CN115772092A

CN115772092A - 一种胺类化合物或其药学上可接受的盐及其制备和应用

Info

Publication number: CN115772092A
Application number: CN202111049811.7A
Authority: CN
Inventors: 张玉波; 代小勇; 王国才; 李药兰; 吴忠南; 陈能花; 洪刚
Original assignee: Guangzhou Jiqing Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Jiqing Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2021-09-08
Filing date: 2021-09-08
Publication date: 2023-03-10
Anticipated expiration: 2041-09-08
Also published as: CN115772092B

Abstract

本发明公开了天然药物化学技术领域的一种胺类化合物或其药学上可接受的盐及其制备和应用。该胺类化合物的分子式为C₁₂H₁₇N₂O₃，命名为pegaharoline A，具有如式I所示的化学结构。该胺类化合物属于首次发现，该化合物或其药学上可接受的盐具有明显的抗肿瘤活性，对肿瘤细胞有很好的抑制作用，尤其是对非小细胞肺癌细胞A549、PC9具有明显的增殖抑制作用、诱导凋亡作用以及对细胞迁移能力、侵袭能力的抑制作用。该胺类化合物具有制备预防或治疗肿瘤及其相关疾病的药物制剂的成药潜力，为开发抗肿瘤创新药物提供了新的物质基础。

Description

一种胺类化合物或其药学上可接受的盐及其制备和应用

技术领域

本发明属于天然药物化学技术领域，具体涉及一种胺类化合物或其药学上可接受的盐及其制备和应用。

背景技术

肺癌(Lung cancer)是全球最常见的恶性肿瘤之一，随着全球人口数量的增长和人口老龄化的增加，肺癌发生率不断增加，成为致死率最高的肿瘤。2015年世界卫生组织发布的统计数据表明，2012年全球肺癌新发病例约180万，占到全部肿瘤类型的13％。2013年中国肺癌死亡约55万例，占全球该类癌症死亡例数1/3。在我国，男性肺癌发病率和病死率均占所有恶性肿瘤的第1位，女性发病率占第2位，病死率占第1位。国家癌症中心统计，2015年中国肺癌发病例数约73万例，其中男性约51万例、女性约22万例；同年，中国死亡的肺癌病例数约61万例，其中男性约43万例、女性约18万例。肺癌发病和死亡率随着年龄增长而上升，一般40岁以后上升明显，75岁左右达到高峰，然后有所下降。

非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC)是一种常见的肺部恶性肿瘤，指的是肺部组织内细胞生长失去控制的疾病，这种细胞生长可能会造成转移，就是侵入相邻的组织和渗透到肺部以外。非小细胞肺癌约占肺癌总数的80-85％，它是一种异质性肿瘤，可进一步分为鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌。绝大多数非小细胞肺癌起源于支气管粘膜上皮。NSCLC大部分患者确诊时已是晚期。局部晚期、身体状况好的NSCLC患者经一系列化疗、放疗和(或)手术治疗能达到8个月的无病生存(disease-free survival，DFS)期，5年生存率＜15％。因此寻找新的有效治疗药物是十分必要的。

骆驼蓬子为蒺藜科(Zygophyllaceae)骆驼蓬属(Peganum)植物骆驼蓬(PeganumharmalaL.)的干燥成熟种子。其种子呈三棱状、肾形，褐色，为骆驼蓬属植物常见的药用部位之一。其味辛、苦，性平，有毒，归心、肝、肺三经，具有宣肺气、止咳平喘、祛风湿、消肿毒的功效。该植物全球分布广泛，主要分布于亚洲、欧洲、北非等地，在国内主要分布于新疆、内蒙古、陕西、甘肃、宁夏等地区。该植物含有生物碱、甾体、黄酮、蒽醌、氨基酸等成分，其中该植物种子部位含有丰富的生物碱成分，主要包括β-咔波啉(β-carboline)和喹唑啉(quinazoline)这两种类型。同时，其生物碱部位是该植物发挥药理作用的主要活性成分。市面上一些以骆驼蓬子为原料之一的市售制剂也对治疗相应疾病发挥着相应的疗效，如以骆驼蓬子、天仙子、秋水仙为主要原料的复方骆驼蓬子软膏具有治疗疥疮、坐骨神经痛、风湿性关节炎等疾病的疗效；以骆驼蓬子、菊苣子、芹菜根、菊苣根、香青兰子、黑种草子、茴香根皮、洋甘菊、甘草、香茅、罗勒子、蜀葵子、茴芹果为主要成份的复方木尼孜其颗粒具有治疗胆囊炎和肝炎疾病的疗效；以骆驼蓬子、雪莲、西红花、卡哇维琴、布牙乌热克等为主要成份的雪莲泡脚舒能改善微循环，对脚癣、脚气、脚汗有很好疗效。当前研究主要集中在β-咔波啉类生物碱和喹唑啉类生物碱的研究，未发现从骆驼蓬子中分离到胺类化合物。

