CN112961065A - 一种可电离脂质分子及其制备方法及其在制备脂质纳米颗粒的应用 - Google Patents

一种可电离脂质分子及其制备方法及其在制备脂质纳米颗粒的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可电离脂质分子及其制备方法及其在制备脂质纳米颗粒的应用，可电离脂质分子，为如下化学结构：
Figure DDA0002936115050000011
代号XH‑04；新型可电离脂质分子XH‑04与磷脂、胆固醇、聚乙二醇通过微流控合成获得LNP，得到的LNP能提高负载物‑mRNA‑在细胞内的翻译表达水平，提高mRNA‑LNP制剂的作用效力，给予个性化mRNA‑LNP制剂的理论治疗提供了理论基础。

Description

一种可电离脂质分子及其制备方法及其在制备脂质纳米颗粒 的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是一种可电离脂质分子及其制备方法及其在制备脂质纳米颗粒的应用。
背景技术
核酸(nucleic acids，RNA)在调节体内蛋白表达方面具有巨大的治疗潜力，但裸RNA被细胞内化的效率极低，并且其在体内递送过程中容易被肾脏快速清除，或者被体内RNA酶快速降解，其实际疗效大打折扣。为了更安全有效地发挥RNA的治疗能力，科学家使用脂质纳米颗粒(LNP)来封装和传递RNA到机体特定部位。这种RNA递送策略在递送双链小干扰RNA(siRNAs，21到23个核苷酸长度)方面展现出了巨大的应用价值。比如类脂质C12-200已被广泛用于制作siRNA-LNP制剂，用于体内各种治疗应用，以抑制蛋白表达。人工合成的可电离脂质材料(synthetic ionizable lipids)和类脂质材料(lipid-like materials)出现后，不仅大大降低了LNP的体内毒性，还使得体内递送大分子量RNA(比如mRNA)成为可能。这些含胺的可电离脂质或类脂质分子带正电荷，通过静电吸引的方式，可以高效的与带负电荷的mRNA结合并自组装形成LNP。LNP能够提高RNA的血液循环时间，并提高细胞的摄取率；在细胞内RNA通过内体逃逸途径，释放到细胞质中，得以表达出特定的蛋白，起到一定的治疗作用。
LNP的原料成分主要有以下4种：1)可电离脂质或类脂质分子(如DLin-KC2-DMA、DLin-MC3-DMA、L319)。这是实现体内递送mRNA的核心成分。2)磷脂分子，是一种磷脂，它为LNP双分子层提供结构，也可能有助于核内体逃逸；3)胆固醇，增强LNP稳定性，促进膜融合；4)聚乙醇，它可以控制并减少LNP的粒径，并“保护”LNP不受免疫细胞非特异性内吞作用的影响。
在体内，LNP的原料和组分变化会对mRNA-LNP制剂的物理化学稳定性和mRNA作用效力产生深远影响。现有的LNP组分方案无法充分的发挥mRNA-LNP制剂的效力，需要持续对可电离脂质分子的结构调整并针对特定RNA进行设计优化，本发明解决这样的问题。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可电离脂质分子及其制备方法及其在制备脂质纳米颗粒的应用，通过改进可电离脂质分子的结构并对LNP组分方案的调整，提高mRNA-LNP制剂的作用效力。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种可电离脂质分子，为如下化学结构：
Figure BDA0002936115030000021
一种可电离脂质分子的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，在以DCM为溶剂混合有
Figure BDA0002936115030000022
的混合液中添加
Figure BDA0002936115030000023
DMAP和TEA；再在溶液中添加EDCI，搅拌反应；待检测显示反应完成后，经过萃取、清洗、干燥、浓缩、纯化后得到呈黄色油状的
Figure BDA0002936115030000024
步骤二，在以DM为溶剂混合有
Figure BDA0002936115030000025
