CN115779155A - 一种抗菌引导骨再生膜及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗菌引导骨再生膜及其制备方法和应用。所述方法：将胶原蛋白膜在多巴胺溶液中浸泡，再置于包含三氯甲烷与三乙胺的混合液中并加入2‑溴代异丁酰溴反应，得到GBR‑Br膜；用水将甲基丙烯酸‑2‑羟乙酯和配位剂混匀后加入GBR‑Br膜、卤化亚铜催化剂和卤化铜稳定剂反应，得到GBR‑HEMA膜；用三氯甲烷将重铬酸吡啶盐和乙酸酐混合均匀后加入GBR‑HEMA膜反应，然后加入多肽溶液反应，再加入还原剂反应，得到GBR‑RGD膜；将GBR‑RGD膜铺展开并加入抗菌药物溶液反应，得到抗菌引导骨再生膜。本发明中的抗菌引导骨再生膜具有智能抗菌性，在明显降低感染风险下能加速骨骼愈合，可以提升治疗效果。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，尤其涉及一种抗菌引导骨再生膜及其制备方法和应用。
背景技术
在过去的几十年中，在创伤、骨质疏松、关节和脊柱疾病以及整形外科等领域，对骨科植入物和医疗设备的需求呈现爆炸式增长。然而，骨科植入体相关感染是临床植入性医疗设备最严重的并发症之一。对于复杂的开放性骨折固定术，感染率高达30％。许多种类的细菌都可以在植入物表面定植，其中大部分病原体是葡萄球菌，约占骨科植入物感染的70％。植入体相关性感染一旦发生，全身性的抗生素治疗可能达不到效果，并且需要将种植体去除进行局部清创，给患者带来身体和经济上的负担。因此，尽早地杀灭病原细菌对于最大程度地降低感染风险至关重要。临床上，常见的是将抗菌药物与植入物进行物理吸附，但这种方式降低病原体感染风险的效果却不明显。
此外，现有的植入物例如现有的引导骨再生膜在缺乏抗菌性能的同时，还存在促成骨功能较差、骨骼愈合速率较慢等问题。
综上，非常有必要提供一种新型的抗菌引导骨再生膜及其制备方法和应用。
发明内容
为了解决现有技术中存在的一个或者多个技术问题，本发明提供了一种抗菌引导骨再生膜及其制备方法和应用。
本发明在第一方面提供了一种抗菌引导骨再生膜的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将胶原蛋白膜在多巴胺溶液中浸泡，得到第一改性胶原蛋白膜；
(2)将第一改性胶原蛋白膜置于包含三氯甲烷与三乙胺的混合液中并加入2-溴代异丁酰溴进行反应，得到第二改性胶原蛋白膜；
(3)用水将甲基丙烯酸-2-羟乙酯和配位剂混合均匀后依次加入第二改性胶原蛋白膜、卤化亚铜催化剂和卤化铜稳定剂进行反应，得到第三改性胶原蛋白膜；
(4)用三氯甲烷将重铬酸吡啶盐和乙酸酐混合均匀后加入第三改性胶原蛋白膜进行反应，得到第四改性胶原蛋白膜；
(5)往第四改性胶原蛋白膜中加入多肽溶液进行反应，然后再加入还原剂进行反应，得到第五改性胶原蛋白膜；
(6)将第五改性胶原蛋白膜铺展开并加入抗菌药物溶液进行反应，得到抗菌引导骨再生膜。
优选地，所述制备方法还包括在步骤(6)之后，将得到的抗菌引导骨再生膜进行辊压的步骤；优选的是，所述辊压的压力为3～6MPa，所述辊压的时间为20～60s，更优选的是，所述辊压的压力为5MPa，所述辊压的时间为30s。
优选地，在步骤(1)中：所述胶原蛋白膜由胶原蛋白海绵经切割修剪、交联、清洗与干燥得到，优选的是，所述交联为在交联液中于冰浴条件下交联10～60min，所述交联液由1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和乙醇水溶液配制而成，更优选的是，所述乙醇水溶液为质量浓度为40～80％的乙醇水溶液，所述交联液中含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为2～30mmol/L；多巴胺溶液的配制为：用Tris缓冲液和无水乙醇将多巴胺混合均匀，得到含有多巴胺的浓度为0.8～1.2mg/mL的多巴胺溶液，所述Tris缓冲液与无水乙醇的用量的体积比为(70～90)：(10～30)，所述Tris缓冲液的浓度为8～15mmol/L优选为10mmol/L，pH为8～9优选为8.5；和/或所述浸泡为室温浸泡18～36h优选为24h。
优选地，在步骤(2)中：所述混合液中包含的三氯甲烷与三乙胺的体积比为(90～95)：(5～10)；所述包含三氯甲烷与三乙胺的混合液与2-溴代异丁酰溴用量的体积比为100：(5～10)；和/或先将包含三氯甲烷与三乙胺的混合液在2～6℃预冷1～3h，然后将第一改性胶原蛋白膜置于包含三氯甲烷与三乙胺的混合液中完全浸润后滴加2-溴代异丁酰溴进行反应，优选的是，所述反应为在37℃、转速为120～150r/min的条件下反应10～18h。
优选地，在步骤(3)中：所述配位剂为五甲基二乙烯三胺和/或2,2'-联吡啶；所述卤化亚铜催化剂为CuBr和/或CuCl；所述卤化铜稳定剂为CuBr2和/或CuCl2；所述甲基丙烯酸-2-羟乙酯、所述水、所述配位剂、所述卤化亚铜催化剂与卤化铜稳定剂的用量比为(40～60)mL：(80～120)mL：(0.8～1.5)mL：(650～800)mg：(60～80)mg，优选为50mL:100mL:1mL:720mg:70mg；和/或所述反应为在45～60℃、300～450r/min的条件下反应2～4h。
优选地，在步骤(4)中：所述三氯甲烷、所述重铬酸吡啶盐与所述乙酸酐的用量比为(80～120)mL：(4～6)g：(0.8～1.5)g，优选为100mL:5g:1g；和/或所述反应为在37℃、120～150r/min的条件下反应10～18h。
优选地，在步骤(5)中：所述多肽溶液中含有的多肽为RGD肽；所述多肽溶液包含Tris缓冲液和多肽，优选的是，所述Tris缓冲液与多肽的用量比为(80～120)mL：(80～120)mg优选为100mg:100mL，更优选的是，所述Tris缓冲液的浓度为8～15mmol/L优选为10mmol/L，pH为8～9优选为8.5；加入多肽溶液后在37℃、120～150r/min的条件下反应5～8h；所述还原剂为硼氢化钠；所述还原剂的用量为所述多肽溶液中含有的多肽的质量的7～10倍；和/或加入还原剂后在37℃、120～150r/min的条件下反应2～4h。
