CN108218983A - 抗hpv18型e7蛋白的单克隆抗体、检测试纸和检测试剂盒 - Google Patents

抗hpv18型e7蛋白的单克隆抗体、检测试纸和检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

一种抗HPV18型E7蛋白的单克隆抗体、检测试纸和检测试剂盒。抗HPV18型E7蛋白的单克隆抗体，其与HPV18型E7蛋白的结合位点是：HPV18型E7蛋白第10‑20氨基酸、HPV18型E7蛋白第22‑39氨基酸、HPV18型E7蛋白第61‑67氨基酸或HPV18型E7蛋白第73‑79氨基酸。该免疫层析试纸包括背衬以及固定于背衬上的样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫；结合垫贴合固定于样品垫下方，NC膜的一端贴合固定于结合垫下方，另一端与吸水垫相连；所述NC膜上喷涂有检测抗体，所述检测抗体包括所述的抗HPV18型E7蛋白的单克隆抗体和羊抗鼠二抗，所述抗HPV18型E7蛋白的单克隆抗体用作检测线，所述羊抗鼠二抗用作质控线；所述结合垫上包被有荧光微球标记抗体。本申请可简单快速地检测出HPV18型E7蛋白。

Description

抗HPV18型E7蛋白的单克隆抗体、检测试纸和检测试剂盒
技术领域
本申请涉及抗体领域，尤其是一种抗HPV18型E7蛋白的单克隆抗体、检测试纸和检测试剂盒。
背景技术
宫颈癌是全球妇女中仅次于乳腺癌和结直肠癌的第3个常见的恶性肿瘤，在发展中国家是仅次于乳腺癌居第2位常见的恶性肿瘤，是最常见的女性生殖道恶性肿瘤。宫颈癌是目前唯一一个病因明确的妇科恶性肿瘤，与高危型人乳头瘤病毒(humanpapillomaviruses,HPV)的持续感染相关。根据HPV病毒与宫颈癌的关系分为高危型和低危型，其中，低危险型HPV包括HPV6、11、42、43、44等，常引起外生殖器湿疣等良性病变包括宫颈上皮内低度病变(CIN I)，高危险型HPV包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68，CP8304等亚型，与宫颈癌及宫颈上皮内高度病变(CIN II/III)的发生相关，尤其是HPV16和18型。
人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)是一种嗜上皮性病毒，共有3个基因区组成，包括早期区(Early Region，E区)、晚期区(Late Region，L区)与非编码区(Uncoding Region，UCR)或上游调控区(URR)。E区按顺序为E6、E7、E1、E2、E3、E4和E5共7个基因，参与病毒DNA的复制、转录、编码病毒蛋白、维持细胞内病毒的高拷贝数的基因，其中E6和E7是HPV的主要致癌基因，与病毒细胞转化功能及致癌性有关。E6和E7蛋白使肿瘤阻抑蛋白p53和pRB钝化，分别解除细胞周期控制和抑制细胞凋亡。因此，用于测定肿瘤中的HPV状态的最佳方法是测量肿瘤细胞中的E6/E7蛋白。
高危型人乳头瘤病毒(HPV)已被确认为导致宫颈癌的诱因，但90％以上的HPV感染是一过性的，在2年内会被免疫系统清除。当HPV病毒发生持续性感染后，特别是HPV的DNA和人类宫颈上皮细胞的DNA发生整合后，E6，E7基因会大量表达一种称为mRNA的物质，从而大量产生致癌蛋白，使人类细胞逐渐发生癌变。
目前宫颈癌的筛查方法有3类：
1.传统的形态学方法检测HPV
包括巴氏涂片细胞病理学检测、阴道镜检查、宫颈活检组织病理学检查等。宫颈细胞学筛查特异性高，但是灵敏度较低，同时花费很高。细胞出现病变前已经有HPV感染，所以必须结合其他方法。
2.HPV DNA的检测
以上已经提到高危型HPV的持续感染时宫颈癌的直接病因，在细胞学筛查正常前，HPV DNA的检测很重要。目前应用最多的是PCR，其次是杂交捕获技术。PCR灵敏度高，可以同时诊断多个亚型，但会出现假阳性，特异性低；杂交捕获技术没有假阳性，但需要专业设备、专业人才，目前不能推广使之受到限制。
3.血清学方法和免疫学方法
