CN115753313A - 一种适用于肉制品中芽孢分离富集的一体化抽滤装置及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于食源性致病微生物检测领域，涉及一种适用于肉制品中芽孢分离富集的一体化抽滤装置及其方法。所述装置包括三颈反应槽、支架和底座，三颈反应槽通过支架与底座固定连接；所述三颈反应槽包括进样口、反应槽、出液口和换膜口，进样口、出液口和换膜口分别与反应槽连接形成三颈反应槽，其中反应槽为圆球形，进样口中心线与出液口中心线、换膜口中心线夹角均为90°，出液口与换膜口对立设置。本发明利用芽孢与大部分杆菌之间粒径差异、酶解特性和芽孢中心“光亮”卵圆形特点，将肉制品中芽孢和菌体快速分离富集，解决了肉制品中芽孢检测繁琐、效率低、检测效果有迟滞性及检测准确度低的难题，对肉制品安全的分析研判与检测防控有重要意义。

Description

一种适用于肉制品中芽孢分离富集的一体化抽滤装置及其 方法

技术领域

本发明属于食源性致病微生物检测技术领域，涉及一种适用于肉制品中芽孢分离富集的一体化抽滤装置及其方法。

背景技术

近年来，随着人均收入水平的提高和肉制品的消费升级，消费者对肉制品消费质量偏好不断增强，需求日益增长，同时食品安全问题也越来越受重视。食源性致病菌是导致食品安全问题的重要原因之一，可以引起食物中毒、恶心和腹泻等症状，甚至全世界每年有上万人因患食源性疾病而丧生。其中许多可以产芽孢的食源性致病菌与食品腐败有关，如肉毒梭菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、蜡状芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌等，其广泛分布在自然界中的土壤、水和空气，在肉制品加工过程中造成芽孢污染是不可避免的。芽孢是一种具有独特结构的休眠体，在相差显微镜下呈中心“光亮”卵圆形结构，其抗逆性极强，对辐射、热、干燥、极端pH值和高压等极端恶劣条件有很强的抵抗力。芽孢虽然在肉制品中含量低，但当条件适宜时芽孢即可萌发繁殖，过程中产气产酸产毒，不仅会导致肉制品腐败变质，不利于食品长期保存，而且对消费者造成健康危害。肉制品工厂在工业化生产过程中经常采用热加工处理方式进行杀菌。实际研究表明，巴氏杀菌热处理方式只能杀死肉制品中大部分细菌，但仍会存在大部分耐热菌和芽孢，即使超高温处理仍会有芽孢残存，是肉制品中潜在的生物危险因子。

目前，对肉制品中芽孢的检测主要通过促使芽孢萌发形成菌体，再根据菌落、菌体特征结合16S rDNA等传统检测方法来实现，一般说来鉴定周期需要7～10天，操作繁琐，检测效率低，检测结果存在迟滞性，且由于芽孢的休眠程度不同，在平板培养时芽孢不一定都萌发形成菌落，检测的准确度较低。这些传统的微生物鉴定方法不能满足样本检测中快速、准确的需求。在对细菌进行富集时，可以经过滤膜抽滤的方法收集细菌，但现阶段检测使用的抽滤装置效率比较低，而且在操作过程中由于滤液收集容器的反复更替会造成多次残留损失，对计数结果精确度影响较大，检测的准确性下降。如专利CN109679878A公开了一种富集肉与肉制品中单核增生李斯特菌的方法，首先对肉与肉制品样品进行均质，经低温静置预处理和低温高速离心相结合，去除样品中富含的脂肪和蛋白等大分子组分干扰物，采用微孔滤膜过滤法，将样品中的目标菌富集于微孔滤膜上；然后用洗脱液洗脱滤膜和滤膜孔径中的目标菌，利用单增李斯特菌免疫磁珠与菌悬液中单增李斯特菌的特异性结合，达到富集肉与肉制品中单增李斯特菌的目的。但该方法不能实现一体化抽滤与富集，且该方法操作繁琐、耗时长。因此仍需要探索一种能将肉制品基质中的芽孢和菌体快速分离和富集的方法。

发明内容

针对现有技术肉制品中芽孢检测操作繁琐、检测效率低、检测效果存在迟滞性以及检测准确度低的技术问题，本发明提出一种适用于肉制品中芽孢分离富集的一体化抽滤装置及其方法。本发明根据芽孢(＜2μm)与大部分杆菌(＞3μm)之间粒径大小的区别、酶解特性和芽孢在相差显微镜下呈现独有的中心“光亮”卵圆形特点，将肉制品基质中的芽孢和菌体快速分离和富集，为实现肉制品中芽孢的快速定量检测提供技术支撑，对肉制品安全的分析研判与检测防控具有重要意义。

