CN107192830A - 抗hpv16型e7蛋白的单克隆抗体、检测试纸和检测试剂盒 - Google Patents

抗hpv16型e7蛋白的单克隆抗体、检测试纸和检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

一种抗HPV16型E7蛋白的单克隆抗体、检测试纸和检测试剂盒。抗HPV16型E7蛋白的单克隆抗体与HPV16型E7蛋白结合位点是：HPV16型E7蛋白第30‑36氨基酸、HPV16型E7蛋白第36‑43氨基酸、HPV16型E7蛋白第62‑73氨基酸或HPV16型E7蛋白第73‑77氨基酸。该检测试纸，包括背衬以及固定于背衬上的样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫；结合垫贴合固定于样品垫下方，NC膜的一端贴合固定于结合垫下方，另一端与吸水垫相连；NC膜上喷涂有检测抗体，检测抗体包括权利要求1的抗HPV16型E7蛋白的单克隆抗体和羊抗鼠二抗，抗HPV16型E7蛋白的单克隆抗体用作检测线，羊抗鼠二抗用作质控线；结合垫上包被有荧光微球标记抗体。本申请可简单快速地检测出HPV型E7蛋白。

Description

抗HPV16型E7蛋白的单克隆抗体、检测试纸和检测试剂盒
技术领域
本申请涉及抗体领域，尤其是一种抗HPV16型E7蛋白的单克隆抗体、检测试纸和检测试剂盒。
背景技术
宫颈癌是在女性中发病率极高的癌症，并且在99.7％的情况下与高危人乳头瘤病毒感染相关，全世界每年有约520000例宫颈癌，近260000人死亡。HPV有超过100种不同的分离株，已根据它们与宫颈癌或与良性宫颈病变或非典型增生的关联性被宽泛地再分成高危和低危亚型。低危险型HPV包括HPV6、11、42、43、44 等，常引起外生殖器湿疣等良性病变包括宫颈上皮内低度病变(CIN I)，高危险型 HPV 包括 HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68，CP8304等亚型，与宫颈癌及宫颈上皮内高度病变(CIN II/III) 的发生相关，尤其是 HPV16和18型，其中HPV16占50%以上。
人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)是一种嗜上皮性病毒，共有3个基因区组成，包括早期区(Early Region，E区)、晚期区(Late Region，L区)与非编码区(Uncoding Region，UCR)或上游调控区(URR)。E区按顺序为 E6、E7、E1、E2、E3、E4 和 E5 共7个基因，参与病毒DNA的复制、转录、编码病毒蛋白、维持细胞内病毒的高拷贝数的基因，其中E6和E7是HPV的主要致癌基因，与病毒细胞转化功能及致癌性有关。E6和E7蛋白使肿瘤阻抑蛋白p53和pRB钝化，分别解除细胞周期控制和抑制细胞凋亡。因此，用于测定肿瘤中的HPV 状态的最佳方法是测量肿瘤细胞中的E6/E7蛋白。
高危型人乳头瘤病毒 (HPV) 已被确认为导致宫颈癌的诱因，但90% 以上的HPV感染是一过性的，在2年内会被免疫系统清除。当HPV病毒发生持续性感染后，特别是HPV的DNA和人类宫颈上皮细胞的DNA发生整合后，E6，E7 基因会大量表达一种称为mRNA的物质，从而大量产生致癌蛋白，使人类细胞逐渐发生癌变。
目前宫颈癌的筛查方法有3类：
1.传统的形态学方法检测HPV
包括巴氏涂片细胞病理学检测、阴道镜检查、宫颈活检组织病理学检查等。宫颈细胞学筛查特异性高，但是灵敏度较低，同时花费很高。细胞出现病变前已经有HPV感染，所以必须结合其他方法。