优选地，在步骤(6)中：所述抗菌药物溶液中含有的抗菌药物为替考拉宁；所述抗菌药物溶液包含Tris缓冲液和抗菌药物，优选的是，所述抗菌药物与Tris缓冲液的用量比为(80～120)mg：(15～30)mL优选为100mg:20mL，更优选的是，所述Tris缓冲液的浓度为8～15mmol/L优选为10mmol/L，pH为8～9优选为8.5；和/或所述反应为在37℃、120～150r/min的条件反应5～8h。
本发明在第二方面提供了由本发明在第一方面所述的制备方法制得的抗菌引导骨再生膜。
本发明在第三方面提供由本发明在第一方面所述的制备方法制得的抗菌引导骨再生膜作为骨修复材料的应用。
本发明与现有技术相比至少具有如下有益效果：
(1)本发明中的抗菌引导骨再生膜对抗菌药物的负载量远大于引导骨再生膜能够物理吸附抗菌药物的量，并且相比现有物理吸附抗菌药物的引导骨再生膜，本发明中的抗菌引导骨再生膜可在有炎症期，智能响应释放抗生素，即可实现在细菌触发下的响应性释放抗生素，当植入体附近有细菌感染发生时，细菌不断代谢会产生的大量有机酸，例如乳酸和碳酸，使感染微环境的pH值呈现酸性，当环境呈酸性时，本发明中的抗菌引导骨再生膜能够对细菌感染微环境做出及时准确的响应，当环境酸性较弱，炎症较轻时，可以持续稳定适量释放抗菌药物，长时间有效抑菌，而当环境酸性较强，炎症较强时，则可以快速释放抗菌药物，使得抗菌药物短时间内达到最大释放量及时抑菌，这种智能响应释放抗菌药物的方式可以明显降低感染风险。
(2)本发明中的抗菌引导骨再生膜还可以显著提高材料表面的ALP活性，促进干细胞向成骨细胞分化，是一种理想的骨科植入物材料，在可以智能有效抑制细菌附着的同时，还可以促进材料与组织之间的相互作用，可以在需要与骨骼结合的部位促进骨整合，本发明中的抗菌引导骨再生膜具有智能抗菌性、促成骨作用、促进血管生成和长期有效性等多种功能，可以在明显降低感染风险下加速骨骼愈合，可以明显提升引导骨再生膜植入材料的治疗效果。
附图说明
图1是本发明实施例1制得的GBR-RGD-TP抗菌引导骨再生膜的SEM图。
图2是本发明绘制的替考拉宁标准曲线图。
图3是本发明实施例1制得的GBR-RGD-TP抗菌引导骨再生膜的在不同pH环境下的替考拉宁释放结果图；图中，纵坐标为释放量，表示的替考拉宁释放的量占GBR-RGD-TP抗菌引导骨再生膜的质量百分含量；图中，GBR-RGD-TP-2对应的是pH＝2时的释放结果，GBR-RGD-TP-4对应的是pH＝4时的释放结果。
图4是本发明对比例1制得的GBR-TP引导骨再生膜在不同pH环境下的替考拉宁释放结果图；图中，纵坐标为释放量，表示的替考拉宁释放的量占GBR-TP引导骨再生膜的质量百分含量；图中，GBR-TP-2对应的是pH＝2时的释放结果，GBR-TP-4对应的是pH＝4时的释放结果。
图5是本发明实施例1中的GBR-RGD-TP抗菌引导骨再生膜、GBR膜以及空白对照组在7d和14d时的碱性磷酸酶活性结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明在第一方面提供了一种抗菌引导骨再生膜的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将胶原蛋白膜在多巴胺溶液中浸泡，得到第一改性胶原蛋白膜(简记为GBR-DP或GBR-DP膜)；本发明对胶原蛋白膜的来源不做具体的限定，采用市面上可以直接购买的产品或者通过现有方法制备而成均可；具体地，例如将胶原蛋白膜在多巴胺溶液中室温(例如室温15～35℃)浸泡24h，然后经清洗与干燥，得到第一改性胶原蛋白膜；
(2)将第一改性胶原蛋白膜置于包含三氯甲烷与三乙胺的混合液中并加入2-溴代异丁酰溴(BIBB)进行反应，得到第二改性胶原蛋白膜(简记为GBR-Br或GBR-Br膜)；
(3)用水将甲基丙烯酸-2-羟乙酯(HEMA)和配位剂混合均匀后依次加入第二改性胶原蛋白膜、卤化亚铜催化剂和卤化铜稳定剂进行反应，得到第三改性胶原蛋白膜(简记为GBR-HEMA或GBR-HEMA膜)；在本发明中，所述配位剂优选为五甲基二乙烯三胺(PMDETA)和/或2,2'-联吡啶(bpy)；在本发明步骤(3)中，采用卤化亚铜催化剂和卤化铜稳定剂这一催化剂稳定剂组合，可以提高反应效率，降低副反应产物；
(4)用三氯甲烷将重铬酸吡啶盐(PDC)和乙酸酐混合均匀后加入第三改性胶原蛋白膜进行反应，得到第四改性胶原蛋白膜(简记为GBR-OHEMA或GBR-OHEMA膜)；本发明发现，在本发明中，将GBR-HEMA膜经步骤(4)转变为GBR-OHEMA膜是至关重要的，若没有这一步操作，而是直接采用第三改性胶原蛋白膜与多肽溶液进行反应，这样无法形成席夫碱键，无法有效实现多肽例如RGD肽的固定与负载；
(5)往第四改性胶原蛋白膜中加入多肽溶液进行反应，然后再加入还原剂进行反应，得到第五改性胶原蛋白膜；在本发明中，优选的是，所述多肽溶液中含有的多肽为RGD肽，为了提升GBR膜的促成骨性能，优选为本发明中的抗菌引导骨再生膜复合有RGD肽，能够进一步提升GBR膜的促成骨性能，RGD肽别名H-甘氨酰-精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰-天冬酰胺酰-脯氨酸-OH，广泛存在于生物体内，能够促进成骨细胞生长，抑制破骨细胞之间及破骨细胞与基质之间的黏附，从而促进骨组织再生；在本发明中，当所述多肽溶液为RGD肽溶液时，将第五改性胶原蛋白膜简记为GBR-RGD或GBR-RGD膜；在本发明中，在步骤(5)中，加入还原剂能够还原多肽例如RGD肽与GBR-OHEMA形成的席夫碱键，使席夫碱键变成相对稳定的碳氮单键，这样可以使得多肽的负载较为牢固，不会在后续负载抗菌药物的过程出现多肽脱落的问题；而且本发明发现，而若先负载抗菌药物，则会存在后续负载多肽例如RGD肽的过程中抗菌药物会出现释放脱落的问题；
(6)将第五改性胶原蛋白膜铺展开并加入抗菌药物溶液进行反应，得到抗菌引导骨再生膜；在本发明中，优选的是，所述抗菌药物溶液中含有的抗菌药物为替考拉宁(TP)，替考拉宁可以用于金葡菌及链球菌属等敏感菌所致的严重感染，如心内膜炎、骨髓炎、败血症及呼吸道、泌尿道、皮肤、软组织等的感染，抗菌活性高，半衰期长，而且还具有较低的毒副作用，由于替考拉宁独特的作用机制，很少出现耐替考拉宁的菌株；所有对青霉素类及头孢菌素类，大环内酯类，四环素和氯霉素，氨基糖苷类和利福平耐药的革兰阳性菌，仍对替考拉宁敏感；当所述多肽溶液为RGD肽溶液且抗菌药物溶液为替考拉宁溶液时，将得到抗菌引导骨再生膜简记为GBR-RGD-TP或GBR-RGD-TP膜。