为了达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种适用于肉制品中芽孢分离富集的一体化抽滤装置，包括三颈反应槽、支架和底座，三颈反应槽通过支架与底座固定连接；所述三颈反应槽包括进样口、反应槽、出液口和换膜口，所述进样口、出液口、换膜口分别与反应槽连接形成三颈反应槽，其中所述反应槽为圆球形，所述进样口中心线与出液口中心线的夹角、进样口中心线与换膜口中心线的夹角均为90°，出液口与换膜口对立设置。通过该一体化抽滤装置，可以进行对肉制品中芽孢的一次过滤、收集与反应、二次过滤，并实现肉制品中芽孢的分离富集。

所述进样口为上下敞口的圆柱，圆柱的高为8～10cm，直径为3.5cm；所述反应槽的圆球腔体直径为10～12cm；进样口与反应槽之间设有密封垫I和滤膜支撑网I，密封垫I与滤膜支撑网I接触，滤膜支撑网I与反应槽接触。反应槽的形状设置为圆球形，圆球形的弧形内壁有利于液体的流动与收集。进样口上端敞口的形状有利于进样，下端与反应槽连接有利于收集液体。

所述密封垫I为圆环形，外圆直径为3.5cm，内圆直径为3.3cm；所述滤膜支撑网I为中间镂空呈网状的直径3.5cm的圆形结构，圆形结构边缘处设有直径为3～4mm的实心结构。密封垫I和滤膜支撑网I结合能达到分离富集过程中压紧过滤膜I的作用，保证抽滤时过滤膜II的紧密性。

所述出液口为带有引流装置和抽气口的圆形敞口，出液口与反应槽之间设有密封垫II和滤膜支撑网II，密封垫II与滤膜支撑网II接触，滤膜支撑网II与反应槽接触；所述出液口为直径2.0～2.2cm的圆形敞口，外侧还设有磨砂外侧结构I和磨砂外侧结构II，出液口通过磨砂外侧结构I和磨砂外侧结构II与收集瓶连接。引流装置是为了防止抽滤时过滤液从抽气口流走，抽气口是为了便于连接真空抽滤泵，便于液体的抽滤。密封垫II和滤膜支撑网II结合能达到分离富集过程中压紧过滤膜II的作用，保证抽滤时过滤膜II的紧密性。出液口外侧设有的磨砂外侧结构I和磨砂外侧结构II便于在二次过滤单元时使反应槽通过出液口与收集瓶连接，同时磨砂的设计使出液口有一定的防滑作用，可以增大出液口与收集瓶的摩擦力，保证一定的密封性。

所述抽气口为直径1～1.2cm的圆形敞口。抽气口是为了便于连接真空抽滤泵，便于液体的抽滤。

所述换膜口为直径2.5～3.5cm的圆柱，左右敞口为直径3.5cm的圆形，所述支架包括支架I和支架II，支架I和支架II的间距为12～15cm，支架I上端设有直径为3.6～4cm的圆形卡环I和卡扣I，圆形卡环I与卡扣I连接；支架II上端设有直径为3.6～4cm的圆形卡环II和卡扣II，圆形卡环II和卡扣II连接；支架I和支架II下端均与底座连接。换膜口左端敞口便于使用镊子对二次过滤膜的更换。支架I、II上的卡扣I、II和卡环I、II有利于在进行肉制品中芽孢的一次过滤、收集与反应单元时保证反应槽的稳定性，起到固定反应槽的作用。同时支架与底座连接，底座为支架上固定的反应槽起到放置和支撑作用。

本发明的另一目的在于利用一体化抽滤装置提供一种针对肉制品中芽孢的分离富集与快速定量检测方法，分为一次过滤单元、收集与反应单元和二次过滤单元，步骤如下：

步骤1样品前处理：无菌条件下随机取100g样品于300～400mL无菌水中，振摇5min制备成悬浊液，将悬浊液用孔径大小为100～200μm的无菌滤网过滤至灭菌后的烧杯中，依次用50～100mL的无菌水对滤网上层的滤渣进行两次清洗，去除悬浊液中大部分大于无菌滤网孔径范围内的大颗粒食物碎渣造成的介质干扰，并收集烧杯中的滤液。然后，将烧杯中的滤液通过低温高速离心机进行高速(8000～10000rpm)离心10min，将滤液中的细菌营养体、芽孢和少量残留的食物残渣进行浓缩得到富集物，并将其重量记为m。