2.HPV DNA 的检测
以上已经提到高危型HPV 的持续感染时宫颈癌的直接病因，在细胞学筛查正常前，HPVDNA 的检测很重要。目前应用最多的是PCR，其次是杂交捕获技术。PCR灵敏度高，可以同时诊断多个亚型，但会出现假阳性，特异性低；杂交捕获技术没有假阳性，但需要专业设备、专业人才，目前不能推广使之受到限制。
3.血清学方法和免疫学方法
主要是检测患者血清中的L1 抗体或是用抗体检测抗原。但L1 抗体在HPV 清除后几个月到1 年后都有较高的效价，所以血清中的L1 抗体的检测无法确定具体感染日期。用ELISA 检测血清中的HPV E6、E7 特异性抗体，目前在HPV16 阳性的口腔癌患者血清中可以检测到E6、E7 特异性抗体，在其他HPV 相关癌症中没有研究过。用抗体检测抗原的方法主要指免疫组化法，因为该方法的时间很长，操作繁琐。所以血清学和免疫学方法检测的应用受到限制。
以上检测HPV 的方法在宫颈癌及癌前病变筛查和癌前预报中发挥了重要作用。但是有一个共同的局限性：操作程序复杂、需要专业的仪器设备、成本高，不易推广。因此建立一种简单快速的检测方法迫在眉睫。
发明内容
本申请提供一种抗HPV16型E7蛋白的单克隆抗体、检测试纸和检测试剂盒，可简单快速地检测出HPV型E7蛋白。
根据本申请的第一方面，本申请提供一种抗HPV16型E7蛋白的单克隆抗体，其与HPV16型E7蛋白结合位点是：HPV16型E7蛋白第30-36氨基酸、HPV16型E7蛋白第36-43氨基酸、HPV16型E7蛋白第62-73氨基酸或HPV16型E7蛋白第73-77氨基酸。
根据本申请的第二方面，本申请提供一种HPV16型E7蛋白的检测试纸，包括背衬以及固定于背衬上的样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫；结合垫贴合固定于样品垫下方，NC膜的一端贴合固定于结合垫下方，另一端与吸水垫相连；所述NC膜上喷涂有检测抗体，所述检测抗体包括权利要求1所述的抗HPV16型E7蛋白的单克隆抗体和羊抗鼠二抗，所述的抗HPV16型E7蛋白的单克隆抗体用作检测线，所述羊抗鼠二抗用作质控线；所述结合垫上包被有荧光微球标记抗体。
优选的，所述NC膜上检测抗体的包被量为0.05～0.5μg，所述结合垫上荧光微球标记抗体的包被量为0.05～0.5μg。
优选的，所述荧光微球标记抗体为上述抗HPV16型E7蛋白的单克隆抗体。
优选的，所述荧光微球标记抗体通过如下方法制备获得：用活化液替换微球原有保存液；加入EDC和Sulfo-NHS进行活化：称取一定量的EDC和Sulfo-NHS，溶解后加入微球溶液中旋转反应15-20min；去除未反应或残余的反应物；用反应液超声重悬微球，然后加入一定量的待标记蛋白，避光反应1-4小时；去除未偶联的蛋白；封闭微球上未偶联的反应基团：用封闭液反应0.5-1小时或用封闭液重复进行去除未偶联的蛋白操作；用保存液重悬微球至原体积，2-8 ℃保存备用。
根据本申请的第三方面，本申请提供一种HPV16型E7蛋白的检测试纸的制备方法，包括如下本步骤：使用点膜仪将上述抗HPV16型E7蛋白的单克隆抗体及羊抗鼠二抗喷涂在NC 膜上, 分别作为检测线与质控线, 经36-38℃干燥箱干燥过夜；同时将荧光微球标记抗体喷涂在结合垫上，常温下真空干燥2 h；将NC膜、结合垫、样品垫、吸水垫及背衬组装好后,切割成试纸条, 加干燥剂于4~ 30℃密封保存。
根据本申请的第四方面，本申请提供一种HPV16型E7蛋白的检测试剂盒，包括盒体以及设置在盒体内的上述的HPV16型E7蛋白的检测试纸。