在本发明的描述中，除非另有明确的规定和限定，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”和“第五”等仅用于描述的目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性；对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
在本发明中，正是由于上述步骤(1)至步骤(5)才实现了用稳定的化学键偶联多肽(例如RGD多肽)，进而能够通过步骤(6)才实现了用酸敏感的化学键偶联了抗菌药物(例如替考拉宁)，从而赋予了本发明所述的抗菌引导骨再生膜的智能响应抗菌性能和很好的成骨性能的特性；具体地是，本发明首次通过聚多巴胺在GBR膜(引导骨再生膜)表面进行沉积，然后固定SI-ATRP引发点，引发聚合引入聚合物PHEMA，然后在温和氧化剂的作用下，将聚合物上的羟基氧化为醛基，再在还原剂(例如弱还原剂)的作用下，将具有良好成骨活性的RGD肽通过还原席夫碱的作用偶联在聚合物上，最后将例如替考拉宁等抗菌药物通过腙键也负载在聚合物上，腙键是一种酸敏感性共价键，在酸环境中，腙键会断裂，这种结构可帮助实现在细菌触发下的响应性释放抗菌药物，获得具备细菌响应性的抗菌促成骨的引导骨再生膜。
本发明中的抗菌引导骨再生膜对抗菌药物的负载量远大于引导骨再生膜能够物理吸附抗菌药物的量，并且相比现有物理吸附抗菌药物的引导骨再生膜，本发明中的抗菌引导骨再生膜可在有炎症期，智能响应释放抗生素，即可实现在细菌触发下的响应性释放抗生素，当植入体附近有细菌感染发生时，细菌不断代谢会产生的大量有机酸，例如乳酸和碳酸，使感染微环境的pH值呈现酸性，当环境呈酸性时，本发明中的抗菌引导骨再生膜能够对细菌感染微环境做出及时准确的响应，当环境酸性较弱，炎症较轻时，可以持续稳定适量释放抗菌药物，长时间有效抑菌，而当环境酸性较强，炎症较强时，则可以快速释放抗菌药物，使得抗菌药物短时间内达到最大释放量及时抑菌，这种智能响应释放抗菌药物的方式可以明显降低感染风险；本发明中的抗菌引导骨再生膜具有智能抗菌性、促成骨作用、促进血管生成和长期有效性等多种功能，可以在明显降低感染风险下加速骨骼愈合，可以明显提升引导骨再生膜植入材料的治疗效果。
根据一些优选的实施方式，所述制备方法还包括在步骤(6)之后，将得到的抗菌引导骨再生膜进行辊压的步骤；优选的是，所述辊压的压力为3～6MPa(例如3、3.5、4、4.5、5、5.5或6MPa)，所述辊压的时间为20～60s(20、35、30、35、40、45、50、55或60s)，更优选的是，所述辊压的压力为5MPa，所述辊压的时间为30s；在本发明中，优选进行所述辊压，有利于形成较为致密的抗菌引导骨再生膜，例如，如图1所示。
根据一些优选的实施方式，在步骤(1)中：所述胶原蛋白膜由胶原蛋白海绵经切割修剪、交联、清洗与干燥得到，优选的是，所述交联为在交联液中于冰浴条件下交联10～60min，所述交联液由1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和乙醇水溶液配制而成，更优选的是，所述乙醇水溶液为质量浓度(质量分数)为40～80％的乙醇水溶液，所述交联液中含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为2～30mmol/L；在一些具体的实施例中，将胶原蛋白海绵根据需要进行切割修剪，然后将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和乙醇水溶液配制成含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为20mmol/L的交联液，其中乙醇水溶液为质量浓度为70％的乙醇水溶液，将切割修剪后的胶原蛋白海绵在冰浴条件下交联30min，然后进行清洗和干燥；所述清洗为：用纯化水清洗三遍，质量浓度为70％的乙醇水溶液清洗三遍，每遍均用玻璃棒搅拌10s，而后用质量浓度为70％的乙醇水溶液浸泡过夜；所述干燥为：将清洗好的膜用多孔的不锈钢模具夹住，置于42℃鼓风干燥箱中干燥12h。
本发明对所述胶原蛋白海绵的制备没有特别的要求，例如可以通过如下的步骤制备得到：
S1、剔除牛跟腱上多余的筋膜、脂肪、肌肉等，用自来水冲洗干净，整齐的排放在冷冻盒中，进行冷冻，在-20℃至少冷冻12h；
S2、将冷冻的牛跟腱切成1mm左右的薄片，置于滤网中进行翻洗(清洗)至液体澄清；
S3、酶解：将清洗干净的牛跟腱薄片在酶解液中进行酶解，充分搅拌，酶解时间不少于72h；其中，酶解液与牛跟腱的质量比为130:1，所述酶解液由纯化水、乙酸和胃蛋白酶配制而成，在酶解液中，纯化水与乙酸的体积比为25:1，纯化水与胃蛋白酶的质量比为15:1；
S4、盐析：将酶解后的溶液离心，取其上清液，将上清液加入到氯化钠溶液(所述氯化钠溶液的质量浓度例如为0.9wt％)中，析出白色絮状胶原蛋白，过滤清洗后沥干水分；
S5、透析：将盐析后的材料灌入透析袋中，灌入体积为透析袋的1/3左右；将透析袋置于0.057mol/L的乙酸水溶液中透析液中6天，透析温度10-20℃，每3天更换一次透析液；再将透析袋置于0.00057mol/L的乙酸水溶液中透析5天，透析温度为10-20℃，每1天更换一次透析液；从第12天开始置于0.0000057mol/L的乙酸溶液中透析至pH为5.2-5.5之间，透析温度为10-20℃，根据需要可每天换一次透析液；
S6、冻干：
将透析后的样品按如下冷冻干燥工艺进行冻干，所述冷冻干燥包括预冻阶段、第一升华阶段、第二升华阶段和降温阶段，各个阶段的工艺条件如下：
预冻阶段：目标温度为-12～-8℃，速率为3～4.0℃/min，恒温时长为280～320min；
第一升华阶段：抽真空，掺气90～110Pa，目标温度为-4～-2℃，速率为0.6～0.8℃/min，恒温时长为1300～1340min；
第二升华阶段，抽真空，掺气90～110Pa，包括五个升温阶梯，分别为：
-1～1℃，速率为0.2～0.3℃/min，恒温时长为110～130min；
8～12℃，速率为1.0～1.2℃/min，恒温时长为110～130min；