主要是检测患者血清中的L1抗体或是用抗体检测抗原。但L1抗体在HPV清除后几个月到1年后都有较高的效价，所以血清中的L1抗体的检测无法确定具体感染日期。用ELISA检测血清中的HPV E6、E7特异性抗体，目前在HPV18阳性的口腔癌患者血清中可以检测到E6、E7特异性抗体，在其他HPV相关癌症中没有研究过。用抗体检测抗原的方法主要指免疫组化法，因为该方法的时间很长，操作繁琐。所以血清学和免疫学方法检测的应用受到限制。
以上检测HPV的方法在宫颈癌及癌前病变筛查和癌前预报中发挥了重要作用。但是有一个共同的局限性：操作程序复杂、需要专业的仪器设备、成本高，不易推广。因此建立一种简单快速的检测方法迫在眉睫。
发明内容
本申请提供一种抗HPV18型E7蛋白的单克隆抗体、检测试纸和检测试剂盒，可简单快速地检测出HPV18型E7蛋白。
根据本申请的第一方面，本申请提供一种抗HPV18型E7蛋白的单克隆抗体，其与HPV18型E7蛋白的结合位点是：HPV18型E7蛋白第10-20氨基酸、HPV18型E7蛋白第22-39氨基酸、HPV18型E7蛋白第61-67氨基酸或HPV18型E7蛋白第73-79氨基酸。
根据本申请的第二方面，本申请提供一种免疫层析试纸条，包括背衬以及固定于背衬上的样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫；结合垫贴合固定于样品垫下方，NC膜的一端贴合固定于结合垫下方，另一端与吸水垫相连；所述NC膜上喷涂有检测抗体，所述检测抗体包括上述的抗HPV18型E7蛋白的单克隆抗体和羊抗鼠二抗，所述抗HPV18型E7蛋白的单克隆抗体用作检测线，所述羊抗鼠二抗用作质控线；所述结合垫上包被有荧光微球标记抗体。
进一步的，所述荧光微球标记抗体为用荧光微球偶联权利要求1所述的抗HPV18型E7蛋白的单克隆抗体的偶联物。
优选的，所述NC膜上检测抗体的包被量为0.05～0.5μg，所述结合垫上荧光微球标记抗体的包被量为0.05～0.5μg。
优选的，所述荧光微球标记抗体通过如下方法制备获得：用活化液替换微球原有保存液；加入EDC和Sulfo-NHS进行活化：称取一定量的EDC和Sulfo-NHS，溶解后加入微球溶液中旋转反应15-20min；去除未反应或残余的反应物；用反应液超声重悬微球，然后加入一定量的待标记单克隆抗体，避光反应1-4小时；去除未偶联的单克隆抗体；封闭微球上未偶联的反应基团：用封闭液反应0.5-1小时或用封闭液重复进行去除未偶联的单克隆抗体操作；用保存液重悬微球至原体积，2-8℃保存备用。
根据本申请的第三方面，本申请提供一种HPV18型E7蛋白的免疫层析试纸条的制备方法，包括如下本步骤：使用点膜仪将上述的抗HPV18型E7蛋白的单克隆抗体及羊抗鼠二抗喷涂在NC膜上,分别作为检测线与质控线,经36-38℃干燥箱干燥过夜；同时将荧光微球标记抗体喷涂在结合垫上，常温下真空干燥2h；将NC膜、结合垫、样品垫、吸水垫及背衬组装好后,切割成试纸条,加干燥剂于4～30℃密封保存。
根据本申请的第四方面，本申请提供一种HPV18型E7蛋白的检测试剂盒，包括盒体以及设置在盒体内的上述的HPV18型E7蛋白的免疫层析试纸条。
根据本申请的第五方面，本申请提供一种HPV18型E7蛋白的检测方法，包括如下步骤：制备人体宫颈脱落细胞裂解液，获取待检测的人体宫颈脱落细胞样本，加入所述裂解液中，涡旋震荡1-5min，放入冰箱冻融1-3次，再次震荡1-5min，离心5-10min，收集上清液，加入到权利要求7所述的检测试剂盒中，并将所述检测试剂盒置于荧光检测仪孵育仓；荧光检测仪自动检测，读取检测试剂盒上的发光值；荧光检测仪依据所述发光值确定样本中HPV18型E7蛋白含量，当HPV18型E7蛋白含量大于预定值时，确定样本中HPV18型E7蛋白呈阳性，否则，确定样本中HPV18型E7蛋白呈阴性。
优选的，所述预定值为6.85ng/ml。
优选的，制备人体宫颈脱落细胞裂解液的过程包括如下步骤：用1mM-100mM的缓冲液配置体积百分比为0.1％-5％的表面活性剂；用之前加入终浓度为0.1mM-1mM的蛋白酶抑制剂；所述的表面活性剂为Tween 20、Triton-100和十二烷基磺酸钠中的至少一种，所述的缓冲液为硼酸盐溶液、Tris-HCL或碳酸盐溶液，所述的蛋白酶抑制剂为PMSF和Antipain中的至少一种。