的溶液中添加Cs2CO3，搅拌反应待检测显示反应完成后，经过萃取、清洗、干燥、浓缩、纯化后得到白色固体形式的
Figure BDA0002936115030000026
步骤三，在THF、乙醇和
Figure BDA0002936115030000031
的混合液中添加0℃以下的NaBH4，搅拌反应待检测显示反应完成后，经过萃取、清洗、干燥、浓缩后得到得到白色固体形式的
Figure BDA0002936115030000032
步骤四，将
Figure BDA0002936115030000033
和EDCI在吡啶溶液中搅拌反应，待检测显示反应完成后，经过萃取、清洗、干燥、浓缩、纯化后得到无色油状可电离脂质分子
Figure BDA0002936115030000034
前述的一种可电离脂质分子的制备方法，检测显示反应完成的方法为TLC硅胶板薄层色谱。
一种可电离脂质分子在制备脂质纳米颗粒的应用，包括：可电离脂质分子
Figure BDA0002936115030000035
与磷脂、胆固醇、聚乙二醇通过合成获得LNP脂质体纳米颗粒，LNP能提高负载物-mRNA-在细胞内的翻译表达水平。
前述的一种可电离脂质分子在制备脂质纳米颗粒的应用，磷脂为DSPC或者DOPE。
前述的一种可电离脂质分子在制备脂质纳米颗粒的应用，合成新型载体LNP的配方按照摩尔百分比为：
Figure BDA0002936115030000041
胆固醇：磷脂：聚乙二醇＝20-70％：20-60％：2-20％：0.1-5％。
前述的一种可电离脂质分子在制备脂质纳米颗粒的应用，合成新型载体LNP的配方按照摩尔百分比为：
Figure BDA0002936115030000042
胆固醇：DSPC：DMG-PEG2000＝31.5％：56％：10％：2.5％。
前述的一种可电离脂质分子在制备脂质纳米颗粒的应用，可电离脂质分子
Figure BDA0002936115030000043
与磷脂、胆固醇、聚乙二醇通过微流控合成方法获得LNP。
前述的一种可电离脂质分子在制备脂质纳米颗粒的应用，微流控合成方法包括如下步骤：
准备可电离脂质分子
Figure BDA0002936115030000044
与磷脂、胆固醇、聚乙二醇的混合液；
准备mRNA稀释液；
用微流控合成仪器，以及用原厂提供的微流控芯片制备LNP：一侧注射器装入mRNA稀释液，另一侧注射器装入混合液，设置参数后，重复几次，用完所有的混合液，收集所有的产物LNP溶液，并在30分钟内加入柠檬酸缓冲液稀释至溶液中乙醇比例小于0.5％。
前述的一种可电离脂质分子在制备脂质纳米颗粒的应用，微流控合成方法还包括：通过切向流过滤纯化制备得到LNP。
本发明的有益之处在于：
本发明通过改进可电离脂质分子的结构得到一种新型的可电离脂质分子，代号XH-04；
本发明通过XH-04与磷脂、胆固醇、聚乙二醇合成得到的LNP，获得的LNP具有更加优异的mRNA载体性能，可以明显提高其负载物-mRNA-在细胞内的翻译表达水平。
附图说明
图1是本发明的制备方法的一种实施例的合成流程图；
图2是本发明制备得到的XH04 LNP的冷冻电镜图片；
图3是本发明MC3-LNP(a)和XH04-LNP(b)在BHK细胞中spike protein表达水平的流式结果。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一种可电离脂质分子，化学结构式：
Figure BDA0002936115030000051
(代号：XH-04)。
以下缩写字母分别代表如下试剂：
DCM：二氯甲烷；DMAP：4-二甲氨基吡啶；TEA：三乙醇胺，EDCI：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐；TLC：硅胶板薄层色谱；THF：四氢呋喃；DMF二甲基甲酰胺；DSPC：1,2-二硬酯酸-sn-甘油磷脂酰胆碱，DOPE：1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，TFF：切向流过滤。
一种可电离脂质分子的制备方法如图1所示；具体包括如下步骤：
步骤一，向DCM二氯甲烷(100mL)中化合物1