18～22℃，速率为1.0～1.2℃/min，恒温时长为110～130min；
28～32℃，速率为1.0～1.2℃/min，恒温时长为110～130min；
38～42℃，速率为1.0～1.2℃/min，恒温时长：每隔10分钟进行终点判断，至终点判断合格为止；终点判断为≤0.9Pa/10min；
降温阶段：降至室温，速率为1.4～1.6℃/min；得到胶原蛋白海绵。
根据一些优选的实施方式，在步骤(1)中，多巴胺溶液的配制为：用Tris缓冲液和无水乙醇将多巴胺混合均匀，得到含有多巴胺的浓度为0.8～1.2mg/mL优选为1mg/mL的多巴胺溶液，所述Tris缓冲液与无水乙醇的用量的体积比为(70～90)：(10～30)，所述Tris缓冲液的浓度为8～15mmol/L优选为10mmol/L，pH为8～9优选为8.5，本发明对Tris缓冲液不做具体的限定，采用市面上可以直接购买的产品或者通过现有方法配制而成均可，只有使得Tris缓冲液的浓度为8～15mmol/L，pH为8～9即可；在一些具体的实施例中，所述多巴胺溶液的配制为：用体积比为80:10的Tris缓冲液与无水乙醇将多巴胺混合均匀，得到多巴胺浓度为1mg/mL的多巴胺溶液，Tris缓冲液的浓度为10mmol/L，pH＝8.5。
根据一些优选的实施方式，在步骤(1)中，所述浸泡为室温浸泡18～36h(例如18、20、22、24、26、28、30、32、34或36h)优选为24h；在一些具体的实施例中，将胶原蛋白膜在多巴胺溶液中室温浸泡24h，然后用纯化水清洗5次，超声处理3min，无水乙醇洗涤3次，再在40～42℃抽真空干燥，室温保存备用，得到第一改性胶原蛋白膜，简记为GBR-DP。
根据一些优选的实施方式，在步骤(2)中：所述混合液中包含的三氯甲烷与三乙胺的体积比为(90～95)：(5～10)；所述包含三氯甲烷与三乙胺的混合液与2-溴代异丁酰溴用量的体积比为100：(5～10)(例如100:5、100:6、100:7、100:8、100:9或100:10)；和/或先将包含三氯甲烷与三乙胺的混合液在2～6℃(例如2℃、3℃、4℃、5℃或6℃)预冷1～3h(例如1、1.5、2、2.5或3h)，然后将第一改性胶原蛋白膜置于包含三氯甲烷与三乙胺的混合液中完全浸润后滴加2-溴代异丁酰溴进行反应，优选的是，所述反应为在37℃、转速为120～150r/min的条件下反应10～18h(例如10、12、14、16或18h)。
根据一些具体的实施方式，步骤(2)为：将100mL包含三氯甲烷和三乙胺的混合液，4℃冰箱预冷2h其中，二者的体积比为三氯甲烷：三乙胺＝95:5～90:10，然后加入GBR-DP膜，待GBR-DP膜完全浸润后，往其中缓慢滴加5～10mL的2-溴代异丁酰溴(BIBB)，滴加完毕后，放入37℃恒温摇床中，120～150r/min反应过夜。反应完成后，倒出反应液，用纯化水和无水乙醇交替清洗膜多次，40～42℃抽真空干燥，室温保存备用，得到第二改性胶原蛋白膜，简记为GBR-Br。
根据一些优选的实施方式，在步骤(3)中：所述配位剂为五甲基二乙烯三胺(PMDETA)和/或2,2'-联吡啶(bpy)；所述卤化亚铜催化剂为CuBr和/或CuCl；所述卤化铜稳定剂为CuBr2和/或CuCl2；所述甲基丙烯酸-2-羟乙酯(HEMA)、所述水、所述配位剂、所述卤化亚铜催化剂与卤化铜稳定剂的用量比为(40～60)mL：(80～120)mL：(0.8～1.5)mL：(650～800)mg：(60～80)mg，优选为50mL:100mL:1mL:720mg:70mg；和/或所述反应为在45～60℃、300～450r/min的条件下反应2～4h。
根据一些具体的实施方式，步骤(3)为：在500mL锥形瓶中，加入50mLHEMA单体，100mL纯化水和1mL的PMDETA，混合均匀后加入GBR-Br膜，完全浸润后，加入720mg催化剂CuBr(或者氯化亚铜(CuCl)为催化剂)和70mg稳定剂CuBr2(或CuCl2)，置于50℃水浴锅中进行反应，设置转速为300～450r/min，反应3h。反应完成后，倒出反应液，用纯化水和无水乙醇交替清洗膜多次，40～42℃抽真空干燥，室温保存备用，得到第三改性胶原蛋白膜，简记为GBR-HEMA。
根据一些优选的实施方式，在步骤(4)中：所述三氯甲烷、所述重铬酸吡啶盐与所述乙酸酐的用量比为(80～120)mL：(4～6)g：(0.8～1.5)g，优选为100mL:5g:1g；和/或所述反应为在37℃、120～150r/min的条件下反应10～18h。
根据一些具体的实施方式，步骤(4)为：在500mL锥形瓶中，加入5g重铬酸吡啶盐(PDC)，1g的乙酸酐(Ac2O)和100mL三氯甲烷，完全溶解后，加入GBR-HEMA膜，置于37℃恒温摇床中，120～150r/min反应过夜；反应完成后，倒出反应液，用纯化水和无水乙醇交替清洗膜多次，40～42℃抽真空干燥，室温保存备用，得到第四改性胶原蛋白膜，简记为GBR-OHEMA。
根据一些优选的实施方式，在步骤(5)中：所述多肽溶液中含有的多肽为RGD肽；所述多肽溶液包含Tris缓冲液和多肽，优选的是，所述Tris缓冲液与多肽的用量比为(80～120)mL：(80～120)mg优选为100mL:100mg，更优选的是，所述Tris缓冲液的浓度为8～15mmol/L优选为10mmol/L，pH为8～9优选为8.5；加入多肽溶液后在37℃、120～150r/min的条件下反应5～8h；所述还原剂为硼氢化钠；所述还原剂的用量为所述多肽溶液中含有的多肽的质量的7～10倍；和/或加入还原剂后在37℃、120～150r/min的条件下反应2～4h优选为3h。
根据一些具体的实施方式，步骤(5)为：在500mL锥形瓶中，加入100mg多肽和100mL的浓度为10mM的Tris缓冲液(pH＝8.5)，GBR-OHEMA膜置于其中，置于37℃恒温摇床中，120～150r/min反应5～8h后，再加入800mg硼氢化钠(NaBH4)继续反应3h，反应完成后，倒出反应液，用纯化水和无水乙醇交替清洗膜多次，40～42℃抽真空干燥，室温保存备用，得到第五改性胶原蛋白膜，简记为GBR-RGD；在本发明中，加入硼氢化钠能够还原RGD与GBR-OHEMA形成的席夫碱键，使席夫碱键变成相对稳定的碳氮单键，这样可以使得RGD的负载牢固，不会在后续负载TP的过程出现RGD脱落的问题，出现RGD负载失效的问题；而且本发明发现，若先负载抗菌药物例如TP，则会存在后续负载RGD的过程中TP会出现一定程度释放脱落的问题。