本申请的有益效果是，样本加入到样本垫后，经层析作用，HPV18型E7蛋白先后与荧光微球标记抗体和检测抗体结合，最后用配套的荧光检测仪检测荧光信号，由于荧光信号与HPV18型E7蛋白含量呈正相关，由此实现对人体宫颈脱落细胞中的HPV18型E7蛋白的定量检测。相比于原有检测方法，本申请的检测方法无需操作人员进行繁多的操作程序，更加简单、快捷。本发明直接检测高危型HPV18型E7致癌蛋白的表达量，从而对于高危型HPV的感染程度有了精准的判断，方便了后续的治疗。
附图说明
图1为本申请一种实施例的HPV18型E7蛋白的检测试剂盒的结构示意图；
图2为本申请一种实施例的通过拟合法得到的HPV18型E7蛋白的标准曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。
本申请实施例提供一种抗HPV18型E7蛋白的单克隆抗体，其与HPV18型E7蛋白的结合位点是：HPV18型E7蛋白第10-20氨基酸、HPV18型E7蛋白第22-39氨基酸、HPV18型E7蛋白第61-67氨基酸或HPV18型E7蛋白第73-79氨基酸。
本申请实施例提供一种HPV18型E7蛋白的检测试剂盒，如图1所示，包括盒体1以及设置在盒体1内的免疫层析试纸条，所述免疫层析试纸条包括背衬2以及固定于背衬2上的样品垫3、结合垫4、NC膜5和吸水垫6；结合垫4贴合固定于样品垫3下方，NC膜5的一端贴合固定于结合垫4下方，另一端与吸水垫6相连；所述盒体1的表面在样品垫3的上方开设有采样口7；所述NC膜5上喷涂有检测抗体，所述检测抗体包括上述的抗HPV18型E7蛋白的单克隆抗体和羊抗鼠二抗，所述抗HPV18型E7蛋白的单克隆抗体用作检测线8，所述羊抗鼠二抗用作质控线9；所述结合垫4上包被有荧光微球标记抗体。所述盒体1的表面在检测线8与质控线9上方开设有观察口10，通过该观察口10可观察到NC膜5上的反应结果。在使用时，将待检测样品经采样口7滴加到样品垫3，待检测样品依次经过样品垫3、结合垫4、NC膜5，并在NC膜5上发生免疫反应，最后从观察口10观察检测线8和质控线9的反应结果。
所述荧光微球标记抗体为用荧光微球偶联上述的抗HPV18型E7蛋白的单克隆抗体的偶联物。
为了保证反应的充分进行，使反应结果可见，所述NC膜上检测抗体的包被量为0.05～0.5μg，所述结合垫上荧光微球标记抗体的包被量为0.05～0.5μg。
在一种实施例中，所述荧光微球标记抗体通过如下方法制备获得：用活化液替换微球原有保存液：依次进行离心、去上清和活化液超声重悬操作；加入EDC和Sulfo-NHS进行活化：称取一定量的EDC和Sulfo-NHS，溶解后加入微球溶液中旋转反应15-20min；去除未反应或残余的反应物：依次进行离心、去上清和活化液超声重悬操作；用反应液超声重悬微球，然后加入一定量的待标记单克隆抗体，避光反应1-4小时；去除未偶联的单克隆抗体：依次进行离心、去上清和活化液超声重悬操作；封闭微球上未偶联的反应基团：用封闭液反应0.5-1小时或用封闭液重复进行去除未偶联的单克隆抗体操作；用保存液重悬微球至原体积，2-8℃保存备用。
本申请实施例提供一种HPV18型E7蛋白的免疫层析试纸条的制备方法，包括如下本步骤：使用点膜仪将上述的抗HPV18型E7蛋白的单克隆抗体及羊抗鼠二抗喷涂在NC膜上,分别作为检测线与质控线,经36-38℃干燥箱干燥过夜；同时将荧光微球标记抗体喷涂在结合垫上，常温下真空干燥2h；将NC膜、结合垫、样品垫、吸水垫及背衬组装好后,切割成试纸条,加干燥剂于4～30℃密封保存。
具体的，上述的点膜仪可以是Bio-Dot XYZ3000型点膜仪，或者其他型号的点膜仪。NC膜的干燥温度可以选用近似人体体温的37℃。结合垫的干燥温度可以选用30℃左右的常温。