根据本申请的第五方面，本申请提供一种使用上述检测试剂盒的HPV16型E7蛋白的检测方法，包括如下步骤：制备人体宫颈脱落细胞裂解液，获取待检测的人体宫颈脱落细胞样本，加入所述裂解液中，涡旋震荡1-5min，放入冰箱冻融1-3次，再次震荡1-5min，离心5-10min，收集上清，加入到所述检测试剂盒中，并将检测试剂盒置于荧光检测仪孵育仓；荧光检测仪自动检测，读取检测试剂盒上的发光值；荧光检测仪依据所述发光值确定样本中HPV16型E7蛋白含量，当HPV16型E7蛋白含量大于预定值时，确定样本中HPV16型E7蛋白呈阳性，否则，确定样本中HPV16型E7蛋白呈阴性。
优选的，制备人体宫颈脱落细胞裂解液的过程包括如下步骤：用1mM-100mM 缓冲液配置体积百分比为0.1%-5%的表面活性剂；用之前加入终浓度为0.1mM-1mM蛋白酶抑制剂；所述的表面活性剂为Tween 20、Triton-100和十二烷基磺酸钠中的至少一种，所述的缓冲液为硼酸盐溶液、Tris-HCL或碳酸盐溶液，所述的蛋白酶抑制剂为PMSF和Antipain中的至少一种。
优选的，所述预定值为7.3ng/ml。
本申请的有益效果是，样本加入到样本垫后，经层析作用，HPV16型E7蛋白先后与荧光微球标记抗体和检测抗体结合，最后用配套的荧光检测仪检测荧光信号，由于荧光信号与E7蛋白含量呈正相关，由此实现对人体宫颈脱落细胞中的HPV16型E7蛋白的定量检测。相比于原有检测方法，该方法无需操作人员进行繁多的操作程序，更加简单、快捷。本发明直接检测高危型HPV16型E7致癌蛋白的表达量，从而对于高危型HPV的感染程度有了精准的判断，方便了后续的治疗。
附图说明
图1为本申请一种实施例的HPV16型E7蛋白的检测试纸的结构示意图；
图2为本申请一种实施例的HPV16型E7蛋白的检测试剂盒的结构示意图；
图3为本申请一种实施例的通过拟合法得到的HPV16型E7蛋白的标准曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。
本申请实施例提供一种抗HPV16型E7蛋白的单克隆抗体，其与HPV16型E7蛋白具有如下结合位点：HPV16型E7蛋白第30-36氨基酸、HPV16型E7蛋白第36-43氨基酸、HPV16型E7蛋白第62-73氨基酸或HPV16型E7蛋白第73-77氨基酸，该抗体与HPV16型E7蛋白特异结合。
本申请实施例提供一种HPV16型E7蛋白的检测试纸，如图1所示，其包括背衬1以及固定于背衬1上的样品垫2、结合垫3、NC膜4和吸水垫5。其中，样品垫2用于放置待检测样品，结合垫3贴合固定于样品垫1下方，NC膜4用于发生免疫反应，其一端贴合固定于结合垫3下方，另一端与吸水垫5相连。在所述NC膜4上喷涂有检测抗体，所述检测抗体包括上述的抗HPV16型E7蛋白的单克隆抗体和羊抗鼠二抗，所述抗HPV16型E7蛋白的单克隆抗体用作检测线41，所述羊抗鼠二抗用作质控线42。在所述结合垫3上包被有荧光微球标记抗体。在使用时，将待检测样品滴加到样品垫2，待检测样品将沿图中的层析方向，依次经过样品垫2、结合垫3、NC膜4，并在NC膜上发生免疫反应。从而可在检测线41和质控线42上观察到相应的反应结果。
具体的，为了保证反应的充分进行，使反应结果可见，所述NC膜4上检测抗体的包被量为0.05～0.5μg，所述结合垫5上荧光微球标记抗体的包被量为0.05～0.5μg。且所述荧光微球标记抗体为上述的抗HPV16型E7蛋白的单克隆抗体。