根据一些优选的实施方式，在步骤(6)中：所述抗菌药物溶液中含有的抗菌药物为替考拉宁；所述抗菌药物溶液包含Tris缓冲液和抗菌药物，优选的是，所述抗菌药物与Tris缓冲液的用量比为(80～120)mg：(15～30)mL优选为100mg:20mL，更优选的是，所述Tris缓冲液的浓度为8～15mmol/L优选为10mmol/L，pH为8～9优选为8.5；和/或所述反应为在37℃、120～150r/min的条件反应5～8h。
根据一些优选的实施方式，在步骤(6)中，在进行所述反应之前，先于室温下静置2～4h(例如2、2.5、3、3.5或4h)。
根据一些具体的实施方式，步骤(6)为：在500mL锥形瓶中，加入100mg替考拉宁(Teicoplanin，TP)和20mL的10mM的Tris缓冲液(pH＝8.5)，共混均匀，得到抗菌药物溶液，将GBR-RGD膜放在合适的平底容器中，铺展开，并倒入配制的抗菌药物溶液，室温静置3h，然后再将其转移至37℃恒温摇床中，120～150r/min反应5-8h后，反应完成后，倒出反应液，用纯化水和无水乙醇交替清洗膜多次，40～42℃抽真空干燥，室温保存备用，得到具有抗菌和促进成骨作用的抗菌引导骨再生膜，GBR-RGD-TP膜。
本发明在第二方面提供了由本发明在第一方面所述的制备方法制得的抗菌引导骨再生膜。
本发明在第三方面提供了由本发明在第一方面所述的制备方法制得的抗菌引导骨再生膜作为骨修复材料的应用。
下文将通过举例的方式对本发明进行进一步的说明，但是本发明的保护范围不限于这些实施例。
实施例1
①胶原蛋白海绵的制备
S1、剔除牛跟腱上多余的筋膜、脂肪、肌肉等，用自来水冲洗干净，整齐的排放在冷冻盒中，进行冷冻，在-20℃冷冻24h；
S2、将冷冻的牛跟腱切成1mm左右的薄片，置于滤网中进行翻洗(清洗)至液体澄清；
S3、酶解：将清洗干净的牛跟腱薄片在酶解液中进行酶解，充分搅拌，酶解时间96h；其中，酶解液与牛跟腱的质量比为130:1，所述酶解液由纯化水、乙酸和胃蛋白酶配制而成，在酶解液中，纯化水与乙酸的体积比为25:1，纯化水与胃蛋白酶的质量比为15:1；
S4、盐析：将酶解后的溶液离心，取其上清液，将上清液加入到浓度为0.9wt％的氯化钠溶液中，析出白色絮状胶原蛋白，过滤清洗后沥干水分；
S5、透析：将盐析后的材料灌入透析袋中，灌入体积为透析袋的1/3左右；将透析袋置于0.057mol/L的乙酸水溶液中透析液中6天，透析温度15℃，每3天更换一次透析液；再将透析袋置于0.00057mol/L的乙酸水溶液中透析5天，透析温度为15℃，每1天更换一次透析液；从第12天开始置于0.0000057mol/L的乙酸溶液中透析至pH为5.5，透析温度为15℃，每天换一次透析液；
S6、冻干：
将透析后的样品按如下冷冻干燥工艺进行冻干，所述冷冻干燥包括预冻阶段、第一升华阶段、第二升华阶段和降温阶段，各个阶段的工艺条件如下：
预冻阶段：目标温度为-10℃，速率为3.5℃/min，恒温时长为300min；
第一升华阶段：抽真空，掺气100Pa，目标温度为-3℃，速率为0.7℃/min，恒温时长为1300min；
第二升华阶段，抽真空，掺气100Pa，包括五个升温阶梯，分别为：
0℃，速率为0.2℃/min，恒温时长为120min；
10℃，速率为1.0℃/min，恒温时长为120min；
20℃，速率为1.0℃/min，恒温时长为120min；
30℃，速率为1.0℃/min，恒温时长为120min；
40℃，速率为1.0℃/min，恒温时长：每隔10分钟进行终点判断，至终点判断合格为止；终点判断为≤0.9Pa/10min；
降温阶段：降至室温，速率为1.5℃/min；得到胶原蛋白海绵。
②胶原蛋白膜的制备：
将胶原蛋白海绵切割修剪，然后将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和乙醇水溶液配制成含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为20mmol/L的交联液，其中乙醇水溶液为质量浓度为70％的乙醇水溶液，将切割修剪后的胶原蛋白海绵在冰浴条件下交联30min，然后进行清洗和干燥；所述清洗为：用纯化水清洗三遍，质量浓度为70％的乙醇水溶液清洗三遍，每遍均用玻璃棒搅拌10s，而后用质量浓度为70％的乙醇水溶液浸泡12h；所述干燥为：将清洗好的膜用多孔的不锈钢模具夹住，置于42℃鼓风干燥箱中干燥12h，得到胶原蛋白膜，简记为GBR。
③第一改性胶原蛋白膜的制备：
将胶原蛋白膜在多巴胺溶液中室温浸泡24h，然后经纯化水和无水乙醇洗涤与40℃真空干燥，得到第一改性胶原蛋白膜，简记为GBR-DP；其中，多巴胺溶液的配制为：用体积比为80:10的Tris缓冲液与无水乙醇将多巴胺混合均匀，得到多巴胺浓度为1mg/mL的多巴胺溶液，所述Tris缓冲液的浓度为10mmol/L，pH＝8.5。
④第二改性胶原蛋白膜的制备：
将100mL包含三氯甲烷和三乙胺的混合液，在4℃冰箱预冷2h，其中三氯甲烷与三乙胺的体积比为＝90:10，然后加入GBR-DP膜，待GBR-DP膜完全浸润后，往其中缓慢滴加8mL的2-溴代异丁酰溴(BIBB)，滴加完毕后，放入37℃恒温摇床中，150r/min反应12h；反应完成后，倒出反应液，用纯化水和无水乙醇交替清洗膜多次，再在40℃真空干燥，得到第二改性胶原蛋白膜，简记为GBR-Br。
⑤第三改性胶原蛋白膜的制备：
在锥形瓶中，加入50mLHEMA单体，100mL纯化水和1mL的五甲基二乙烯三胺(PMDETA)，混合均匀后加入GBR-Br膜，完全浸润后，加入720mg CuBr和70mg稳定剂CuBr2，置于50℃水浴锅中进行反应，设置转速为400r/min，反应3h；反应完成后，倒出反应液，用纯化水和无水乙醇交替清洗膜多次，40℃真空干燥，得到第三改性胶原蛋白膜，简记为GBR-HEMA。
⑥第四改性胶原蛋白膜的制备：
在锥形瓶中，加入5g重铬酸吡啶盐，1g的乙酸酐和100mL三氯甲烷，完全溶解后，加入GBR-HEMA膜，置于37℃恒温摇床中，150r/min反应12h；反应完成后，倒出反应液，用纯化水和无水乙醇交替清洗膜多次，40℃真空干燥，得到第四改性胶原蛋白膜，简记为GBR-OHEMA。