本申请实施例还提供一种HPV18型E7蛋白的检测方法，包括如下步骤：制备人体宫颈脱落细胞裂解液，获取待检测的人体宫颈脱落细胞样本，加入所述裂解液中，涡旋震荡1-5min，放入冰箱冻融1-3次，冰箱的温度可以在-20℃左右，再次震荡1-5min，以10000rpm的转速离心5-10min，收集上清液，加入到上述的检测试剂盒中，并将所述检测试剂盒置于荧光检测仪孵育仓；荧光检测仪自动检测，读取检测试剂盒上的发光值；荧光检测仪依据所述发光值确定样本中HPV18型E7蛋白含量，当HPV18型E7蛋白含量大于预定值时，确定样本中HPV18型E7蛋白呈阳性，否则，确定样本中HPV18型E7蛋白呈阴性。
其中，在将待检测的样本加入到所述检测试剂盒之前，还应将免疫层析试纸条抽出，并在室温下放置10-20min，具体可以是15min。从而使免疫层析试纸条做好反应准备，以提升检测的准确性。在检测过程中，需要使用大量检测试剂盒，每个检测试剂盒中可加入100ul的待检测样品，加入样品后的检测试剂盒均放置在荧光检测仪，从而可以一次性检测多个样品，提升检测效率。
HPV18型E7蛋白会被荧光微球标记抗体标记，从而发出一定的荧光，荧光检测仪可自动检测其发出荧光的发光值。具体的，如图2所示，荧光检测仪中的内部程序，自动以校准品浓度为横坐标，发光值为纵坐标，采用四参数逻辑拟合法得到HPV18型E7蛋白含量的标准曲线方程，再根据标准曲线方程计算待检样本中HPV18型E7蛋白含量。检测结果的判读如下表：
宫颈脱落细胞样本中HPV18E7蛋白含量水平 (ng/ml)
阴性 <6.85
阳性 >6.85
在一种实施例中，制备人体宫颈脱落细胞裂解液的过程包括如下步骤：用1mM-100mM的缓冲液配置体积百分比为0.1％-5％的表面活性剂；用之前加入终浓度为0.1mM-1mM的蛋白酶抑制剂；所述的表面活性剂为Tween 20、Triton-100和十二烷基磺酸钠中的至少一种，所述的缓冲液为硼酸盐溶液、Tris-HCL或碳酸盐溶液，所述的蛋白酶抑制剂为PMSF和Antipain中的至少一种。
用本发明检测试剂盒检测部分经临床确认为HPV18型E7蛋白阴性的人群的宫颈脱落细胞(以下简称正常人宫颈脱落细胞)和经临床确认为HPV18型E7蛋白阳性的人群的宫颈脱落细胞(以下简称病人宫颈脱落细胞)，检测结果如表1和表2所示：
表1正常人宫颈脱落细胞检测结果
表2病人宫颈脱落细胞检测结果
样本标号 DNA检测结果 病理资料 HPV18E7抗原检测浓度(ng/ml)
病人1号 HPV18阳性 CIN III 53.67
病人2号 HPV18阳性 CIN III 45.21
病人3号 HPV18阳性 CIN III 79.86
病人4号 HPV18阳性 CIN II 5.79
病人5号 HPV18阳性 CIN II 4.83
病人6号 HPV18阳性 CIN III 70.76
病人7号 HPV18阳性 CIN II 30.18
病人8号 HPV18阳性 宫颈鳞癌 98.45
病人9号 HPV18阳性 CIN II 31.16
病人10号 HPV18阳性 CIN II 35.41
数据分析
1、根据正常人检测值，计算出平均值，标准方差，Cut-off值。算取30例正常人宫颈脱落细胞检测结果的平均数，并计算标准方差SD，本试剂盒在确定Cut-off值时选择正常人平均值加上两倍的标准方差作为HPV18E7蛋白表达阴阳性的判断标准，Cut-off计算公式为：cut-off＝平均值+2*SD标准方差，结果如下：
平均值 3.53
SD标准方差 1.66
Cut-off 6.85ng/ml
2、通过Cut-off值，判断待检样本HPV18E7蛋白表达的阴阳性，超过这个Cut-off值的即认为是阳性，即认为表达了HPV18E7蛋白，同时与病理资料对比。
3、根据Cut-off值判断表2病人宫颈脱落细胞诊断结果(“+”表示检测结果阳性；“-”表示检测结果阴性)
根据表2病人宫颈脱落细胞诊断结果阴阳性制定准确率比例表：
在表2实验中所检测的病人宫颈脱落细胞共计10例，该试剂盒HPV18E7蛋白检测结果为阳性的为8例，诊断灵敏度高达80％。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims (10)