在一种实施例中，所述荧光微球标记抗体通过如下方法制备获得：用活化液替换微球原有保存液：依次进行离心、去上清和活化液超声重悬操作；加入EDC和Sulfo-NHS进行活化：称取一定量的EDC和Sulfo-NHS，溶解后加入微球溶液中旋转反应15-20min；去除未反应或残余的反应物：依次进行离心、去上清和活化液超声重悬操作；用反应液超声重悬微球，然后加入一定量的待标记蛋白，避光反应1-4小时；去除未偶联的蛋白：依次进行离心、去上清和活化液超声重悬操作；封闭微球上未偶联的反应基团：用封闭液反应0.5-1小时或用封闭液重复进行去除未偶联的蛋白操作；用保存液重悬微球至原体积，2-8 ℃保存备用。
本申请实施例提供一种HPV16型E7蛋白的检测试纸的制备方法，包括如下本步骤：使用点膜仪将上述的抗HPV16型E7蛋白的单克隆抗体及羊抗鼠二抗喷涂在NC 膜上, 分别作为检测线与质控线, 经36-38℃干燥箱干燥过夜；同时将荧光微球标记抗体喷涂在结合垫上，常温下真空干燥2 h；将NC膜、结合垫、样品垫、吸水垫及背衬按照上述的检测试纸的结构组装粘贴好后, 切割成试纸条, 加干燥剂于4~ 30℃密封保存。
具体的，上述的点膜仪可以是Bio-Dot XYZ3000型点膜仪，或者其他型号的点膜仪。NC膜的干燥温度可以选用近似人体体温的37℃。结合垫的干燥温度可以选用30℃左右的常温。
本申请实施例提供一种HPV16型E7蛋白的检测试剂盒，如图2所示，包括100盒体以及设置在盒体100内的上述的HPV16型E7蛋白的检测试纸。所述盒体100的表面在样品垫2的上方开设有采样口101，待检测样品通过采样口101加入到样品垫2上。所述盒体100的表面在检测线41与质控线42上方开设有观察口102，通过该观察口102可观察到NC垫上的反应结果。
该HPV16型E7蛋白的检测试剂盒的制作过程可参考HPV16型E7蛋白的检测试纸的制备方法，先制作HPV16型E7蛋白的检测试剂盒的盒体，再制作HPV16型E7蛋白的检测试纸，再将检测试纸与盒体结合起来。
本申请实施例还提供一种使用上述检测试剂盒的HPV16型E7蛋白的检测方法，包括如下步骤：制备人体宫颈脱落细胞裂解液，获取待检测的人体宫颈脱落细胞样本，加入所述裂解液中，涡旋震荡1-5min，放入冰箱冻融1-3次，冰箱的温度可以在-20℃左右，再次震荡1-5min，以10000rpm的速度离心5-10min，收集上清，加入到所述检测试剂盒中，并将检测试剂盒置于荧光检测仪孵育仓；荧光检测仪自动检测，读取检测试剂盒上的发光值；荧光检测仪依据所述发光值确定样本中HPV16型E7蛋白含量，当HPV16型E7蛋白含量大于预定值时，确定样本中HPV16型E7蛋白呈阳性，否则，确定样本中HPV16型E7蛋白呈阴性。
其中，在将待检测的样本加入到所述检测试剂盒之前，还应将检测试纸抽出，并在室温下放置10-20min，具体可以是15min。从而使试纸做好反应准备，以提升检测的准确性。在检测过程中，需要使用大量检测试剂盒，每个检测试剂盒中可加入100ul的待检测样品，加入样品后的检测试剂盒均放置在荧光检测仪，从而可以一次性检测多个样品，提升检测效率。
HPV16型E7蛋白会被荧光微球标记抗体标记，从而发出一定的荧光，荧光检测仪可自动检测其发出荧光的发光值。具体的，如图3所示，荧光检测仪中的内部程序，自动以校准品浓度为横坐标，发光值为纵坐标，采用四参数逻辑拟合法得到HPV16型E7蛋白含量的标准曲线方程，再根据标准曲线方程计算待检样本中HPV16型E7蛋白含量。检测结果的判读如下表：
即设定的预定值为7.37.3ng/ml。当然，结合到实际情况时，该预定值会在7.3ng/ml上下产生合理的波动，本领域技术人员应理解。