Figure BDA0002936115030000052
(20.0g，89.6mmol，1.00当量)的溶液中添加化合物1A
Figure BDA0002936115030000053
(14.2g，98.6mmol，1.10当量)、DMAP4-二甲氨基吡啶(1.10g，8.96mmol，0.10当量)和TEA三乙醇胺(36.3g，358.6mmol，49.9mL，4.00当量)。向溶液中添加EDCI1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(22.3g，116.5mmol，1.30当量)。反应在25℃搅拌12小时。TLC硅胶板薄层色谱(石油醚：乙酸乙酯＝10:1，Rf＝0.62)显示反应完成。将反应溶液倒入H2O(100mL)中。用二氯甲烷(200ml×2)萃取溶液。用盐水(100mL)冲洗有机层。有机层用硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗产品。粗产物通过柱层析(SiO2，石油醚：乙酸乙酯＝1:0至0:1)纯化，得到呈黄色油状的化合物2
Figure BDA0002936115030000061
(22.0g，63.0mmol，70.3％)。
步骤一的反应式为：
Figure BDA0002936115030000062
步骤二：向化合物2
Figure BDA0002936115030000063
(20.0g，57.25mmol，1.00当量)和化合物2A
Figure BDA0002936115030000064
(3.95g，28.6mmol，0.50当量)在DMF二甲基甲酰胺(120mL)中的溶液中添加Cs2CO3(37.3g，114.5mmol，2.00当量)。将悬浮液在25℃搅拌6小时。TLC硅胶板薄层色谱(石油醚：乙酸乙酯＝8:1，Rf＝0.40)显示反应完成。将反应溶液倒入H2O(200mL)中。用二氯甲烷(200ml×3)萃取溶液。用盐水(100mL)冲洗有机层。有机层用硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗产品。粗产物通过柱层析(SiO2，石油醚：乙酸乙酯＝1:0至10:1)纯化，得到白色固体形式的化合物3(15.0g，22.2mmol，77.6％产率)。
步骤二的反应式为：
Figure BDA0002936115030000071
向化合物3
Figure BDA0002936115030000072
(12.0g，17.78mmol，1.00当量)在THF四氢呋喃(72mL)和EtOH乙醇(36mL)中的溶液中添加0℃下的NaBH4(739.9mg，19.6mmol，1.10当量)。添加后，将反应溶液在25℃下搅拌2小时。TLC硅胶板薄层色谱(石油醚：乙酸乙酯＝5:1，Rf＝0.20)显示反应完成。将反应溶液倒入H2O(100mL)中。用二氯甲烷(200ml×2)萃取溶液。用盐水(200ml)冲洗有机层。有机层在硫酸钠上干燥并减压浓缩，得到白色固体形式的化合物4
Figure BDA0002936115030000073
(11.8g，粗品)。
步骤三的反应式为：
Figure BDA0002936115030000074
将化合物4
Figure BDA0002936115030000075
(11.0g，16.3mmol，1.00当量)、化合物4A
Figure BDA0002936115030000076
(3.13g，18.69mmol，1.15当量，HCl)和EDCI1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(7.16g，37.4mmol，2.30当量)在吡啶(55mL)中的溶液在40℃搅拌20小时。TLC硅胶板薄层色谱(二氯甲烷：甲醇＝10:1，Rf＝0.39)显示反应完成。将反应溶液倒入饱和氯化铵溶液(60mL)中。用乙酸乙酯(120ml×3)萃取溶液。有机层用硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗产品。粗产物用硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝100:1至0:1)纯化，得到无色油状XH-04(4.00g，5.06mmol，31.2％产率)。
