纯化后得到抗E7蛋白特异性单克隆抗体；
S2：基因组不稳定时，E7就混入基因组中，E7破坏细胞时，会产生E7癌蛋白，E7大量活动时，才会引起癌变，E7基因编码的致癌蛋白是导致宫颈上皮癌变的重要因子，这种蛋白通过抑制视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)使被感染的细胞可无限增殖并恶性转变；
S3：pRb是抑癌蛋白，正常情况下，非磷酸化的pRb与核转录因子E2F特异性结合，形成二者化合物后，抑制E2F对靶基因的转录，从而使细胞停留在G1期，细胞不能增殖，而高危型HPVE7蛋白通过其CR区的结构与pRb的649-72口袋结构特异性结合，从而释放E2F因子，促使细胞从G1期进入S期，同时E7促使pRb进入泛素依赖的途径降解，E7蛋白被认为在细胞转化和肿瘤行程中起重要作用；
S4：HPV进入人体后能够长期隐匿并大量复制和机体免疫力低下有关，HPV感染者不能建立有效的免疫反应，E7蛋白是HPV的主要转化蛋白质，是一种仅有98个氨基酸小的酸性蛋白，定位于核内或附着于核基质上，E7蛋白分为：1区，1-15氨基酸；2区，16-37氨基酸；3区，38-98氨基酸；锌指及C端区；
S5：对E7免疫表位的研究表明，E7蛋白的鼠T细胞表位均在C端区及锌指区，但其HLA-A表位除了存在于锌指区，也存在于N端区，E7蛋白不仅具有转化和致癌作用，而且还具有对病毒基因和细胞基因转录的反式激活活性；
S6：重组载体构建和蛋白表达设计引物，用PCR方法从HPV16阳性样本中扩增E7基因序列，酶切后连接PET-32a质粒，重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取阳性菌落PCR鉴定及测序，测序正确的质粒扩增，转化大肠杆菌表达菌BL21（DE3），挑单菌落至2ml液体LB培养基37℃220rpm培养至OD值0.6-0.8，加入诱导剂IPTG，继续诱导培养4h，离心收菌体进行SDS-PAGE及Westernblot鉴定；
S7：挑选阳性高表达菌冻存，同时扩大培养，将重组表达菌接种在液体LB培养基，37℃ 220rpm过夜培养，种子液按1/50放大至液体LB培养基，37℃ 220rpm培养至OD值0.6-0.8，加入诱导剂IPTG终浓度1mmol/L，25℃诱导过夜，离心收集菌体沉淀，PBS缓冲液重悬，冰浴下超声破碎菌体离心收集上清，0.45μm滤膜过滤后Ni柱纯化，SDS-PAGE鉴定测定分子量及纯度；
S8:动物免疫及效价测定以制备重组E7蛋白作为免疫原免疫BALb/c小鼠，初次免疫抗原50μg加弗氏完全佐剂皮下多点注射免疫；2周后第二次免疫，抗原100ug，加弗氏不完全佐剂皮下多点注射免疫；2周后第三次免疫，剂量同第二次免疫，7天后尾尖采血测其效价，选择效价最高的小鼠于1周后，抗原100ug，加弗氏不完全佐剂进行腹腔注射加强免疫；
S9：细胞融合及筛选克隆加强免疫3天后进行融合，于融合前48小时，将骨髓瘤细胞扩大培养，融合前24小时换液一次，使细胞融合当天处于对数生长期，融合前24小时取空白BALb/c小鼠腹腔巨噬细胞按每孔1×104接种至96孔板，置37℃，5%CO2培养箱中培养，将完成免疫小鼠眼球采血后脱颈处死，分离小鼠脾细胞，通过50%PEG进行融合，将融合后细胞100μl每孔加入铺有饲养细胞的96孔细胞培养板，37℃，5%CO2培养箱中培养。待细胞长满1/2时，取培养上清液，采用ELISA法筛选阳性细胞，选择阳性细胞进行亚克隆；