⑦第五改性胶原蛋白膜的制备(负载RGD)：
在锥形瓶中，加入100mg RGD肽和100mL的浓度为10mM的Tris缓冲液(pH＝8.5)，将GBR-OHEMA膜置于其中，置于37℃恒温摇床中，150r/min反应6h后，再加入800mg硼氢化钠(NaBH4)，继续在37℃恒温摇床中、150r/min反应3h，反应完成后，倒出反应液，用纯化水和无水乙醇交替清洗膜多次，40℃真空干燥，得到第五改性胶原蛋白膜，简记为GBR-RGD。
⑧抗菌引导骨再生膜的制备(负载TP)：
在锥形瓶中，加入100mg替考拉宁(Teicoplanin，TP)和20mL的10mM的Tris缓冲液(pH＝8.5)，共混均匀，得到抗菌药物溶液，将GBR-RGD膜放在平底容器中，铺展开，并倒入配制的抗菌药物溶液，室温静置3h，然后再将其转移至37℃恒温摇床中，150r/min反应6h，反应完成后，倒出反应液，用纯化水和无水乙醇交替清洗膜多次，40℃真空干燥，最后在5MPa压力下辊压30s，得到抗菌引导骨再生膜，GBR-RGD-TP膜。
对比例1
①与实施例1的步骤①相同。
②与实施例1的步骤②相同。
③在锥形瓶中，加入100mg替考拉宁(Teicoplanin，TP)和20mL的10mM的Tris缓冲液(pH＝8.5)，共混均匀，得到抗菌药物溶液，将步骤②得到的GBR膜放在平底容器中，铺展开，并倒入配制的抗菌药物溶液，室温静置3h，然后再将其转移至37℃恒温摇床中，150r/min吸附6h，吸附完成后，倒出抗菌药物溶液，用纯化水清洗膜三次，40℃真空干燥，最后在5MPa压力下辊压30s，得到GBR-TP膜(简记为GBR-TP)。
对比例2
①与实施例1的步骤①相同。
②与实施例1的步骤②相同。
③与实施例1的步骤③相同。
④与实施例1的步骤④相同。
⑤与实施例1的步骤⑤相同。
⑥与实施例1的步骤⑥相同。
⑦在锥形瓶中，加入100mg RGD肽和100mL的浓度为10mM的Tris缓冲液(pH＝8.5)，将GBR-OHEMA膜置于其中，置于37℃恒温摇床中，150r/min反应6h后，反应完成，倒出反应液，用纯化水和无水乙醇交替清洗膜多次，40℃真空干燥，得到第五改性胶原蛋白膜。
⑧在锥形瓶中，加入100mg替考拉宁(Teicoplanin，TP)和20mL的10mM的Tris缓冲液(pH＝8.5)，共混均匀，得到抗菌药物溶液，将第五改性胶原蛋白膜放在平底容器中，铺展开，并倒入配制的抗菌药物溶液，室温静置3h，然后再将其转移至37℃恒温摇床中，150r/min反应6h，反应完成后，倒出反应液，用纯化水和无水乙醇交替清洗膜多次，40℃真空干燥，最后在5MPa压力下辊压30s，得到抗菌引导骨再生膜。
本发明发现，本对比例形成的抗菌引导骨再生膜上负载的RGD在负载TP的过程中易脱落。
对比例3
①与实施例1的步骤①相同。
②与实施例1的步骤②相同。
③与实施例1的步骤③相同。
④与实施例1的步骤④相同。
⑤与实施例1的步骤⑤相同。
⑥与实施例1的步骤⑥相同。
⑦在锥形瓶中，加入100mg替考拉宁(Teicoplanin，TP)和20mL的10mM的Tris缓冲液(pH＝8.5)，共混均匀，得到抗菌药物溶液，将GBR-OHEMA膜放在平底容器中，铺展开，并倒入配制的抗菌药物溶液，室温静置3h，然后再将其转移至37℃恒温摇床中，150r/min反应6h，反应完成后，倒出反应液，用纯化水和无水乙醇交替清洗膜多次，40℃真空干燥，得到第五改性胶原蛋白膜。
⑧在锥形瓶中，加入100mg RGD肽和100mL的浓度为10mM的Tris缓冲液(pH＝8.5)，将第五改性胶原蛋白膜置于其中，置于37℃恒温摇床中，150r/min反应6h后，再加入800mg硼氢化钠(NaBH4)，继续在37℃恒温摇床中、150r/min反应3h，反应完成后，倒出反应液，用纯化水和无水乙醇交替清洗膜多次，40℃真空干燥，最后在5MPa压力下辊压30s，得到抗菌引导骨再生膜。
本发明发现，本对比例先负载抗菌药物TP的方式，存在后续负载RGD的过程中TP出现被洗脱释放的问题。
对比例4
①与实施例1的步骤①相同。
②与实施例1的步骤②相同。
③与实施例1的步骤③相同。
④将8mmolγ-聚谷氨酸加入到20mL蒸馏水中，待完全溶解后添加5mmol的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和1.5mmol N-羟基琥珀酰亚胺，200r/min搅拌25min，再加入4mmol左旋多巴，并且在冰浴条件下800r/min快速搅拌10小时，搅拌过程中调节pH值为5.0，然后在室温下搅拌12h。反应结束后，除去多余的左旋多巴、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，收集纯化液并调节pH值为7.5，真空冷冻干燥，得到γ-聚谷氨酸/左旋多巴凝胶微球；将γ-聚谷氨酸/左旋多巴凝胶微球转移至模具中，加入预先配置好的抗菌药物浸泡30h，然后在47℃下保持8h，得到功能化凝胶；其中，抗菌药物溶液的配制为：将100mg替考拉宁(Teicoplanin，TP)和20mL的10mM的Tris缓冲液(pH＝8.5)，共混均匀，得到抗菌药物溶液。
⑤将步骤④所制得的功能化凝胶倾倒在步骤③所得的第一改性胶原蛋白膜上，真空冷冻干燥，得到抗菌引导骨再生膜。
本发明对实施例以及各对比例制得的抗菌引导骨再生膜的释放性能进行了测试：首先用PBS缓冲液(pH＝7.4)配制浓度为0mg/mL、0.03mg/mL、0.06mg/mL、0.09mg/mL、0.12mg/mL、0.15mg/mL、0.18mg/mL、0.21mg/mL、0.24mg/mL、0.27mg/mL、0.30mg/mL的替考拉宁标准溶液，用紫外分光光度计测试标准溶液在254nm处的吸光度，绘制标准曲线，绘制的替考拉宁标准曲线图，如图2所示；分别裁取2cm×2cm的实施例以及各对比例得到的抗菌引导骨再生膜置于10mL的离心管中，分别加入5mL