Figure BDA0002936115030000081
需要说明的是：以上合成步骤中反应条件的范围上下波动50％都适用于本发明，都在本发明的保护范围内。
一种可电离脂质分子在制备脂质纳米颗粒的应用，包括：可电离脂质分子
Figure BDA0002936115030000082
与磷脂、胆固醇、聚乙二醇通过通过微流控合成方法获得LNP，LNP能提高负载物-mRNA-在细胞内的翻译表达水平。作为一种优选，磷脂为DSPC(1,2-二硬酯酸-sn-甘油磷脂酰胆碱)或者DOPE(1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)，聚乙二醇，作为进一步的优选为DMG-PEG2000。需要说明的是：微流控合成方法只是一种优选，也可以是薄膜水化挤出法(thin film hydration followed by extrusion)合成LNP，这些方法都不是穷举，只要是通过本发明的XH-04合成得到LNP的方法都在本发明的保护范围内。
合成新型载体LNP的配方按照摩尔百分比为：XH-04：胆固醇：磷脂：聚乙二醇＝20-70％：20-60％：2-20％：0.1-5％。作为一种优选，合成新型载体LNP的配方按照摩尔百分比为：XH-04：胆固醇：DSPC：DMG-PEG2000＝31.5：56：10：2.5(mol％)。需要说明的是：最优配方已在以下实验得到验证，本领域技术人员可知：这个范围的摩尔百分比的配方是常见的灵活范围，都可以得到LNP，只要是通过这样的配方得到的LNP，均在本发明的保护范围内，在这里不赘述实验过程和数据。需要说明的是：不是只有XH-04、胆固醇、DSPC、DMG-PEG2000这一种组合方式，DSPC可替换成DOPE，DMG-PEG2000可以换成任何一种PEG(聚乙二醇)。
性能检测的具体步骤如下：
(1)通过切向流过滤(Tangential Flow Filtration，TFF)纯化LNP；
需要说明的是：纯化LNP的方法除了切向流过滤纯化，也可以是透析加浓缩的方法，这些方法都不是穷举，只要是能够纯化本发明的配方得到的LNP，都在本发明的保护范围内。
(2)以spike protein_mRNA作为标记mRNA，体外验证LNP递送载体的性能。
以下通过实验验证本发明的技术效果：
先制备LNP，具体过程如下：
1、准备工作液
(1)配制各组分的母液(Cholesterol胆固醇：10mg/mL,DSPC 1,2-二硬脂酰-SN-甘油-3-磷酸胆碱：10mg/mL,DMG-PEG2000 1,2-二肉豆蔻酰-RAC-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000：4mg/mL)，可电离脂质分子XH-04(10mg)。
(2)用总量1mL无水乙醇充分溶解10mg XH-04。并将XH-04与DMG-PEG2000 1,2-二肉豆蔻酰-RAC-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000、Cholesterol胆固醇置于37℃水浴锅中水浴40min；将DSPC1,2-二硬脂酰-SN-甘油-3-磷酸胆碱放置于55℃水浴锅中水浴40分钟。
(3)按照下表1所示体积，加入并充分混合预热后的各组分的母液，然后继续加入7.32mL无水乙醇稀释该混合液。继续保持37℃水浴。
Figure BDA0002936115030000091
表1
2、通过微流控合成LNP
用NanoAssemblr微流控仪器，以及用原厂提供的微流控芯片制备LNP。微流控芯片通道经清洁和预处理后，左侧注射器装入8mL超纯水，右侧注射器装入2mL的各脂质组分的混合液。仪器控制软件中参数设置如下：总液体流速16mL/min，左右侧流速比4：1，初始丢弃体积0.550mL，结束丢弃体积0.150mL。重复几次，用完全部的脂质组分混合液，收集所有的产物LNP溶液，并在30分钟内加入超纯水稀释至溶液中乙醇比例小于0.5％。