S10：腹水生产及单抗纯化筛选到的杂交瘤细胞扩大培养，成年BALb/c小鼠腹腔接种液体石蜡，每只小鼠0.3-0.5 ml，1周后按5×105个/0.2ml注入致敏小鼠腹腔，1周后观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可采集腹水，腹水4℃12000rpm离心15min，去除杂质，经0.45μm滤膜过滤后，用ProteinG亲和层析纯化抗体，微量紫外分光光度计测IgG抗体浓度，10%SDS-PAGE分析抗体纯度。
有益效果：
1.顶盖和底托未安装时，滑块无法于底托的内部移动，而滑块的一端与气囊贴合设置，此时底托内侧的托板处于静止状态，连杆的一端处于滑轨的最下端，此时连杆的一端与滑轨的内侧形成抵紧支撑，避免托板因自身重力于底托的内侧向下滑动，此时试纸卡整体处于底托的凹槽内侧，试纸卡的上端与顶盖的检测口存在一定间隔，能够避免试纸卡的表面被污染；
2.手动将试纸卡和吸附层放置于底托的内侧，将顶盖与底托呈水平贴合，此时底托侧面的套管与卡块滑动嵌套，卡块滑动至套管的内部后，卡块的一端挤压至滑块的一端，滑块能够于底托的内部滑动，此时滑块滑动延伸至套管的外侧；
3.利用斜板与卡块整体组合直径大于套管内部直径0.5-1cm，斜板嵌入于套管的内壁后，因斜板为可变形材质制成，此时套管能够挤压至斜板的一侧，斜板侧面能够与套管内壁滑动挤压贴合，斜板能够进一步增加卡块与套管的连接紧密性，方便顶盖和底托快速嵌合安装；
4.顶盖和底托安装后，滑块于底托的内部滑动，滑块滑动挤压至气囊的一端，利用气囊内壁厚度为0.5-1cm，而变形层厚度为0.2-0.4cm，能够在滑块挤压至气囊的一端时，利用变形层和气囊的厚度差，方便变形层快速于气囊的侧面变形，此时气囊整体处于变形状态，而变形层因气囊变形整体变形后，由于衬板自身向下倾斜15-35°设置，因此衬板整体能够向上摆动；
5.衬板整体向上摆动后，由于托板滑动于衬板的上端，衬板能够带动托板于底托的内部移动，托板在向上滑动后，底托内部的吸附层和试纸卡能够向上移动，吸附层能够与试纸卡贴合使用，吸附层对试纸卡内部向下滴落的样本进行吸附，避免液体样本流动至底托的内部，影响底托重复利用，使得该种检测盒能够在试纸卡未使用时，避免试纸卡的表面被污染；
6.HPV基因组不稳定时，E7就混入基因组中，E2会遭到破坏，其功能丧失，E7破坏细胞时，会产生E7癌蛋白，E7大量活动时，才会引起癌变，这是导致宫颈癌病变的根本原因，E7是致癌基因，通过大量表达而产生E7癌蛋白，导致细胞发生高级别癌前病变直至癌变。癌前病变的正确处理是宫颈癌筛查质量保证的关键，因为宫颈癌筛查的重要目的不仅是找出宫颈癌，而且是及时发现癌前病变并阻断其进展为宫颈癌，不同级别的癌前病变都有三种发展趋势:转归、持续、进展，正确判定癌前病变的发展趋势，是高质量筛查的关键，既可避免不必要的过度治疗，又防止漏诊；
7.首次利用E7癌蛋白对宫颈癌进行靶点检测，敏感性高，特异性强，直接反映宫颈病变趋势，首个基于抗体的宫颈癌检测产品，大大降低假阳性率，提高诊断准确度，方便后续的治疗，E7癌蛋白抑制正常凋亡过程，诱导细胞分裂周期加快，出现宫颈上皮细胞改变，检测E7癌蛋白对于宫颈癌的癌细胞变化提供明确的判断，E7癌蛋白过度表达对宫颈癌病变及CIN预测提供理论依据，使用范围广，适合宫颈癌的早期分流筛查、辅助诊断和术后随访，E7检测无需检测靶标提纯、反转录、扩增，极大地减少DNA方法扩增所带来的污染问题，操作方便，对实验条件要求不高，运行成本较低，适合各级医疗机构使用。
附图说明
图1为本发明整体结构示意图。
图2为本发明试纸卡结构示意图。
图3为本发明底托结构示意图。
图4为本发明底托局部结构示意图。
图5为本发明顶盖结构示意图。
图6为本发明滑块组件结构示意图。
图7为本发明气囊组件结构示意图。
图8为本发明气囊变形结构示意图。
图9为本发明图6中A处放大结构示意图。
图1-9中，部件名称与附图编号的对应关系为：