发明内容

为了解决现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种胺类化合物或其药学上可接受的盐及其制备和应用。具体技术方案如下：

本发明第一方面提供一种胺类化合物及其药学上可接受的盐，所述胺类化合物的分子式为C₁₂H₁₇N₂O₃，命名为pegaharoline A，具有如式I所示的化学结构：

本发明第二方面提供一种胺类化合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)粉碎后的干燥骆驼蓬子药材进行85％～95％乙醇提取，优选为95％乙醇，得到总提取物；

(2)将所得浸膏分散于水中，调节pH到2～4，加入氯仿萃取，弃去有机层，得到水层；

(3)调节所得水层pH到7.5～9，加入氯仿萃取，保留氯仿层，即得到总生物碱；

(4)将总生物碱上样于非极性树脂，依次用30％、50％、75％和95％浓度乙醇/水体系洗脱，得到30％、50％、75％和95％乙醇/水体系洗脱部位；

(5)所得95％乙醇/水部位经硅胶柱层析，以氯仿/甲醇为流动相从100:0至0:100梯度洗脱分离，经TLC检视合并，得到了7个馏分Fr.A-G；

(6)Fr.F馏分以体积比为10:90，20:80，30:70，50:50，100:0的甲醇/水为流动相，经硅胶柱层析分离，经TLC检视合并，到Fr.F1-5五个子馏分；

(7)Fr.F5由凝胶Sephadex LH-20分离，进一步经制备型高效液相色谱纯化，得到胺类化合物pegaharoline A。

进一步地，85％～95％乙醇的用量为骆驼蓬子药材的8～10倍量，优选为10倍量；

所述非极性树脂为D101大孔树脂；

所述凝胶Sephadex LH-20的流动相为体积比2:1的氯仿/甲醇；

所述制备型高效液相色谱的流动相为体积比70:30:0.01的甲醇/水/氨水。

本发明第三方面提供所述胺类化合物和/或其药学上可接受的盐，或所述制备方法制备的胺类化合物和/或其药学上可接受的盐在制备预防或治疗肿瘤的药物中的应用。

进一步地，所述肿瘤为肺癌；优选地，所述肿瘤为非小细胞肺癌。更优选地，所述肿瘤细胞为非小细胞肺癌细胞A549或PC9。

本发明第四方面提供一种预防或治疗肿瘤的药物制剂，包含所述胺类化合物和/或其药学上可接受的盐，或所述制备方法制备的胺类化合物和/或其药学上可接受的盐。

进一步地，所述药物制剂进一步包括治疗有效量的至少一种其他治疗剂或其组合物；

优选地，所述其他治疗剂或其组合物选自任意的具有抗肿瘤活性的物质或其组合物。

进一步地，所述药物制剂还包括药学上可接受的辅料。

优选地，所述药学上可接受的辅料选自淀粉、乳糖、微晶纤维素、糊精、磷酸钙、聚乙二醇-4000、聚乙二醇-6000、羧甲基纤维素钠、羟丙纤维素或交联聚维酮中的一种以上。

进一步地，所述药物制剂的剂型包括片剂、胶囊剂、滴丸或颗粒剂。这些制剂较为方便服用，能单独或者搭配其他药剂服用，通过内服能将药性通过血液快速输送至病症部位进行有效治疗。

本发明的有益效果是：

1、本发明提供的胺类化合物不属于现有已分离的生物碱类化合物，属于首次发现，该化合物及其药学上可接受的盐具有明显的抗肿瘤活性，对肿瘤细胞有很好的抑制作用，尤其是对非小细胞肺癌细胞A549、PC9具有明显的增殖抑制作用、诱导凋亡作用以及对细胞迁移能力、侵袭能力的抑制作用。该胺类化合物具有制备预防或治疗肿瘤及其相关疾病的药物制剂的成药潜力，为开发抗肿瘤创新药物提供了新的物质基础，具有潜在且巨大的社会效益和经济效益。本发明提供的化合物可为新型抗肿瘤药物的开发提供物质基础，有利于中药材骆驼蓬子药用价值的进一步开发，为非小细胞肺癌等提供有效的治疗小分子药物。