3、通过TFF超滤纯化LNP
用中空纤维超滤膜柱进行换液，除去LNP溶液中的乙醇成分，使LNP分散在超纯水中，于2-8摄氏度下保存。得到的XH04 LNP的冷冻电镜图片如图2所示。
制备包裹spike protein_mRNA的LNP并与现有LNP产品进行对比实验，具体过程如下：
Dlin-MC3-DMA阳离子脂质分子(CAS号1224606-06-7)是现有LNP产品的主要成分。本实施例使用Dlin-MC3-DMA和其它必要组分制备合成MC3-LNP产品并包裹spike protein_mRNA，作为对照。同时使用本发明所提供的可电离脂质分子XH-04替代Dlin-MC3-DMA分子，与Cholesterol胆固醇，DSPC1,2-二硬脂酰-SN-甘油-3-磷酸胆碱，DMG-PEG2000 1,2-二肉豆蔻酰-RAC-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000等组分一起合成XH04-LNP产品并包裹spikeprotein_mRNA。在体外验证XH04 LNP递送mRNA的性能。
1、准备工作液
(1)准确配制各组分的母液(Cholesterol胆固醇：10mg/mL,DSPC1,2-二硬脂酰-SN-甘油-3-磷酸胆碱：10mg/mL,DMG-PEG2000 1,2-二肉豆蔻酰-RAC-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000：4mg/mL)，可电离脂质分子XH-04或者Dlin-MC3-DMA(10mg)。
(2)用总量1mL无水乙醇充分溶解10mg XH-04(或者Dlin-MC3-DMA)。并将XH-04与DMG-PEG2000 1,2-二肉豆蔻酰-RAC-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000、Cholesterol胆固醇置于37℃水浴锅中水浴40min；将DSPC1,2-二硬脂酰-SN-甘油-3-磷酸胆碱放置于55℃水浴锅中水浴40分钟。
(3)按照下表所示体积，加入并充分混合预热后的各组分的母液，然后继续加入7.32mL无水乙醇稀释该混合液。继续保持37℃水浴。
Figure BDA0002936115030000101
(4)取507ug的spike protein_mRNA，用柠檬酸缓冲液(pH 6.0)稀释至39.37mL，置于50mL的离心管中(冰上放置)。
2、通过微流控合成LNP
用NanoAssemblr微流控合成仪器，以及用原厂提供的微流控芯片制备LNP。微流控芯片通道经清洁和预处理后，左侧注射器装入8mL的mRNA稀释液，右侧注射器装入2mL的各脂质组分的混合液。仪器控制软件中参数设置如下：总液体流速16mL/min，左右侧流速比4：1，初始丢弃体积0.550mL，结束丢弃体积0.150mL。重复几次，用完所有的脂质组分混合液，收集所有的产物LNP溶液，并在30分钟内加入柠檬酸缓冲液稀释至溶液中乙醇比例小于0.5％。
3、通过TFF超滤纯化LNP
用中空纤维超滤膜柱进行换液，除去LNP溶液中的乙醇和柠檬酸等成分，使LNP分散在制剂缓冲液中.测定并调整溶液中mRNA的浓度至10ug/mL，并将包裹有mRNA的LNP分装后于-80摄氏度下保存。
4、体外验证LNP递送载体的性能
将包裹有mRNA的LNP制剂与BHK细胞共培养72h，使用流式细胞术检测细胞内spikeprotein的表达水平。
(1)细胞复苏与传代。将BHK-21细胞复苏，于培养瓶中培养传代至所需的细胞数量。
(2)种板。将培养瓶中的细胞消化下来并计数，以每孔1万个细胞铺在96孔板中，过夜培养至细胞贴壁。
(3)加药。将96孔板中的培养基吸干，加入PBS清洗3次，然后吸干培养基中的液体。向各孔中加入200uL的LNP制剂和1800uL的培养基，于培养箱中培养至72h。
(4)收集细胞后，使用相应的一抗和荧光二抗孵育标记，用流式细胞术比较阳性细胞率。如图3所示。可以看出，使用XH04-LNP负载的mRNA在细胞内的表达效果(57.62％)远高于现有产品MC3-LNP的效率(5.77％)。