1-顶盖，101-底托，102-试纸卡，103-试管，104-吸附层，2-套管，201-滑块，202-卡块，203-斜板，3-气囊，301-变形层，302-衬板，4-托板，401-转轴，402-连杆，403-滑轨。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例：
如附图1-9所示：
实施例1：本实施例涉及一种宫颈癌E7蛋白检测抗体抗原的检测盒及检测方法，该检测盒包括：顶盖1和底托101，底托101与顶盖1活动嵌套连接，顶盖1和底托101的夹层内部活动嵌套有试纸卡102，底托101的内侧活动贯穿有吸附层104；
其中：底托101和顶盖1，顶盖1的内部贯穿有观察口，底托101的内部贯穿有孔洞，孔洞长度大于底托101长度的二分之一，底托101靠近顶盖1的一侧开设有凹槽，试纸卡102活动嵌套于凹槽的内部，底托101的内侧设有快速托举的摆动组件；
孔洞长度大于底托101长度的二分之一，方便吸附层104能够从孔洞内部取出；
通过观察口观察试纸卡102的检测线和质控线；
试纸卡102，试纸卡102的表面设有检测线和质控线，试纸卡102为E7蛋白检测试纸卡，试纸卡102中的检测试剂上含有抗体、抗原，用于检测样品中的病毒，试纸卡102配套设有试管103；
所涉及的抗体、抗原应用基因重组和杂交瘤技术，将E7蛋白进行了原核表达和纯化，以此作为免疫原制备E7蛋白单克隆抗体，并进行初步鉴定，用于检测样品中的病毒；
试管103能够将样本释放剂进行滴落至试纸卡102的表面进行辅助检测；
吸附层104，吸附层104与试纸卡102呈垂直贴合设置，吸附层104厚度为0.2-0.8cm，吸附层104为由海绵材质制备而成；
被测样本、试剂盒及其它所用器材均应当恢复至室温15-30℃后使用，手动将试纸卡102平放于桌面上，家用使用者使用滴管吸从处理样本的试管取样本上清滴4-5滴入试纸卡102中，加样15min后，如果检测线和质控线均出现，检测结果初步诊断为E7蛋白阳性，两条线中一条的颜色可能比另一线颜色深或浅，试纸卡102上只出现质控线一条红线，检测线未出现，结果视为阴性；
试纸卡102的检测线和质控线判断可参考说明书附图2；
实施例2：参考说明书附图3-5可得知，实施例2与实施例1的不同在于，摆动组件包括：套管2、滑块201、卡块202和斜板203，套管2设于底托101的两侧，滑块201滑动并延伸至底托101的内部，卡块202设于顶盖1的两侧，斜板203镶嵌于卡块202的两侧；
其中：套管2，套管2呈圆环状设置，套管2嵌入于底托101的内侧，套管2与卡块202滑动嵌套，套管2与滑块201配套设置；
通过设有套管2，方便卡块202嵌入于底托101的内部，进而能够方便顶盖1与底托101卡接；
滑块201，滑块201于套管2的内部滑动嵌套，滑块201呈垂直滑动，滑块201的外侧壁与套管2内壁滑动贴合；
卡块202，卡块202与套管2配套设置，卡块202侧面呈梯形设置，顶盖1通过卡块202与套管2滑动嵌套；
卡块202侧面呈梯形设置，方便斜板203的侧面与套管2的内壁滑动贴合；
斜板203，斜板203呈倾斜15-35°设置，斜板203与套管2的内壁滑动挤压贴合，斜板203与卡块202整体组合直径大于套管2内部直径0.5-1cm，斜板203为可变形材质制成，如橡胶材质；
斜板203与卡块202整体组合直径大于套管2内部直径0.5-1cm，斜板203嵌入于套管2的内壁后，因斜板203为可变形材质制成，此时套管2能够挤压至斜板203的一侧，斜板203侧面能够与套管2内壁滑动挤压贴合；
其中：手动将试纸卡102和吸附层104放置于底托101的内侧，将顶盖1与底托101呈水平贴合，此时底托101侧面的套管2与卡块202滑动嵌套，卡块202滑动至套管2的内部后，卡块202的一端挤压至滑块201的一端，滑块201能够于底托101的内部滑动，此时滑块201滑动延伸至套管2的外侧；
