CN115779140A - 含有胶原蛋白的伤口敷料及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种含有胶原蛋白的伤口敷料，该敷料由A液和B液混合后成型得到，其中A液含有苯并咪唑季铵盐改性硅油和胶原蛋白，B液含有磷钨酸，在皮肤表面同时施加两者后，能够形成透明薄膜，该薄膜敷料兼顾良好的自愈合性能和力学性能，可以延长敷料的使用时间和寿命，覆盖胶原蛋白的经皮作用时间，同时能够持续稳定的释放Ⅲ型胶原蛋白。

Description

含有胶原蛋白的伤口敷料及制备方法

技术领域

本发明属于合成生物医学材料技术领域，具体涉及含有胶原蛋白的伤口敷料及制备方法。

背景技术

重组人源Ⅲ型胶原蛋白被广泛应用于人体创口修复，其可以外源性地给予皮肤补充胶原蛋白，连接皮肤因创伤和感染造成的皮肤纤维断裂，抑制黑色素生成，抑制瘢痕，加速皮肤愈合。目前市售的含有胶原蛋白的敷料多为凝胶型，凝胶型敷料具有以下缺点：力学强度低、作用时间短，由于胶原蛋白是一个生物大分子，透皮效率较低，皮肤难以吸收，最多起到保湿作用，难以发挥治疗作用；另外，其不具有缓释性，持续稳定的释放重组人源Ⅲ型胶原蛋白能够避免I型胶原蛋白过度沉积或排列紊乱，从而避免病理性于瘢痕的产生。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种含有胶原蛋白的伤口敷料，该敷料由A液和B液混合后成型得到，其中A液含有苯并咪唑季铵盐改性硅油和胶原蛋白，B液含有磷钨酸，在皮肤表面同时施加两者后，能够形成透明薄膜，该薄膜敷料兼顾良好的自愈合性能和力学性能，可以延长敷料的使用时间和寿命，覆盖胶原蛋白的经皮作用时间，同时能够持续稳定的释放Ⅲ型胶原蛋白。

本发明的技术方案如下：

一种含有胶原蛋白的伤口敷料，由A液和B液混合后交联而成；所述A液包括以下组分：苯并咪唑季铵盐改性硅油、Ⅲ型重组人源胶原蛋白、保湿剂、水；所述B液包括以下组分：磷钨酸、三乙醇胺、水。

所述苯并咪唑季铵盐改性硅油具有如下分子结构：

式中，m与n取正整数；R选自

、

中的一种；X选自Br、Cl中的一种。

所述苯并咪唑季铵盐改性硅油的制备方法如下：

在四甲基氢氧化铵催化下，以六甲基二硅氧烷(MM)为封端剂，四甲基四乙烯基环四硅氧烷(DV 4)和八甲基环四硅氧烷(D4)开环聚合制备乙烯基硅油(PVMS)；

在二甲苯中，3-溴丙酸与N1-(3-(二甲氨基)丙基)苯-1,2-二胺在氮气环境下酰化反应，进一步升温进行环化反应制备中间体a；

在醇溶液中，中间体a与硫氢化钠反应制备2-（1-(二甲氨基)丙基-1H-苯并咪唑-2-基)-1-乙硫醇（BSH），具有如下式（II）分子结构：

以安息香二甲醚(DMPA)为催化剂，在紫外光照射下，PVMS与BSH发生巯基-乙烯基点击反应，制备PDMS-g-BSH，具有如下分子结构：

式中，m和n取正整数。

所述BSH的投料量为PVMS的乙烯基摩尔量的1.5~2倍；所述DMPA的投料量为PVMS的乙烯基摩尔量的0.3倍。

在溶剂中，PDMS-g-BSH与卤代化合物进行季铵化反应，制备苯并咪唑季铵盐改性硅油。

所述卤代化合物选自3-溴丙酸或3-氯丙酰胺。

本发明还提供上述含有胶原蛋白的伤口敷料的制备方法，包括如下步骤：

4）配置A液：将苯并咪唑季铵盐改性硅油加入到去离子水中高速搅拌，形成溶液，再加入胶原蛋白、保湿剂、氯化钠、蔗糖搅拌均匀。

5）配置B液：将磷钨酸加入到去离子水中高速搅拌，形成溶液，在加入三乙醇胺调节PH值至6.5~7.5。

6）分别将两种溶液灌装进高压喷雾器内，喷雾器采用丁烷作为推进剂。

A液包括：20~30%苯并咪唑季铵盐改性硅油、0.1~0.15%重组人源Ⅲ型胶原蛋白、0.3%甘油、0.15%氯化钠、0.1%蔗糖，余量为水；

B液包括：2~4%磷钨酸、1~2%三乙醇胺，余量为水。

本发明还提供上述含有胶原蛋白的伤口敷料的实施方式，包括如下步骤：先将A液喷于伤口表面，立马再将B液喷于伤口表面，静置晾干5~10min，即可在伤口表面形成一层薄膜敷料。