pH＝2、pH＝4的PBS缓冲液中，管口密封后置于在37℃摇床中以50r/min的转速摇动，预先设置8个时间点(8h，24h，48h，72h，96h，120h，144h，168h)，每个时间点取出500μL的PBS缓冲液，然后再重新加入500μL的新的相应pH的PBS缓冲液，根据吸光度值及标准曲线公式计算出替考拉宁的浓度，并换算成替考拉宁占抗菌引导骨再生膜的质量百分含量，记作释放量，比如本发明实施例1以及对比例1制得的抗菌引导骨再生膜的释放结果图分别如图3和图4所示；从图3和图4的结果可以看出，实施例1中化学键合的替考拉宁量(最大释放量1.96％也即对应的是最大吸附量为1.96％)远远大于对比例1中物理吸附的量(最大释放量0.025％)，并且对于对比例1中GBR-TP膜而言，环境的pH对替考拉宁的释放无明显影响，48h基本达到最大释放值，而对于化学键合的实施例1中的GBR-RGD-TP膜，当pH＝2时，环境酸性较强，在48h时基本将材料负载的替考拉宁完全释放，当pH＝4时，替拉考宁可进行缓慢释放，在168h即7d时才会达到最大释放量；图3和图4的结果说明物理吸附不仅不牢固而且效率低，而本发明通过在GBR膜表面引入合适聚合物后，聚合物表面有大量的反应位点和空间，负载量可以高达1.96％；本发明通过对对比例3制得的抗菌引导骨再生膜绘制相同的释放结果图的方式可以得到对应的替考拉宁最大释放量(最大负载量)以及达到最大负载量的时间点结果，结果如表1所示。
表1
本发明对GBR膜(即采用实施例1中步骤①和步骤②得到的胶原蛋白膜)、实施例1中的GBR-RGD-TP和对比例1中的GBR-TP膜的抑菌性能进行了测试。
抗菌活性检测(抑菌圈法)：抗菌活性测试在营养琼脂(NA)培养基中进行，将样品切成直径12mm的圆片状。灭菌后，将圆片分别置于含有约105CFU/mL的金色葡萄球菌琼脂平板上，于37±1℃孵育24h，测量了圆片周围形成的抑菌圈的边缘距大小，单位为mm；抗菌实验结束后，用生理盐水清洗材料3次，加入新鲜的菌液，继续于37±1℃培养24h，如此循环抗菌，每次实验记作一轮，结果如表2所示；在本发明中，该边缘距大小指的是形成的抑菌圈的半径与圆片的半径之差。
表2
由表2的结果可知，GBR材料不具备抗菌效果，没有形成抗菌圈，GBR-TP是物理吸附，负载量少，基本不具备明显的抑菌效果，GBR-RGD-TP周围形成明显的抑菌圈，且能循环多次长时有效抑菌，这是因为细菌增殖会在培养基表面形成微酸环境，材料表面的腙键在酸性条件下易断裂，因此释放出替考拉宁杀死周围的细菌，形成明显的抑菌圈，且在循环测试时，能循环多次刺激释放替考拉宁有效抑菌。
本发明对实施例以及各对比例方法制得的抗菌引导骨再生膜的成骨活性进行了检测，通过ALP检测技术定量分析了相同尺寸的不同抗菌引导骨再生膜表面上人骨髓间充质干细胞在7d和14d时的碱性磷酸酶活性，结果如表3所示。本发明还给出了实施例1中的GBR-RGD-TP抗菌引导骨再生膜、GBR膜(即采用实施例1中步骤①和步骤②得到的胶原蛋白膜)以及空白对照组(空白对照组在孔板中进行，没有放置任何引导骨再生膜)在7d和14d时的碱性磷酸酶活性结果图，如图5所示；从图5可以看出，本发明实施例1的GBR-RGD-TP膜表面负载GRD肽进行功能化构建后，可以显著提高材料表面的ALP活性，促进干细胞向成骨细胞分化；特别说明的是，在早期成骨过程中，细胞分泌的碱性磷酸酶(ALP)活性可以反映细胞的成骨分化水平，ALP活性越高，说明细胞的成骨分化水平越高。
表3
本发明未详细说明部分为本领域技术人员公知技术。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种抗菌引导骨再生膜的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将胶原蛋白膜在多巴胺溶液中浸泡，得到第一改性胶原蛋白膜；
(2)将第一改性胶原蛋白膜置于包含三氯甲烷与三乙胺的混合液中并加入2-溴代异丁酰溴进行反应，得到第二改性胶原蛋白膜；
(3)用水将甲基丙烯酸-2-羟乙酯和配位剂混合均匀后依次加入第二改性胶原蛋白膜、卤化亚铜催化剂和卤化铜稳定剂进行反应，得到第三改性胶原蛋白膜；
(4)用三氯甲烷将重铬酸吡啶盐和乙酸酐混合均匀后加入第三改性胶原蛋白膜进行反应，得到第四改性胶原蛋白膜；
(5)往第四改性胶原蛋白膜中加入多肽溶液进行反应，然后再加入还原剂进行反应，得到第五改性胶原蛋白膜；
(6)将第五改性胶原蛋白膜铺展开并加入抗菌药物溶液进行反应，得到抗菌引导骨再生膜。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述方法还包括在步骤(6)之后，将得到的抗菌引导骨再生膜进行辊压的步骤；
优选的是，所述辊压的压力为3～6MPa，所述辊压的时间为20～60s，更优选的是，所述辊压的压力为5MPa，所述辊压的时间为30s。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中：
所述胶原蛋白膜由胶原蛋白海绵经切割修剪、交联、清洗与干燥得到，优选的是，所述交联为在交联液中于冰浴条件下交联10～60min，所述交联液由1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和乙醇水溶液配制而成，更优选的是，所述乙醇水溶液为质量浓度为40～80％的乙醇水溶液，所述交联液中含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为2～30mmol/L；
多巴胺溶液的配制为：用Tris缓冲液和无水乙醇将多巴胺混合均匀，得到含有多巴胺的浓度为0.8～1.2mg/mL的多巴胺溶液，所述Tris缓冲液与无水乙醇的用量的体积比为(70～90)：(10～30)，所述Tris缓冲液的浓度为8～15mmol/L优选为10mmol/L，pH为8～9优选为8.5；和/或
所述浸泡为室温浸泡18～36h优选为24h。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中：
所述混合液中包含的三氯甲烷与三乙胺的体积比为(90～95)：(5～10)；
所述包含三氯甲烷与三乙胺的混合液与2-溴代异丁酰溴用量的体积比为100：(5～10)；和/或
先将包含三氯甲烷与三乙胺的混合液在2～6℃预冷1～3h，然后将第一改性胶原蛋白膜置于包含三氯甲烷与三乙胺的混合液中完全浸润后滴加2-溴代异丁酰溴进行反应，优选的是，所述反应为在37℃、转速为120～150r/min的条件下反应10～18h。
5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中：