利用斜板203与卡块202整体组合直径大于套管2内部直径0.5-1cm，斜板203嵌入于套管2的内壁后，因斜板203为可变形材质制成，此时套管2能够挤压至斜板203的一侧，斜板203侧面能够与套管2内壁滑动挤压贴合，斜板203能够进一步增加卡块202与套管2的连接紧密性，方便顶盖1和底托101快速嵌合安装；
实施例3：参考说明书附图4、6至9可得知，实施例3与实施例1和2的不同在于，摆动组件还包括气囊3、变形层301、衬板302、托板4、转轴401、连杆402和滑轨403，气囊3镶嵌于滑块201远离套管2的一端，变形层301镶嵌于气囊3远离滑块201的一端，衬板302摆动于变形层301远离气囊3的一侧，托板4滑动于衬板302的上端，转轴401铰接于托板4下端的两侧，连杆402摆动于转轴401的一端，滑轨403设于托板4下方的两侧；
其中：气囊3，气囊3、变形层301、衬板302、托板4、转轴401、连杆402和滑轨403均设于底托101的内部，气囊3内壁厚度为0.5-1cm，而变形层301厚度为0.2-0.4cm，气囊3呈不规则形状设置，具体形状可参考说明书附图7所示；
利用气囊3内壁厚度为0.5-1cm，而变形层301厚度为0.2-0.4cm，能够在滑块201挤压至气囊3的一端时，利用变形层301和气囊3的厚度差，方便变形层301快速于气囊3的侧面变形，变形后形状可参考说明书附图8；
变形层301和衬板302，变形层301与衬板302配套设置，衬板302呈向下倾斜15-35°设置，变形层301呈半圆弧状设置，半圆弧角度为90°，衬板302环绕有2-4个于变形层301的侧面，变形层301材质与斜板203材质相同；
变形层301因气囊3变形整体变形后，由于衬板302自身向下倾斜15-35°设置，因此衬板302整体能够向上摆动；
托板4，托板4的一端延伸至底托101的内侧，同时托板4的一端延伸至吸附层104的下端，托板4分布于吸附层104下端的两侧，托板4于底托101的内侧呈垂直滑动；
通过设置有托板4，托板4在向上滑动后，底托101内部的吸附层104和试纸卡102能够向上移动，吸附层104能够与试纸卡102贴合使用，吸附层104对试纸卡102内部向下滴落的样本进行吸附，避免液体样本流动至底托101的内部，影响底托101重复利用；
连杆402和转轴401，连杆402远离转轴401的一端滑动于滑轨403的内部，托板4处于静止状态时，连杆402的一端处于滑轨403的最下端，而托板4整体向上滑动时，连杆402于滑轨403的内部向上滑动；
托板4处于静止状态时，连杆402的一端处于滑轨403的最下端，此时连杆402的一端与滑轨403的内侧形成抵紧支撑，避免托板4因自身重力于底托101的内侧向下滑动；
滑轨403，滑轨403呈倾斜35-50°设置，滑轨403靠近连杆402的一端开设有凹槽，滑轨403整体呈半圆环状设置；
其中：顶盖1和底托101未安装时，滑块201无法于底托101的内部移动，而滑块201的一端与气囊3贴合设置，此时底托101内侧的托板4处于静止状态，连杆402的一端处于滑轨403的最下端，此时连杆402的一端与滑轨403的内侧形成抵紧支撑，避免托板4因自身重力于底托101的内侧向下滑动，此时试纸卡102整体处于底托101的凹槽内侧，试纸卡102的上端与顶盖1的检测口存在一定间隔，能够避免试纸卡102的表面被污染；
顶盖1和底托101安装后，滑块201于底托101的内部滑动，滑块201滑动挤压至气囊3的一端，利用气囊3内壁厚度为0.5-1cm，而变形层301厚度为0.2-0.4cm，能够在滑块201挤压至气囊3的一端时，利用变形层301和气囊3的厚度差，方便变形层301快速于气囊3的侧面变形，此时气囊3整体处于变形状态，而变形层301因气囊3变形整体变形后，由于衬板302自身向下倾斜15-35°设置，因此衬板302整体能够向上摆动；