有益效果：

1.本发明利用不同化学结构的季铵盐离子与杂多酸之间的静电作用力大小不同制备得到弹性体敷料，其中键强较大的交联键（C-N+与杂多酸阴离子）构成稳定的交联网络，而键强较小的交联键（C=N+与杂多酸阴离子）作为应力的耗散点，并且在一定的外部刺激下可逆成键，从而实现自愈合，延长敷料的使用寿命。

2.本发明利用苯并咪唑季铵盐改性硅油上的季铵盐与磷钨酸通过静电作用力结合，同时发挥了季铵盐与磷钨酸的协同抗菌作用，防止伤口细菌、真菌感染。

3.生物安全性实验表明，本发明的敷料皮肤刺激性和细胞毒性较小。

附图说明

图1为PIL-1和磷钨酸及其两者的混合物的FT-IR谱图。

图2为实施例2制备得到的敷料薄膜。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1

在装有分水器和冷凝管的三口烧瓶中，加入3-溴丙酸（50.05g）、N1-(3-(二甲氨基)丙基)苯-1,2-二胺（75.82g）和500 mL二甲苯，通入氮气，在140℃下回流酰化反应12h，分水器不断分离出水；继续升温至200℃进行环化反应，5h后结束反应。在100℃下减压蒸馏出低沸点物质后，用丙酮重结晶，真空干燥得到中间体a。

称取中间体a（62.74g）和硫氢化钠水合物（17g）放入单口烧瓶中，加入300mL甲醇，常温下搅拌反应24h，反应溶液过滤后在80℃下旋蒸至干燥，加入300mL二氯甲烷和200mL去离子水，继续搅拌3h，静置分液，取有机相干燥得到BSH。

1H-NMR（CDCl3）:2.54（m,2,(CH3)2N-CH2-CH2）、2.25（s,6,(CH3)2N）、2.82~2.86（m,4,S-CH2CH2）、3.18（t,2,(CH3)2N-CH2）、4.15（t,2,(CH3)2N-CH2CH2CH2）、7.20~7.34（m,4,Ar-H）。

按投料比向单口烧瓶中放入DV 4（23.21g）、D4（100.05g）、MM（2.19g）和四甲基氢氧化铵（D4质量0.2%），在90℃下搅拌反应9h后，升温至150℃搅拌1h以高温分解催化剂，得到的粗产物在150℃下减压蒸馏以去除未参与反应的原料得到PVMS。

数均分子量（Mn）采用Waters 515-2414型凝胶渗透色谱仪测定，流动相为氯仿，流速为 1 mL/min，检测器温度为35℃，柱温为 40℃，标样为窄分布的聚苯乙烯（PS），Mn=11244g/mol。

1H-NMR（CDCl3）计算得到的乙烯基含量为2.17mmol/g。

称量PVMS（70.25g）、BSH（52.19g）、DMPA（11.74g）溶于400mL四氢呋喃中，并加入至石英反应瓶中，开启365nm的紫外光灯，照射下室温反应2h，结束反应，减压蒸馏得到的粗产物用氯仿重新溶解，用甲醇和水（V:V=1:1）的混合溶剂萃取3遍，取有机相挥发溶剂得到的淡黄色油状物，为PDMS-g-BSH。

将上述得到的PDMS-g-BSH放入装有冷凝管的反应瓶中，并加入卤代化合物和甲苯溶解，升温至80℃后保温回流反应48h，反应结束后旋蒸除去溶剂，在去离子水中透析3d，得到苯并咪唑季铵盐改性硅油（PIL）。