2、本发明提供的胺类化合物制备方法简单、成本低、污染小、成药经济效益好，有利于节能减排条件下的大规模生产，产业化前景好。

3、本发明的胺类化合物还具有祛风除湿、舒筋活血等功效，可用于风湿性关节炎、跌打损伤、瘀积肿痛、产后风瘫等症，可以在用于预防或治疗肿瘤的同时起到治疗其他合并症的效果。

附图说明

图1为化合物pegaharoline A化学结构式；

图2为化合物pegaharoline A的分子编号；

图3为化合物pegaharoline A的高分辨质谱；

图4为化合物pegaharoline A的紫外光谱；

图5为化合物pegaharoline A的外红光谱；

图6为化合物pegaharoline A的核磁共振¹H谱；

图7为化合物pegaharoline A的核磁共振¹³C谱；

图8为化合物pegaharoline A的核磁共振DEPT-135谱；

图9为化合物pegaharoline A的核磁共振¹H-¹H COSY谱；

图10为化合物pegaharoline A的核磁共振HSQC谱；

图11为化合物pegaharoline A的核磁共振HMBC谱；

图12为化合物pegaharoline A的核磁共振NOESY谱；

图13为化合物pegaharoline A对非小细胞肺癌细胞A549、PC9增殖的影响作用；A，化合物pegaharoline A在不同作用时间下对非小细胞肺癌细胞A549增殖影响；B，化合物pegaharoline A在不同作用时间下对非小细胞肺癌细胞PC9增殖影响；

图14为化合物pegaharoline A对非小细胞肺癌细胞A549凋亡影响作用；A，化合物pegaharoline A对非小细胞肺癌细胞A549凋亡影响；B，凋亡统计；

图15为化合物pegaharoline A对非小细胞肺癌细胞A549迁移和侵袭的影响作用；A，化合物pegaharoline A对非小细胞肺癌细胞A549迁移和侵袭影响；B，迁移统计；C，侵袭统计；

图16为化合物pegaharoline A对非小细胞肺癌细胞A549克隆形成的影响作用；A，化合物pegaharoline A对非小细胞肺癌细胞A549克隆形成影响；B，克隆统计；

图17为化合物pegaharoline A对非小细胞肺癌细胞A549血管形成的影响作用；A，化合物pegaharoline A对HUVEC细胞血管形成影响；B，血管长度统计；C，血管百分比统计；C，血管连接长度统计。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。

实施例1

将干燥的30kg骆驼蓬子药材粉碎，常温下用95％乙醇(300L)冷浸提取得浸膏3.2kg。将所得浸膏分散于水(10L)中，用1％的盐酸调PH到3，并加入氯仿(5L)，充分萃取后弃去有机层。剩下的水层用2％的氨水调pH到8，再用氯仿(5L)萃取，保留氯仿层得骆驼蓬总碱(969g)。将总碱经D101大孔树脂柱层析，以乙醇/水为流动相体系洗脱，得到30％、50％、75％和95％四个浓度乙醇/水体系洗脱得到的部位，分别为275g、288g、176g和97g。将洗脱下来的95％乙醇/水部位经硅胶柱层析，以氯仿/甲醇为流动相从100:0至0:100梯度洗脱分离，根据TLC检视进行合并，得到了7个馏分(Fr.A-G)。Fr.F(15.8g)馏分以甲醇/水(10:90,20:80,30:70,50:50,100:0；v/v)为流动相经硅胶柱层析分离，根据TLC检视进行合并，得到Fr.F1-5五个子馏分，Fr.F5(2.2g)由凝胶Sephadex LH-20(氯仿/甲醇；2:1；v/v)分离，进一步经制备型HPLC(甲醇/水/氨水；70:30:0.01；v/v/v)纯化得到化合物pegaharoline A，化合物结构如图1所示。化合物pegaharoline A的分子编号如图2所示。