衬板302整体向上摆动后，由于托板4滑动于衬板302的上端，衬板302能够带动托板4于底托101的内部移动，托板4在向上滑动后，底托101内部的吸附层104和试纸卡102能够向上移动，吸附层104能够与试纸卡102贴合使用，吸附层104对试纸卡102内部向下滴落的样本进行吸附，避免液体样本流动至底托101的内部，影响底托101重复利用，使得该种检测盒能够在试纸卡102未使用时，避免试纸卡102的表面被污染；
实施例4：所述试剂盒的测试方法，包括如下步骤=：
S1：首先构建包含E7编码序列的PET-32a表达质粒，转化大肠杆菌表达菌BL21（DE3），收集菌体，通过Ni柱纯化得到纯化后的E7重组蛋白；用制备的E7重组蛋白作为免疫原对Balb/c小鼠进行免疫，ELISA间接法检测小鼠血清效价超过1/8K后，取免疫小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，杂交瘤细胞通过ELISA间接法进行亚克隆筛选，得到分泌抗E7的单克隆杂交瘤细胞；将杂交瘤细胞注射小鼠腹腔，收集腹水经过纯化后得到抗E7蛋白特异性单克隆抗体；
S2：基因组不稳定时，E7就混入基因组中，E7破坏细胞时，会产生E7癌蛋白，E7大量活动时，才会引起癌变，E7基因编码的致癌蛋白是导致宫颈上皮癌变的重要因子，这种蛋白通过抑制视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)使被感染的细胞可无限增殖并恶性转变；
S3：pRb是抑癌蛋白，正常情况下，非磷酸化的pRb与核转录因子E2F特异性结合，形成二者化合物后，抑制E2F对靶基因的转录，从而使细胞停留在G1期，细胞不能增殖，而高危型HPVE7蛋白通过其CR区的结构与pRb的649-72口袋结构特异性结合，从而释放E2F因子，促使细胞从G1期进入S期，同时E7促使pRb进入泛素依赖的途径降解，E7蛋白被认为在细胞转化和肿瘤行程中起重要作用；
S4：HPV进入人体后能够长期隐匿并大量复制和机体免疫力低下有关，HPV感染者不能建立有效的免疫反应，E7蛋白是HPV的主要转化蛋白质，是一种仅有98个氨基酸小的酸性蛋白，定位于核内或附着于核基质上，E7蛋白分为：1区，1-15氨基酸；2区，16-37氨基酸；3区，38-98氨基酸；锌指及C端区；
S5：对E7免疫表位的研究表明，E7蛋白的鼠T细胞表位均在C端区及锌指区，但其HLA-A表位除了存在于锌指区，也存在于N端区，E7蛋白不仅具有转化和致癌作用，而且还具有对病毒基因和细胞基因转录的反式激活活性；
S6：重组载体构建和蛋白表达 设计引物，用PCR方法从HPV16阳性样本中扩增E7基因序列，酶切后连接PET-32a质粒，重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取阳性菌落PCR鉴定及测序，测序正确的质粒扩增，转化大肠杆菌表达菌BL21（DE3），挑单菌落至2ml液体LB培养基37℃220rpm培养至OD值0.6-0.8，加入诱导剂IPTG，继续诱导培养4h，离心收菌体进行SDS-PAGE及Westernblot鉴定；
S7：挑选阳性高表达菌冻存，同时扩大培养，将重组表达菌接种在液体LB培养基，37℃ 220rpm过夜培养，种子液按1/50放大至液体LB培养基，37℃ 220rpm培养至OD值0.6-0.8，加入诱导剂IPTG终浓度1mmol/L，25℃诱导过夜，离心收集菌体沉淀，PBS缓冲液重悬，冰浴下超声破碎菌体离心收集上清，0.45μm滤膜过滤后Ni柱纯化，SDS-PAGE鉴定测定分子量及纯度；