实施例2

一种含有胶原蛋白的伤口敷料，包括A液和B液。

A液包括：30%苯并咪唑季铵盐改性硅油PIL-1、0.15%重组人源Ⅲ型胶原蛋白、0.3%甘油、0.15%氯化钠、0.1%蔗糖，余量为水；

B液包括：3%磷钨酸、1.8%三乙醇胺，余量为水。

重组人源III型胶原蛋白原液购于华北生物制药有限公司。

实施例3

一种含有胶原蛋白的伤口敷料，包括A液和B液。

A液包括：30%苯并咪唑季铵盐改性硅油PIL-2、0.15%重组人源Ⅲ型胶原蛋白、0.3%甘油、0.15%氯化钠、0.1%蔗糖，余量为水；

B液包括：3%磷钨酸、1.8%三乙醇胺，余量为水。

实施例4

一种含有胶原蛋白的伤口敷料，包括A液和B液。

A液包括：20%苯并咪唑季铵盐改性硅油PIL-2、0.15%重组人源Ⅲ型胶原蛋白、0.3%甘油、0.15%氯化钠、0.1%蔗糖，余量为水；

B液包括：2%磷钨酸、1.2%三乙醇胺，余量为水。

实施例5

一种含有胶原蛋白的伤口敷料，包括A液和B液。

A液包括：30%苯并咪唑季铵盐改性硅油PIL-2、0.15%重组人源Ⅲ型胶原蛋白、0.3%甘油、0.15%氯化钠、0.1%蔗糖，余量为水；

B液包括：4%磷钨酸、2%三乙醇胺，余量为水。

对比例1

一种含有胶原蛋白的伤口敷料，包括A液和B液。

A液包括：30%改性硅油1、0.15%重组人源Ⅲ型胶原蛋白、0.3%甘油、0.15%氯化钠、0.1%蔗糖，余量为水；

B液包括：3%磷钨酸、1.8%三乙醇胺，余量为水。

所述改性硅油1制备方法如下：

在装有分水器和冷凝管的三口烧瓶中，加入3-溴丙酸（10.23g）、N-甲基-1,2-苯二胺（9.8g）和200mL二甲苯，通入氮气，在140℃下回流酰化反应10h，分水器不断分离出水；继续升温至200℃进行环化反应，5h后结束反应。在100℃下减压蒸馏出低沸点物质后，用丙酮重结晶，真空干燥得到中间体1。

称取中间体1（8.89g）和硫氢化钠水合物（4g）放入单口烧瓶中，加入200mL甲醇，常温下搅拌反应24h，反应溶液过滤后在80℃下旋蒸至干燥，加入200mL二氯甲烷和200mL去离子水，继续搅拌3h，静置分液，取有机相干燥得到单体1，具有如下结构：

称量PVMS（10.11g）、单体1（5.84g）、DMPA（1.68g）溶于400mL四氢呋喃中，并加入至石英反应瓶中，开启365nm的紫外光灯，照射下室温反应2h，结束反应，减压蒸馏得到的粗产物用氯仿重新溶解，用甲醇和水（V:V=1:1）的混合溶剂萃取3遍，取有机相挥发溶剂得到的淡黄色油状物，为N-甲基苯并咪唑改性硅油。

将上述得到的N-甲基苯并咪唑改性硅油（11.28g）放入装有冷凝管的反应瓶中，并加入3-氯丙酰胺（7.44g）和甲苯（200mL）溶解，升温至80℃后保温回流反应48h，反应结束后旋蒸除去溶剂，在去离子水中透析3d，得到改性硅油1。

对比例2

一种含有胶原蛋白的伤口敷料，包括A液和B液。

A液包括：30%改性硅油2、0.15%重组人源Ⅲ型胶原蛋白、0.3%甘油、0.15%氯化钠、0.1%蔗糖，余量为水；

B液包括：3%磷钨酸、1.8%三乙醇胺，余量为水。

所述改性硅油2制备方法如下：

按照专利CN115317656A制备部分接枝叔胺基硅油，接枝率为18.4%，分子量为9141g/mol。

将部分接枝叔胺基硅油（11.44g）放入装有冷凝管的反应瓶中，并加入3-氯丙酰胺（7.42g）和甲苯（200mL）溶解，升温至80℃后保温回流反应48h，反应结束后旋蒸除去溶剂，在去离子水中透析3d，得到改性硅油2。