二维核磁共振谱的数据及结合关系见表1。

结构鉴定依据：

化合物pegaharoline A的结构，通过分析高分辨质谱(HRESIMS)、红外光谱(IR)及核磁共振谱(NMR)推测得到。

图3为化合物pegaharoline A的高分辨质谱，图4为化合物pegaharoline A的紫外光谱(溶于甲醇)，图5为化合物pegaharoline A的外红光谱(KBr压片)，图6为化合物pegaharoline A的核磁共振¹H谱(600MHz，溶于DMSO-d₆)，图7为化合物pegaharoline A的核磁共振¹³C谱(150MHz，溶于DMSO-d₆)，图8为化合物pegaharoline A的核磁共振DEPT-135谱(150MHz，溶于DMSO-d₆)，图9为化合物pegaharoline A的核磁共振¹H-¹H COSY谱(溶于DMSO-d₆)，图10为化合物pegaharoline A的核磁共振HSQC谱(溶于DMSO-d₆)，图11为化合物pegaharoline A的核磁共振HMBC谱(溶于DMSO-d₆)，图12为化合物pegaharoline A的核磁共振NOESY谱(溶于DMSO-d₆)。

用高分辨质谱HRESIMS:m/z测定分子量237.1233[M+H]⁺(理论值：237.1234)，显示分子式为C₁₂H₁₇N₂O₃。

用红外光谱法，测定结果数据显示存在氨基(3406cm^-1)和苯环(1616和1468cm^-1)。

核磁共振氢谱(¹HNMR)的数据及归属，见表1。数据显示：δ_H 7.64(1H,d,J＝9.0Hz),6.24(1H,d,J＝2.4Hz),6.14(1H,dd,J＝9.0,2.4Hz)的吸收峰说明有一个AMX系统的苯环；δ_H 3.32(2H,t,J＝6.8Hz),2.98(2H,t,J＝6.8Hz)的吸收峰说明有一个-CH₂CH₂-耦合片段；δ_H 3.73(3H,s)的吸收峰说明有一个甲氧基；δ_H 1.77(3H,s)的吸收峰说明有一个甲基；δ_H7.89(1H,t,J＝5.0Hz)的吸收峰说明有一个亚氨基；δ_H 7.34(2H,br s)的吸收峰说明有一个氨基。

根据核磁共振碳谱(¹³C NMR)的数据及归属，见表1。数据显示有12个碳信号：δ_C198.4and 169.3显示有两个羰基信号；δ_C 163.8,153.6,133.3,111.3,103.6,98.5显示有六个苯环碳信号；δ_C 38.1and 34.9显示有两个亚甲基碳信号；δ_C 55.0显示有一个甲氧基碳信号；δ_C 22.6显示有一个甲基碳信号。

表1.NMRdataof1(DMSO-d₆,600MHz for ¹H,150MHz for ¹³C,δinppm,Jin Hz)

本发明通过实验例1-5验证化合物pegaharoline A在抗肿瘤方面的效果。实验例1-5中，培养细胞的培养基为DMEM加10％FBS，在说明书附图中化合物pegaharoline A记为PA。

实验例1：化合物pegaharoline A可以显著抑制非小细胞肺癌细胞A549、PC9的增殖

1.将非小细胞肺癌细胞A549，PC9以5×10³个/孔接种于96孔细胞培养板中，每孔培养基体积为200μl，在37℃含有5％二氧化碳的培养箱中培养24h，然后饥饿过夜；

2.加入不同浓度梯度(100μM，50μM，25μM，12.5μM，6.25μM，3.125μM)的化合物分别培养24h、48h、72h；

3.每孔加入20μl的MTT工作溶液，继续放入二氧化碳培养箱中培养4h；

4.弃培养板中的上清，加入150μl DMSO(二甲基亚砜)，震荡10min，在酶标仪上选择490nm波长进行检测，绘制细胞的生长曲线。结果如图13。

图13显示，不同浓度的化合物pegaharoline A可以显著抑制非小细胞肺癌细胞A549、PC9的增殖，并且随着作用时间的增加，化合物pegaharoline A抑制非小细胞肺癌细胞增殖的作用也更为显著。

实验例2：化合物pegaharoline A可以促进非小细胞肺癌细胞A549的凋亡

1.将非小细胞肺癌细胞A549以5×10⁵个/孔接种于6孔细胞培养板中，每孔培养基体积为1ml，培养24h，然后饥饿过夜；

2.加入不同浓度梯度(12.5μM，25μM，50μM)的化合物培养48h，同时设置不给药组作为对照组；

3.先将上清收集到离心管中，再用不含EDTA的胰酶小心消化收集细胞培养液到离心管。500g左右离心5min，沉淀细胞；

4.用预冷的PBS洗涤细胞两次，500g左右离心5min收集细胞；

5.加入100μl预冷的1×AnnexinV Binding Buffer，重悬细胞；

6.加入5μlAnnexinV-FITC和5μl PI，轻轻混匀，室温避光反应15min；

7.加入400μl预冷的1×AnnexinVBinding Buffer，轻轻混匀，将样品至于冰上避光放置，1h内用流式细胞仪检测。分析检测结果。结果如图14。

图14显示，通过流式细胞仪分析发现，随着作用浓度的升高，化合物pegaharolineA可以明显促进非小细胞肺癌细胞A549发生凋亡。^**P<0.01与对照组相比较。