S8:动物免疫及效价测定以制备重组E7蛋白作为免疫原免疫BALb/c小鼠，初次免疫抗原50μg加弗氏完全佐剂皮下多点注射免疫；2周后第二次免疫，抗原100ug，加弗氏不完全佐剂皮下多点注射免疫；2周后第三次免疫，剂量同第二次免疫，7天后尾尖采血测其效价，选择效价最高的小鼠于1周后，抗原100ug，加弗氏不完全佐剂进行腹腔注射加强免疫；
S9：细胞融合及筛选克隆加强免疫3天后进行融合，于融合前48小时，将骨髓瘤细胞扩大培养，融合前24小时换液一次，使细胞融合当天处于对数生长期，融合前24小时取空白BALb/c小鼠腹腔巨噬细胞按每孔1×104接种至96孔板，置37℃，5%CO2培养箱中培养，将完成免疫小鼠眼球采血后脱颈处死，分离小鼠脾细胞，通过50%PEG进行融合，将融合后细胞100μl每孔加入铺有饲养细胞的96孔细胞培养板，37℃，5%CO2培养箱中培养。待细胞长满1/2时，取培养上清液，采用ELISA法筛选阳性细胞，选择阳性细胞进行亚克隆；
S10：腹水生产及单抗纯化筛选到的杂交瘤细胞扩大培养，成年BALb/c小鼠腹腔接种液体石蜡，每只小鼠0.3-0.5 ml，1周后按5×105个/0.2ml注入致敏小鼠腹腔，1周后观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可采集腹水，腹水4℃12000rpm离心15min，去除杂质，经0.45μm滤膜过滤后，用ProteinG亲和层析纯化抗体，微量紫外分光光度计测IgG抗体浓度，10%SDS-PAGE分析抗体纯度；
实施例5：HPV基因组不稳定时，E7就混入基因组中，E2会遭到破坏，其功能丧失，E7破坏细胞时，会产生E7癌蛋白，E7大量活动时，才会引起癌变，这是导致宫颈癌病变的根本原因，E7是致癌基因，通过大量表达而产生E7癌蛋白，导致细胞发生高级别癌前病变直至癌变。癌前病变的正确处理是宫颈癌筛查质量保证的关键，因为宫颈癌筛查的重要目的不仅是找出宫颈癌，而且是及时发现癌前病变并阻断其进展为宫颈癌，不同级别的癌前病变都有三种发展趋势:转归、持续、进展，正确判定癌前病变的发展趋势，是高质量筛查的关键，既可避免不必要的过度治疗，又防止漏诊；
本发明首次利用E7癌蛋白对宫颈癌进行靶点检测，敏感性高，特异性强，直接反映宫颈病变趋势，是首个基于抗体的宫颈癌检测产品，大大降低假阳性率，提高诊断准确度，方便后续的治疗；E7癌蛋白抑制正常凋亡过程，诱导细胞分裂周期加快，出现宫颈上皮细胞改变，检测E7癌蛋白对于宫颈癌的癌细胞变化提供明确的判断，E7癌蛋白过度表达对宫颈癌病变及CIN预测提供理论依据，使用范围广，适合宫颈癌的早期分流筛查、辅助诊断和术后随访，E7检测无需检测靶标提纯、反转录、扩增，极大地减少DNA方法扩增所带来的污染问题，操作方便，对实验条件要求不高，运行成本较低，适合各级医疗机构使用。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质。
Claims (7)
1.一种宫颈癌E7蛋白检测抗体抗原的检测盒，包括：顶盖（1）和底托（101），其特征在于，底托（101）与顶盖（1）活动嵌套连接，所述顶盖（1）和底托（101）的夹层内部活动嵌套有试纸卡（102），所述底托（101）的内侧活动贯穿有吸附层（104）；
所述顶盖（1）的内部贯穿有观察口，底托（101）的内部贯穿有孔洞，底托（101）靠近顶盖（1）的一侧开设有凹槽，试纸卡（102）活动嵌套于凹槽的内部，底托（101）的内侧设有托举的摆动组件；
所述试纸卡（102）的表面设有检测线和质控线，试纸卡（102）为E7蛋白检测试纸卡，试纸卡（102）的检测试剂中含有抗体、抗原，用于检测样品中的病毒，试纸卡（102）配套设有试管（103）；