步骤2一次过滤阶段：将孔径大小为40μm的过滤膜(直径为3.4～3.5cm)放在一次过滤单元的滤膜支撑网I上，并用密封垫I压紧过滤膜I，同时用橡胶塞塞上换膜口和出液口，通过抽气口连接真空抽滤泵，完成装置准备工作。将“富集物:无菌水”按照“1:9”的比例进行稀释，使用涡旋震荡仪充分混匀60s，将得到的稀释液从进样口加入，使用真空抽滤泵抽滤，去除大颗粒(＞40μm)的食品残渣，实现芽孢的一次分离富集。

步骤3二次过滤阶段：通过换膜口对右侧的二次过滤单元进行过滤膜II的安装，将孔径大小为3μm的过滤膜II(直径为3.4～3.5cm)放在二次过滤单元的滤膜支撑网II上，并用密封垫II压紧过滤膜，出液口连接收集瓶，同时用橡胶塞塞上换膜口和进样口，通过抽气口连接真空抽滤泵，完成装置准备工作。将淀粉酶和脂肪酶按1:1比例混合并使用0.22μm滤膜过滤去除背景微生物干扰，50℃水浴10min活化，并参照酶活性正常值取10～30μL混合酶加入反应槽的过滤液中一起在50℃水浴反应20min，主要目的是将残留的食物大分子残渣酶解成小分子，便于过滤操作和计数。酶解完成后将装置向右旋转90°使出液口垂直向下，使用真空抽滤泵进行抽滤，实现食品残渣(＞3μm)和菌体与芽孢的分离。最后，将收集瓶中的收集液使用8000～10000rpm离心10min得到芽孢富集物。

步骤4定量检测方法的构建：芽孢含水量低使得芽孢在相差显微镜下呈现独有的中心“光亮”卵圆形特点，并结合浮游生物计数板可以实现“网格区域化”计数的特点，构建相差显微镜下镜检视野数量与芽孢数量的数学关系，并通过平板计数进行验证，实现芽孢的快速定量。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明根据芽孢(＜2μm)与大部分杆菌(＞3μm)之间粒径大小的区别、酶解特性和芽孢在相差显微镜下呈现独有的中心“光亮”卵圆形的特点，设计开发了一种适用于肉制品芽孢分离富集的一体化抽滤装置，集成样品进样、样品反应和样品分离于一体，极大地简化了操作流程，降低了样品损耗。

2、本发明依据一体化抽滤装置建立了一种高效分离富集肉制品中芽孢的技术和快速定量检测的方法，实现了食源性芽孢在实际食品复杂基质中分离富集的目的，解决了芽孢检测难度大的问题，缩短了检测时间。通过相差显微镜直观观察并计数，再结合拉曼光谱构建定量模型，形成了一种实现复杂食品介质中食源性芽孢快速分离富集检测的新方法。

3、在本发明中，一次过滤单元是将肉制品芽孢的混合物通过40μm的过滤膜去除大颗粒(＞40μm)食品残渣来实现芽孢的一次分离富集。收集与反应单元不仅可以收集一次过滤单元处理后的过滤液，而且可以进一步完成肉制品中食品基质的酶解过程，使食品基质破碎为更小的颗粒，便于二次过滤单元的操作。二次过滤单元是将收集与反应单元处理后的芽孢混合进一步经过3μm的过滤膜进行分离富集，实现常见微生物菌体(＞3μm)和芽孢(＜2μm)的分离，便于进一步定量计数。在定量检测阶段，本发明选择呈现中心“光亮”卵圆形的芽孢光斑并结合浮游生物计数板进行网格区域化计数，构建了相差显微镜下镜检视野数量与芽孢数量的数学关系，并通过平板计数进行验证，实现了芽孢的快速定量检测。通过该一体化抽滤装置将肉制品基质中的芽孢和菌体快速分离和富集，为实现肉制品中芽孢的快速定量检测提供技术支撑。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中肉制品中芽孢分离富集的一体化抽滤装置的剖面图。

图2为本发明实施例1图1中局部2和局部3的平面示意图，局部5的结构与局部2完全相同，局部6的结构与局部3完全相同。

图3为本发明实施例1图1中局部11、12的侧视平面示意图，其中(A)为局部11的侧视平面示意图，(B)为局部12的侧视平面示意图。

图4为本发明实施例1中肉制品中芽孢的分离富集与快速定量检测方法流程示意图，其中(A)为肉制品样品前处理过程示意图；(B)为肉制品中芽孢分离富集的两次过滤操作示意图。