实验例3：化合物pegaharoline A可以显著抑制非小细胞肺癌细胞A549的迁移和侵袭

1.Transwell上室接种2×10⁵个细胞，加入不同浓度梯度(12.5μM，25μM，50μM)的化合物培养24h，同时设置不给药组作为对照组；

2.下室加入800ul含有10％FBS的培养基；

3.用PBS洗3次，4％多聚甲醛固定30min；

4.用PBS洗3次，0.5％的结晶紫染色1h；

5.用棉签小心刮掉上层细胞，显微镜下拍照。结果如图15。

图15显示，通过实验发现，随着作用浓度的升高，化合物pegaharoline A可以明显抑制非小细胞肺癌细胞A549迁移和侵袭。^**P<0.01与对照组相比较。

实验例4：化合物pegaharoline A可以显著抑制非小细胞肺癌细胞A549的体外克隆形成能力

1.将非小细胞肺癌细胞A549以1000个/孔接种于6孔细胞培养板中，每孔培养基体积为1ml，培养10d，然后饥饿过夜；

2.加入不同浓度梯度(12.5μM，25μM，50μM)的化合物作用24h，同时设置不给药组作为对照组；

3.PBS洗3次，4％多聚甲醛固定30min；

4.用PBS洗3次，加入0.5％的结晶紫染色1h；

5.用PBS洗3次，显微镜拍照。结果如图16。

图16显示，通过克隆实验发现，随着作用浓度的升高，化合物pegaharoline A可以明显抑制非小细胞肺癌细胞A549克隆形成。^**P<0.01与对照组相比较。

实验例5：化合物pegaharoline A可以显著抑制HUVEC血管形成能力

1.先用Matrigel铺板24孔板过夜；

2.将HUVEC细胞以5×10⁴个/孔接种于24孔细胞培养板中，加入不同浓度梯度(25μM，50μM)的化合物培养6h，同时设置不给药组作为对照组；

3.用PBS洗3次，显微镜拍照。结果如图17。

图17显示，随着作用浓度的升高，化合物pegaharoline A可以明显抑制HUVEC血管形成。^**P<0.01与对照组相比较。

本领域技术人员应该理解的是，本发明的使用不受限于上述特定应用。就本文描述或描绘的特定元素和/或特征而言，本发明也不局限于其优选实施方案。应当理解的是，本发明不限于所公开的实施方案例或各个实施方案，且在不脱离由以下权利要求所阐述和限定的本发明的范围的情况下能够进行许多重新布置、修改和替换。

Claims

1.一种胺类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述胺类化合物的分子式为C₁₂H₁₇N₂O₃，命名为pegaharolineA，具有如式I所示的化学结构：

2.一种胺类化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)粉碎后的干燥骆驼蓬子药材进行85％～95％乙醇提取，得到浸膏；

(7)Fr.F5由凝胶SephadexLH-20分离，进一步经制备型高效液相色谱纯化，得到胺类化合物pegaharolineA。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，85％～95％乙醇的用量为骆驼蓬子药材的8～10倍量；

所述非极性树脂为D101大孔树脂；

所述凝胶SephadexLH-20的流动相为体积比2:1的氯仿/甲醇；

4.权利要求1所述胺类化合物和/或其药学上可接受的盐，或权利要求2或3所述制备方法制备的胺类化合物和/或其药学上可接受的盐在制备预防或治疗肿瘤的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肺癌；优选地，所述肿瘤为非小细胞肺癌。

6.一种预防或治疗肿瘤的药物制剂，其特征在于，包含权利要求1所述胺类化合物和/或其药学上可接受的盐，或权利要求2或3所述制备方法制备的胺类化合物和/或其药学上可接受的盐。

7.根据权利要求6所述的药物制剂，其特征在于，所述肿瘤为肺癌；优选地，所述肿瘤为非小细胞肺癌。

8.根据权利要求7所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂进一步包括治疗有效量的至少一种其他治疗剂或其组合物；

9.根据权利要求7所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂还包括药学上可接受的辅料；

10.根据权利要求7所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂的剂型包括片剂、胶囊剂、滴丸或颗粒剂。