所述吸附层（104）与试纸卡（102）垂直贴合设置，吸附层（104）厚度为0.2-0.8cm；
所述摆动组件包括：套管（2）、滑块（201）、卡块（202）和斜板（203），套管（2）设于底托（101）的两侧，滑块（201）与底托（101）滑动连接且延伸至底托（101）的内部，卡块（202）设于顶盖（1）的两侧，斜板（203）镶嵌于卡块（202）的两侧；
所述摆动组件还包括：气囊（3）、变形层（301）、衬板（302）、托板（4）、转轴（401）、连杆（402）和滑轨（403）；
其中，气囊（3）镶嵌于滑块（201）远离套管（2）的一端，变形层（301）镶嵌于气囊（3）远离滑块（201）的一端，衬板（302）摆动于变形层（301）远离气囊（3）的一侧，托板（4）滑动于衬板（302）的上端，转轴（401）铰接于托板（4）下端的两侧，连杆（402）摆动于转轴（401）的一端，滑轨（403）设于托板（4）下方的两侧。
2.根据权利要求1所述的宫颈癌E7蛋白检测抗体抗原的检测盒，其特征在于，所述套管（2）呈圆环状设置，套管（2）嵌入于底托（101）的内侧，套管（2）与卡块（202）滑动嵌套连接，套管（2）与滑块（201）配套设置；
滑块（201）于套管（2）的内部滑动嵌套，滑块（201）的外侧壁与套管（2）的内壁滑动贴合设置。
3.根据权利要求1所述的宫颈癌E7蛋白检测抗体抗原的检测盒，其特征在于，所述卡块（202）与套管（2）配套设置，卡块（202）的侧面呈梯形设置，顶盖（1）通过卡块（202）与套管（2）滑动嵌套；
斜板（203）呈倾斜15-35°设置，斜板（203）与套管（2）的内壁滑动挤压贴合设置，斜板（203）为由可变形材质制成。
4.根据权利要求1所述的宫颈癌E7蛋白检测抗体抗原的检测盒，其特征在于，所述气囊（3）、变形层（301）、衬板（302）、托板（4）、转轴（401）、连杆（402）和滑轨（403）均设于底托（101）的内部，气囊（3）内壁厚度为0.5-1cm，变形层（301）厚度为0.2-0.4cm。
5.根据权利要求1所述的宫颈癌E7蛋白检测抗体抗原的检测盒，其特征在于，所述变形层（301）与衬板（302）配套设置，衬板（302）呈向下倾斜15-35°设置，变形层（301）呈半圆弧状，衬板（302）环绕有2-4个于变形层（301）的侧面，变形层（301）材质与斜板（203）材质相同；托板（4）的一端延伸至底托（101）的内侧，托板（4）的另一端延伸至吸附层（104）的下端，托板（4）分布于吸附层（104）下端的两侧，托板（4）于底托（101）的内侧垂直滑动。
6.根据权利要求1所述的宫颈癌E7蛋白检测抗体抗原的检测盒，其特征在于，所述连杆（402）远离转轴（401）的一端滑动于滑轨（403）的内部，托板（4）处于静止状态时，连杆（402）的一端处于滑轨（403）的底端，托板（4）整体向上滑动时，连杆（402）于滑轨（403）的内部向上滑动；滑轨（403）呈倾斜35-50°设置，滑轨（403）靠近连杆（402）的一端开设有凹槽。
7.一种根据权利要求1-6任一项中所述宫颈癌E7蛋白检测抗体抗原的检测盒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：首先构建包含E7编码序列的PET-32a表达质粒，转化大肠杆菌表达菌BL21，收集菌体，通过Ni柱纯化得到E7重组蛋白；用E7重组蛋白作为免疫原，对Balb/c小鼠进行免疫，ELISA间接法检测小鼠血清效价超过1/8K后，取免疫小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，杂交瘤细胞通过ELISA间接法进行亚克隆筛选，得到分泌抗E7的单克隆杂交瘤细胞；将杂交瘤细胞注射小鼠腹腔，收集腹水经过纯化后得到抗E7蛋白特异性单克隆抗体；