在一种实施例中，制备人体宫颈脱落细胞裂解液的过程包括如下步骤：用10mM~1M缓冲液配置0.05%~1%（体积百分比）表面活性剂；用之前加入终浓度为1mM~10mM蛋白酶抑制剂；所述的表面活性剂为Tween 20、Triton-100和十二烷基磺酸钠中的至少一种，所述的缓冲液为phosphate-buffered saline、Tris-HCL或碳酸盐溶液，所述的蛋白酶抑制剂为cystatin、PMSF和Antipain中的至少一种。
用本发明检测试剂盒检测部分健康人以及病人宫颈脱落细胞，检测正常人宫颈脱落细胞数据结果如下：
检测病人宫颈脱落细胞数据结果如下：
数据分析
1、根据正常人检测值，计算出平均值，标准方差，Cut-off值。分别将 41例正常人宫颈脱落细胞检测结果取平均数， 并计算标准方差SD，本试剂盒在确定Cutoff值时选择正常人平均值加上两倍的标准方差作为HPV16 E7蛋白表达阴阳性的判断标准，结果如下：
Cut-off 计算公式为 ： cut-off= 平均值+2*SD 标准方差，检测数据表一统计结果：
平均值 3.03
SD 标准方差 2.15
Cut-off 7.33ng/ml
2、通过Cut-off 值，判断待检样本HPV 16 E7蛋白表达的阴阳性，超过这个Cut-off 值的即认为是阳性，即认为表达了HPV 16 E7蛋白，同时与病理资料对比。
3、根据Cut-off值判断表二病人宫颈脱落细胞诊断结果 (“+”表示检测结果阳性；“-”表示检测结果阴性）
根据上表病人宫颈脱落细胞诊断结果阴阳性制定准确率比例表：
在表2实验中所检测的病人宫颈脱落细胞共计12例，该试剂盒 HPV 16 E7蛋白检测结果为阳性的为9例。其中针对8例CIN II以上病例样本，该试剂盒检测阳性结果为为7例，诊断灵敏度高达87%。
检测试剂盒的分析灵敏度
免疫层析试纸条的制备同上述实施例。①取出所需免疫层析试纸条，室温放置15min；②每孔加入100ul裂解液，共20孔，置于荧光检测仪孵育仓；③15min后，仪器自动检测，读取荧光值，计算T/(T+C)。根据标准曲线计算得到分析灵敏度为1.02ng/ml。实验结果如下表：
检测试剂盒的批间差
免疫层析试纸条的制备同上述实施例。①取出所需免疫层析试纸条，室温放置15min；②每孔分别加入100ul内部质控品，置于荧光检测仪孵育仓；③15min后，仪器自动检测，读取荧光值，计算T/(T+C)。该试剂盒的批间差<15%。数据如下：
检测试剂盒的准确性（回收实验）
免疫层析试纸条的制备同上述实施例。①取出所需免疫层析试纸条，室温放置15min；②每孔分别加入100ul样品，置于荧光检测仪孵育仓；③15min后，仪器自动检测，读取荧光值，计算T/(T+C)。根据标准曲线计算样品浓度。该试剂盒的回收率为100.5%。数据如下表：
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims (10)

1.一种抗HPV16型E7蛋白的单克隆抗体，其与HPV16型E7蛋白结合位点是：HPV16型E7蛋白第30-36氨基酸、HPV16型E7蛋白第36-43氨基酸、HPV16型E7蛋白第62-73氨基酸或HPV16型E7蛋白第73-77氨基酸。
2.一种HPV16型E7蛋白的检测试纸，其特征在于：