对比例3

一种含有胶原蛋白的伤口敷料，包括A液和B液。

A液包括：30%改性硅油3、0.15%重组人源Ⅲ型胶原蛋白、0.3%甘油、0.15%氯化钠、0.1%蔗糖，余量为水；

B液包括：3%磷钨酸、1.8%三乙醇胺，余量为水。

所述改性硅油3制备方法如下：

将PDMS-g-BSH放入装有冷凝管的反应瓶中，并加入盐酸和乙醇溶解，升温至60℃后保温回流反应48h，反应结束后旋蒸除去溶剂，在去离子水中透析3d，得到改性硅油3。

测试例1

PIL-1和PIL-1与磷钨酸混合后的红外谱图见附图1，从图中可以看见磷钨酸的特征峰为804cm-1（vas W-Oc-W）、888cm-1（vas W-Ob-W）、987cm-1（vas W-Od）、1084cm-1（vasP-Oa）。PIL-1的特征峰为3061cm-1（苯环C-H外弯曲振动）、2752~2811cm-1（叔胺甲基伸缩振动）、1556cm-1、1614cm-1（芳环C=C对称伸缩振动）、1322cm-1（环C-N对称伸缩振动）。从样品1的红外谱图中可以看到，两者结合后，苯环C-H外弯曲振动由3061→3020cm-1、叔胺甲基伸缩振动也发生了红移、环C-N对称伸缩振动由1322→1351cm-1，表明两者存在相互作用力。

测试例2

使用涂抹法制样，具体如下：将实施例2~5和对比例1~3的敷料组分涂抹（多次）在疏水处理后玻璃片上，放入50℃烘箱中干燥，再用镊子撕下，控制薄膜的厚度为0.02~0.05mm，并裁成5cm×1cm的样条。

在拉伸速率为200mm/min下进行拉伸测试。

测试例3

自愈合性能测试：以恒定作用力0.5N和恒定距离-0.1μm在样条表面划痕，然后在划痕表面滴加10μL的乙醇，使其铺开，放于常温鼓风箱中吹干，随后进行拉伸测试，以修复后的拉伸强度与原始拉伸强度的比值评价自修复率。

测试例2~3的结果如表2所示。

测试例4

对制备得到的敷料薄膜中的蛋白活性进行测定。

将样条放入pH=7.4的 PBS溶液中，37℃下以100rpm的速度搅拌12h，对浸出液采用圆二色谱对比色皿中的蛋白溶液进行活性鉴定，具体方法如下：不同样品采用相近浓度（通过吸光度进行判断）的浸出液进行测试，同时配置相近浓度的重组胶原蛋白PBS溶液作为对照（本测试蛋白浓度为0.22±0.17mg/mL）；对浸出液或对照组进行远紫外CD扫描,应用dicroprot软件对色谱图进行分析得到二级结构的信息。

浸出液蛋白二级结构含量如表3所示。

在192nm、208对应的是α-螺旋片段的构像，在195、216对应β-折叠片段的构像。在200nm有较弱负吸收峰为无规则卷曲片段；205nm 为β-转角片段的构像。胶原蛋白在变性过程中会伴随着各个构像的含量变化，未变性胶原蛋白多肽链中α-螺旋结构含量在50%以上。

从表中数据可以看出，浸出液中的胶原蛋白各构像变化较少,且α-螺旋结构含量在50%以上，仍具有较高活性。

测试例5

对敷料进行抑菌活性测试：将敷料薄膜消毒后裁剪成直径15mm的圆片，放置在装有固体培养基的培养皿中央。用移液枪吸取20μL菌液（分别为：大肠杆菌、白色葡萄球菌和白色念珠菌，浓度均为1×109CFU/mL）涂布于圆片上。将培养基置于37℃培养箱中培养24h后取出，在无菌条件下移除圆片后利用打孔器取出圆片正下方直径为10mm的固体培养基，置于离心管中，并加入2000μL PBS缓冲液，超声4min后得到原菌液。将原菌液分别稀释104倍得到稀释液，分别取150μL各浓度稀释液涂布在装有固体培养基的培养皿中。将其置于37℃培养箱中培养24h后取出，观察并计数菌落数n，得出相应稀释液中细菌或真菌的个数，并按稀释倍数D推算出原菌液（2000μL）中细菌或真菌的个数N，计算公式如下：