1.一种抗HPV18型E7蛋白的单克隆抗体，其与HPV18型E7蛋白的结合位点是：HPV18型E7蛋白第10-20氨基酸、HPV18型E7蛋白第22-39氨基酸、HPV18型E7蛋白第61-67氨基酸或HPV18型E7蛋白第73-79氨基酸。
2.一种免疫层析试纸条，其特征在于：
包括背衬以及固定于背衬上的样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫；结合垫贴合固定于样品垫下方，NC膜的一端贴合固定于结合垫下方，另一端与吸水垫相连；所述NC膜上喷涂有检测抗体，所述检测抗体包括权利要求1所述的抗HPV18型E7蛋白的单克隆抗体和羊抗鼠二抗，所述抗HPV18型E7蛋白的单克隆抗体用作检测线，所述羊抗鼠二抗用作质控线；所述结合垫上包被有荧光微球标记抗体。
3.根据权利要求2所述的免疫层析试纸条，其特征在于：
所述荧光微球标记抗体为用荧光微球偶联权利要求1所述的抗HPV18型E7蛋白的单克隆抗体的偶联物。
4.根据权利要求2所述的免疫层析试纸条，其特征在于：
所述NC膜上检测抗体的包被量为0.05～0.5μg，所述结合垫上荧光微球标记抗体的包被量为0.05～0.5μg。
5.根据权利要求2所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述荧光微球标记抗体通过如下方法制备获得：
用活化液替换微球原有保存液；加入EDC和Sulfo-NHS进行活化：称取一定量的EDC和Sulfo-NHS，溶解后加入微球溶液中旋转反应15-20min；去除未反应或残余的反应物；用反应液超声重悬微球，然后加入一定量的待标记单克隆抗体，避光反应1-4小时；去除未偶联的单克隆抗体；封闭微球上未偶联的反应基团：用封闭液反应0.5-1小时或用封闭液重复进行去除未偶联的单克隆抗体操作；用保存液重悬微球至原体积，2-8℃保存备用。
6.一种HPV18型E7蛋白的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下本步骤：
使用点膜仪将如权利要求1所述的抗HPV18型E7蛋白的单克隆抗体及羊抗鼠二抗喷涂在NC膜上,分别作为检测线与质控线,经36-38℃干燥箱干燥过夜；同时将荧光微球标记抗体喷涂在结合垫上，常温下真空干燥2h；将NC膜、结合垫、样品垫、吸水垫及背衬组装好后,切割成试纸条,加干燥剂于4～30℃密封保存。
7.一种HPV18型E7蛋白的检测试剂盒，其特征在于：
包括盒体以及设置在盒体内的如权利要求2-5任意一项所述的HPV18型E7蛋白的免疫层析试纸条。
8.一种HPV18型E7蛋白的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
制备人体宫颈脱落细胞裂解液，获取待检测的人体宫颈脱落细胞样本，加入所述裂解液中，涡旋震荡1-5min，放入冰箱冻融1-3次，再次震荡1-5min，离心5-10min，收集上清液，加入到权利要求7所述的检测试剂盒中，并将所述检测试剂盒置于荧光检测仪孵育仓；
荧光检测仪自动检测，读取检测试剂盒上的发光值；
荧光检测仪依据所述发光值确定样本中HPV18型E7蛋白含量，当HPV18型E7蛋白含量大于预定值时，确定样本中HPV18型E7蛋白呈阳性，否则，确定样本中HPV18型E7蛋白呈阴性。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：
制备人体宫颈脱落细胞裂解液的过程包括如下步骤：用1mM-100mM的缓冲液配置体积百分比为0.1％-5％的表面活性剂；用之前加入终浓度为0.1mM-1mM的蛋白酶抑制剂；所述的表面活性剂为Tween 20、Triton-100和十二烷基磺酸钠中的至少一种，所述的缓冲液为硼酸盐溶液、Tris-HCL或碳酸盐溶液，所述的蛋白酶抑制剂为PMSF和Antipain中的至少一种。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：
所述预定值为6.85ng/ml。
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