本发明提出了一种新型结构的可电离脂质分子XH-04，再通过与脂质原料配比，获得的LNP具有更加优异的mRNA载体性能，可以明显提高其负载物-mRNA-在细胞内的翻译表达水平。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种可电离脂质分子，其特征在于，为如下化学结构：
Figure FDA0002936115020000011
2.一种可电离脂质分子的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，在以DCM为溶剂混合有
Figure FDA0002936115020000012
的混合液中添加
Figure FDA0002936115020000013
DMAP和TEA；再在溶液中添加EDCI，搅拌反应；待检测显示反应完成后，经过萃取、清洗、干燥、浓缩、纯化后得到呈黄色油状的
Figure FDA0002936115020000014
步骤二，在以DM为溶剂混合有
Figure FDA0002936115020000015
的溶液中添加Cs2CO3，搅拌反应待检测显示反应完成后，经过萃取、清洗、干燥、浓缩、纯化后得到白色固体形式的
Figure FDA0002936115020000016
步骤三，在THF、乙醇和
Figure FDA0002936115020000021
的混合液中添加0℃以下的NaBH4，搅拌反应待检测显示反应完成后，经过萃取、清洗、干燥、浓缩后得到得到白色固体形式的
Figure FDA0002936115020000022
步骤四，将
Figure FDA0002936115020000023
和EDCI在吡啶溶液中搅拌反应，待检测显示反应完成后，经过萃取、清洗、干燥、浓缩、纯化后得到无色油状可电离脂质分子
Figure FDA0002936115020000024
3.根据权利要求2所述的一种可电离脂质分子的制备方法，其特征在于，检测显示反应完成的方法为TLC硅胶板薄层色谱。
4.一种可电离脂质分子在制备脂质纳米颗粒的应用，其特征在于，包括：可电离脂质分子
Figure FDA0002936115020000025
与磷脂、胆固醇、聚乙二醇通过合成获得LNP脂质体纳米颗粒，所述LNP能提高负载物-mRNA-在细胞内的翻译表达水平。
5.根据权利要求4所述的一种可电离脂质分子在制备脂质纳米颗粒的应用，其特征在于，所述磷脂为DSPC或者DOPE。
6.根据权利要求4所述的一种可电离脂质分子在制备脂质纳米颗粒的应用，其特征在于，合成新型载体LNP的配方按照摩尔百分比为：
Figure FDA0002936115020000031
胆固醇：磷脂：聚乙二醇＝20-70％：20-60％：2-20％：0.1-5％。
7.根据权利要求6所述的一种可电离脂质分子在制备脂质纳米颗粒的应用，其特征在于，合成新型载体LNP的配方按照摩尔百分比为：
Figure FDA0002936115020000032
胆固醇：DSPC：DMG-PEG2000＝31.5％：56％：10％：2.5％。
8.根据权利要求4所述的一种可电离脂质分子在制备脂质纳米颗粒的应用，其特征在于，可电离脂质分子
Figure FDA0002936115020000033
与磷脂、胆固醇、聚乙二醇通过微流控合成方法获得LNP。
9.根据权利要求8所述的一种可电离脂质分子在制备脂质纳米颗粒的应用，其特征在于，所述微流控合成方法包括如下步骤：
准备可电离脂质分子
Figure FDA0002936115020000034
与磷脂、胆固醇、聚乙二醇的混合液；
准备mRNA稀释液；
用微流控合成仪器，以及用原厂提供的微流控芯片制备LNP：一侧注射器装入mRNA稀释液，另一侧注射器装入混合液，设置参数后，重复几次，用完所有的混合液，收集所有的产物LNP溶液，并在30分钟内加入柠檬酸缓冲液稀释至溶液中乙醇比例小于0.5％。
10.根据权利要求9所述的一种可电离脂质分子在制备脂质纳米颗粒的应用，其特征在于，所述微流控合成方法还包括：通过切向流过滤纯化制备得到LNP。
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