所述配位剂为五甲基二乙烯三胺和/或2,2'-联吡啶；
所述卤化亚铜催化剂为CuBr和/或CuCl；
所述卤化铜稳定剂为CuBr2和/或CuCl2；
所述甲基丙烯酸-2-羟乙酯、所述水、所述配位剂、所述卤化亚铜催化剂与卤化铜稳定剂的用量比为(40～60)mL：(80～120)mL：(0.8～1.5)mL：(650～800)mg：(60～80)mg，优选为50mL:100mL:1mL:720mg:70mg；和/或
所述反应为在45～60℃、300～450r/min的条件下反应2～4h。
6.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中：
所述三氯甲烷、所述重铬酸吡啶盐与所述乙酸酐的用量比为(80～120)mL：(4～6)g：(0.8～1.5)g，优选为100mL:5g:1g；和/或
所述反应为在37℃、120～150r/min的条件下反应10～18h。
7.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，在步骤(5)中：
所述多肽溶液中含有的多肽为RGD肽；
所述多肽溶液包含Tris缓冲液和多肽，优选的是，所述Tris缓冲液与多肽的用量比为(80～120)mL：(80～120)mg优选为100mL:100mg，更优选的是，所述Tris缓冲液的浓度为8～15mmol/L优选为10mmol/L，pH为8～9优选为8.5；
加入多肽溶液后在37℃、120～150r/min的条件下反应5～8h；
所述还原剂为硼氢化钠；
所述还原剂的用量为所述多肽溶液中含有的多肽的质量的7～10倍；和/或
加入还原剂后在37℃、120～150r/min的条件下反应2～4h。
8.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，在步骤(6)中：
所述抗菌药物溶液中含有的抗菌药物为替考拉宁；
所述抗菌药物溶液包含Tris缓冲液和抗菌药物，优选的是，所述抗菌药物与Tris缓冲液的用量比为(80～120)mg：(15～30)mL优选为100mg:20mL，更优选的是，所述Tris缓冲液的浓度为8～15mmol/L优选为10mmol/L，pH为8～9优选为8.5；和/或
所述反应为在37℃、120～150r/min的条件反应5～8h。
9.由权利要求1至8中任一项所述的制备方法制得的抗菌引导骨再生膜。
10.由权利要求1至8中任一项所述的制备方法制得的抗菌引导骨再生膜作为骨修复材料的应用。
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|---|---|---|---|
| CN202211405152.0A CN115779155B (zh) | 2022-11-10 | 2022-11-10 | 一种抗菌引导骨再生膜及其制备方法和应用 |
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Citations (5)
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|---|---|---|---|---|
| US20110305898A1 (en) * | 2010-06-09 | 2011-12-15 | Zheng Zhang | Non-fouling, anti-microbial, anti-thrombogenic graft compositions |
| CN102731789A (zh) * | 2012-07-11 | 2012-10-17 | 常州大学 | 一种表面亲水性硅橡胶的制备方法 |
| KR101816297B1 (ko) * | 2016-08-19 | 2018-01-08 | 강원대학교 산학협력단 | 표면개질된 나노피브릴, 그 제조방법 및 그의 용도 |
| EP3385340A1 (en) * | 2017-04-07 | 2018-10-10 | NovioSense B.V. | Coating for implantable medical device |
| CN112626856A (zh) * | 2020-12-18 | 2021-04-09 | 临泉县圣茂纺织品有限公司 | 一种亲水性聚丙烯无纺布及其制备方法 |
-
2022
- 2022-11-10 CN CN202211405152.0A patent/CN115779155B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110305898A1 (en) * | 2010-06-09 | 2011-12-15 | Zheng Zhang | Non-fouling, anti-microbial, anti-thrombogenic graft compositions |
| CN102731789A (zh) * | 2012-07-11 | 2012-10-17 | 常州大学 | 一种表面亲水性硅橡胶的制备方法 |
| KR101816297B1 (ko) * | 2016-08-19 | 2018-01-08 | 강원대학교 산학협력단 | 표면개질된 나노피브릴, 그 제조방법 및 그의 용도 |
| EP3385340A1 (en) * | 2017-04-07 | 2018-10-10 | NovioSense B.V. | Coating for implantable medical device |
| CN112626856A (zh) * | 2020-12-18 | 2021-04-09 | 临泉县圣茂纺织品有限公司 | 一种亲水性聚丙烯无纺布及其制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 杨万泰;李春燕;: "ATRP表面接枝在功能膜制备中的应用", 膜科学与技术, no. 03, pages 110 - 117 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115779155B (zh) | 2023-12-26 |
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