S2：基因组待稳定时，E7混入基因组中破坏细胞时，产生E7癌蛋白，E7大量活动时，会引起癌变，E7基因编码的致癌蛋白是导致宫颈上皮癌变的重要因子，该蛋白通过抑制视网膜母细胞瘤蛋白pRb使被感染的细胞无限增殖并恶性转变；
S3：pRb是抑癌蛋白，正常情况下，非磷酸化的pRb与核转录因子E2F特异性结合，形成二者化合物后，抑制E2F对靶基因的转录，使细胞停留在G1期，细胞停止增殖；高危型HPVE7蛋白通过其CR区的结构与pRb的649-72口袋结构特异性结合，释放E2F因子，促使细胞从G1期进入S期，E7促使pRb进入泛素依赖的途径降解；
S4：HPV进入人体后能够长期隐匿并大量复制和机体免疫力低下有关， E7蛋白是HPV的主要转化蛋白质，是一种仅有98个氨基酸小的酸性蛋白，定位于核内或附着于核基质上，E7蛋白分为：1区，1-15氨基酸；2区，16-37氨基酸；3区，38-98氨基酸；锌指及C端区；
S5：E7蛋白的鼠T细胞表位均在C端区及锌指区，HLA-A表位存在于锌指区、N端区；
S6：重组载体构建和蛋白表达设计引物，用PCR方法从HPV16阳性样本中扩增E7基因序列，酶切后连接PET-32a质粒，重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取阳性菌落PCR鉴定及测序，测序正确的质粒扩增，转化大肠杆菌表达菌BL21，挑单菌落至2ml液体LB培养基37℃220rpm培养至OD值0.6-0.8，加入诱导剂IPTG，继续诱导培养4h，离心收菌体进行SDS-PAGE及Westernblot鉴定；
S7：挑选阳性高表达菌冻存，扩大培养，将重组表达菌接种在液体LB培养基，37℃220rpm过夜培养，种子液按1/50放大至液体LB培养基，37℃ 220rpm培养至OD值0.6-0.8，加入诱导剂IPTG终浓度1mmol/L，25℃诱导过夜，离心收集菌体沉淀，PBS缓冲液重悬，冰浴下超声破碎菌体离心收集上清，0.45μm滤膜过滤后Ni柱纯化，SDS-PAGE鉴定测定分子量及纯度；
S8:动物免疫及效价测定：以制备重组E7蛋白作为免疫原免疫BALb/c小鼠，初次免疫抗原50μg加弗氏完全佐剂皮下多点注射免疫；2周后第二次免疫，抗原100ug，加弗氏不完全佐剂皮下多点注射免疫；2周后第三次免疫，剂量同第二次免疫，7天后尾尖采血测其效价，选择效价最高的小鼠于1周后，抗原100ug，加弗氏不完全佐剂进行腹腔注射加强免疫；
S9：细胞融合及筛选克隆加强免疫3天后进行融合，于融合前48小时，将骨髓瘤细胞扩大培养，融合前24小时换液一次，使细胞融合当天处于对数生长期，融合前24小时取空白BALb/c小鼠腹腔巨噬细胞按每孔1×104接种至96孔板，置37℃，5%CO2培养箱中培养，将完成免疫小鼠眼球采血后，分离小鼠脾细胞，通过50%PEG进行融合，将融合后细胞100μl每孔加入铺有饲养细胞的96孔细胞培养板，37℃，5%CO2培养箱中培养，待细胞长满1/2时，取培养上清液，采用ELISA法筛选阳性细胞，选择阳性细胞进行亚克隆；
S10：腹水生产及单抗纯化筛选到的杂交瘤细胞扩大培养，成年BALb/c小鼠腹腔接种液体石蜡，每只小鼠0.3-0.5 ml，1周后按5×105个/0.2ml注入致敏小鼠腹腔，1周后观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可采集腹水，腹水4℃，12000rpm离心15min，去除杂质，经0.45μm滤膜过滤后，用ProteinG亲和层析纯化抗体，微量紫外分光光度计测IgG抗体浓度，10% SDS-PAGE分析抗体纯度。
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