包括背衬以及固定于背衬上的样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫；结合垫贴合固定于样品垫下方，NC膜的一端贴合固定于结合垫下方，另一端与吸水垫相连；所述NC膜上喷涂有检测抗体，所述检测抗体包括权利要求1所述的抗HPV16型E7蛋白的单克隆抗体和羊抗鼠二抗，所述抗HPV16型E7蛋白的单克隆抗体用作检测线，所述羊抗鼠二抗用作质控线；所述结合垫上包被有荧光微球标记抗体。
3.根据权利要求2所述的检测试纸，其特征在于：
所述NC膜上检测抗体的包被量为～0.5μg，所述结合垫上荧光微球标记抗体的包被量为0.05～0.5μg[A1] 。
4.根据权利要求2所述的检测试纸，其特征在于：
所述荧光微球标记抗体为权利要求1所述的抗HPV16型E7蛋白的单克隆抗体。
5.根据权利要求2所述的检测试纸，其特征在于，所述荧光微球标记抗体通过如下方法制备获得：
用活化液替换微球原有保存液；加入EDC和Sulfo-NHS进行活化：称取一定量的EDC和Sulfo-NHS，溶解后加入微球溶液中旋转反应15-20min；去除未反应或残余的反应物；用反应液超声重悬微球，然后加入一定量的待标记蛋白，避光反应1-4小时；去除未偶联的蛋白；封闭微球上未偶联的反应基团：用封闭液反应0.5-1小时或用封闭液重复进行去除未偶联的蛋白操作；用保存液重悬微球至原体积，2-8 ℃保存备用。
6.一种HPV16型E7蛋白的检测试纸的制备方法，其特征在于，包括如下本步骤：
使用点膜仪将如权利要求1所述的抗HPV16型E7蛋白的单克隆抗体及羊抗鼠二抗喷涂在NC 膜上, 分别作为检测线与质控线, 经36-38℃干燥箱干燥过夜；同时将荧光微球标记抗体喷涂在结合垫上，常温下真空干燥2 h；将NC膜、结合垫、样品垫、吸水垫及背衬组装好后, 切割成试纸条, 加干燥剂于4~ 30℃密封保存。
7.一种HPV16型E7蛋白的检测试剂盒，其特征在于：
包括盒体以及设置在盒体内的如权利要求2-5任意一项所述的HPV16型E7蛋白的检测试纸。
8.一种使用如权利要求7所述检测试剂盒的HPV16型E7蛋白的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
制备人体宫颈脱落细胞裂解液，获取待检测的人体宫颈脱落细胞样本，加入所述裂解液中，涡旋震荡1-5min，放入冰箱冻融1-3次，再次震荡1-5min，离心5-10min，收集上清，加入到所述检测试剂盒中，并将检测试剂盒置于荧光检测仪孵育仓；
荧光检测仪自动检测，读取检测试剂盒上的发光值；
荧光检测仪依据所述发光值确定样本中HPV16型E7蛋白含量，当HPV16型E7蛋白含量大于预定值时，确定样本中HPV16型E7蛋白呈阳性，否则，确定样本中HPV16型E7蛋白呈阴性。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：
制备人体宫颈脱落细胞裂解液的过程包括如下步骤：用1mM-100mM 缓冲液配置体积百分比为0.1%-5%的表面活性剂；用之前加入终浓度为0.1mM-1mM蛋白酶抑制剂；所述的表面活性剂为Tween 20、Triton-100和十二烷基磺酸钠中的至少一种，所述的缓冲液为硼酸盐溶液、Tris-HCL或碳酸盐溶液，所述的蛋白酶抑制剂为PMSF和Antipain中的至少一种。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：
所述预定值为7.3ng/ml，这两个的包被量，贵方提供的是0.1ug，建议还是提供一个范围值，否则就只能保护0.1ug这一个量，范围太小。
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