测试例6

对敷料进行生物相容性测试：包括溶血实验和细胞毒性实验。

溶血实验：取新鲜含有枸橼酸钠抗凝剂的人血，按人血/生理盐水=5/4（w/w）的比例稀释，得到新鲜稀释抗凝人血。敷料样条消毒后并放入试管中，并向其中加入2 mL生理盐水。取一支试管为阴性对照，向其中加入2 mL生理盐水，另取一支试管为阳性对照，向其中加入2mL蒸馏水。然后将所有试管放入37℃恒温水浴中保温30 min，再向试管中加入2 mL混匀的新鲜稀释抗凝人血，轻轻混匀，置于37℃水浴中继续保温60 min。将试管中液体移入离心管中，在3000rpm速率下离心5 min，吸取上层清液，利用SMA5000型微量紫外光度计测试其在545 nm处吸光度，按以下公式计算溶血率：

式中，DS为测试样品的吸光度值，Dpc为阳性对照的吸光度，Dnc为阴性对照的吸光度。

细胞毒性测试：将消毒后的敷料样条浸入10mLRPMI 1640培养基中24 h，并用RPMI1640培养基稀释至原始浓度的50%。将L929细胞（鼠非整倍体纤维肉瘤细胞）在96孔培养板上以1.0×105细胞/mL的密度用上述RPMI 1640培养基进行培养。将细胞在37℃、CO2浓度为5 %的培养箱中培养过夜。细胞培养24h后，向孔中加入5.0 mg/mL浓度的MTT（PBS溶液），再在37℃下培养4 h。随后去除培养基，加入150μLDMSO，然后剧烈震动以溶解形成的紫色甲瓒晶体。用Wellscan Mk 3酶标仪在570 nm的波长下测量吸光度。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种含有胶原蛋白的伤口敷料，其特征在于，由A液和B液混合后交联而成；所述A液包括以下组分：苯并咪唑季铵盐改性硅油、Ⅲ型重组人源胶原蛋白、保湿剂、水；所述B液包括以下组分：磷钨酸、三乙醇胺、水；先将A液喷于伤口表面，立马再将B液喷于伤口表面，静置晾干5~10min，即可在伤口表面形成一层薄膜敷料；

所述苯并咪唑季铵盐改性硅油具有如下分子结构：

式中，m与n取正整数；R选自

、

中的一种；X选自Br、Cl中的一种。

2.根据权利要求1所述的一种含有胶原蛋白的伤口敷料，其特征在于，所述苯并咪唑季铵盐改性硅油的制备方法如下：

在四甲基氢氧化铵催化下，以六甲基二硅氧烷(MM)为封端剂，四甲基四乙烯基环四硅氧烷(DV 4)和八甲基环四硅氧烷(D₄)开环聚合制备乙烯基硅油(PVMS)；

在二甲苯中，3-溴丙酸与N1-(3-(二甲氨基)丙基)苯-1,2-二胺在氮气环境下酰化反应，进一步升温进行环化反应制备中间体a；

中间体a与硫氢化钠反应制备2-（1-(二甲氨基)丙基-1H-苯并咪唑-2-基)-1-乙硫醇（BSH）；

以安息香二甲醚(DMPA)为催化剂，在紫外光照射下，PVMS与BSH发生巯基-乙烯基点击反应，制备PDMS-g-BSH；

PDMS-g-BSH与卤代化合物进行季铵化反应，制备苯并咪唑季铵盐改性硅油；

所述卤代化合物选自3-溴丙酸或3-氯丙酰胺。

3.根据权利要求2所述的一种含有胶原蛋白的伤口敷料，其特征在于，所述BSH的投料量为PVMS的乙烯基摩尔量的1.5~2倍；所述DMPA的投料量为PVMS的乙烯基摩尔量的0.3倍。

4.根据权利要求1所述的一种含有胶原蛋白的伤口敷料，其特征在于，所述A液按质量百分比，包括以下组分：20~30%苯并咪唑季铵盐改性硅油、0.1~0.15%重组人源Ⅲ型胶原蛋白、0.3%甘油、0.15%氯化钠、0.1%蔗糖，余量为水；所述B液按质量百分比，包括以下组分：2~4%磷钨酸、1~2%三乙醇胺，余量为水。

5.据权利要求1所述的一种含有胶原蛋白的伤口敷料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）配置A液：将苯并咪唑季铵盐改性硅油加入到去离子水中高速搅拌，形成溶液，再加入胶原蛋白、保湿剂、氯化钠、蔗糖搅拌均匀；

2）配置B液：将磷钨酸加入到去离子水中高速搅拌，形成溶液，在加入三乙醇胺调节PH值至6.5~7.5；

3）分别将两种溶液灌装进高压喷雾器内，喷雾器采用丁烷作为推进剂。

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