图5为本发明实施例1二次过滤单元操作示意图。

图6为本发明实施例6中酶解前后镜检结果，其中(A)为酶解前镜检结果；(B)为酶解后镜检结果。

图7为本发明实施例7中浮游生物计数板结构示意图。

图8为本发明实施例7中平板计数结果与镜检结果对比图。

其中，图中各附图标记：

1、进样口；2、密封垫I；3、滤膜支撑网I；4、反应槽；5、密封垫II；6、滤膜支撑网II；7、抽气口；8、引流装置；9、出液口；901、磨砂外侧结构I；902、磨砂外侧结构II；10、换膜口；11、支架I；1101、卡扣I；1102、卡环I；12、支架II；1201、卡扣II；1202、卡环II；13、底座；14、收集瓶。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述各实施例中所用一体化抽滤装置是根据设计的图纸，通过液化气和氧气连接喷灯燃烧导致玻璃材质软化烧制形状，最后放入高温炉内进行封闭烘烘烤定型，其中使用的玻璃仪器均购于郑州华美仪器设备有限公司，滤膜均购买于海宁市益博过滤器材厂。

实施例1

如图1所示，一种适用于肉制品中芽孢分离富集的一体化抽滤装置，包括三颈反应槽、支架和底座13，三颈反应槽通过支架与底座13固定连接；所述三颈反应槽包括进样口1、反应槽4、出液口9和换膜口10，所述进样口1、出液口9、换膜口10分别与反应槽4连接形成三颈反应槽，其中所述反应槽4为圆球形，所述进样口1中心线与出液口9中心线的夹角、进样口1中心线与换膜口10中心线的夹角均为90°，出液口9与换膜口10对立设置。

通过图1的装置可以进行肉制品中芽孢分离与富集时的一次过滤阶段、收集与反应阶段、二次过滤阶段。在一次过滤单元中，将待测样品进行预处理后得到的富集物经进样口1进入反应槽4中，在这个过程中实现富集物的一次过滤。在收集与反应单元，淀粉酶与脂肪酶按一定比例加入至反应槽4中的一次过滤单元得到的过滤液中，进行酶解反应，将残留的食物大分子残渣酶解成小分子，便于下一阶段的过滤操作和最终的计数。在二次过滤单元，将反应槽4向右旋转90°使出液口9垂直向下后，滤液经出液口9流出进入收集瓶14中，实现芽孢的分离与富集。

实施例2

如图1所示，一种适用于肉制品中芽孢分离富集的一体化抽滤装置，所述进样口1为上下敞口的圆柱，圆柱的高为8～10cm，直径为3.5cm；所述反应槽4的圆球腔体直径为10～12cm；进样口1与反应槽4之间设有密封垫I2和滤膜支撑网I3，密封垫I2与滤膜支撑网I3接触，滤膜支撑网I3与反应槽4接触。如图2所示，所述密封垫I2为圆环形，外圆直径为3.5cm，内圆直径为3.3cm；所述滤膜支撑网I3为中间镂空呈网状的直径3.5cm的圆形结构，圆形结构边缘处为直径3～4mm的实心结构。反应槽4的形状设置为圆球形，圆球形的弧形内壁有利于液体的流动与收集。进样口1上端敞口的形状有利于进样，下端与反应槽4连接有利于收集液体。进行抽滤时，在滤膜支撑网I3上放上孔径大小为40μm的过滤膜I，密封垫I2和滤膜支撑网I3结合能达到分离富集过程中压紧过滤膜I的作用，保证抽滤时过滤膜I的紧密性，并可以加样进行抽滤。

其他结构与实施例1相同。

实施例3

如图1所示，一种适用于肉制品中芽孢分离富集的一体化抽滤装置，所述出液口9为带有抽气口7和引流装置8的圆形敞口，出液口9与反应槽4之间设有密封垫II5和滤膜支撑网II6，密封垫II5与滤膜支撑网II6接触，滤膜支撑网II6与反应槽4接触；出液口9为直径2.0～2.2cm的圆形敞口，外侧还设有磨砂外侧结构I901和磨砂外侧结构I902，出液口9通过磨砂外侧结构I901和磨砂外侧结构I902与收集瓶14连接。所述抽气口7为直径1～1.2cm的圆形敞口。引流装置8是为了防止抽滤时过滤液从抽气口7流走，抽气口7是为了便于连接真空抽滤泵，便于液体的抽滤。密封垫II5和滤膜支撑网II6结合能达到压紧分离富集过程中压紧过滤膜II的作用，保证抽滤时过滤膜II的紧密性。如图5所示，出液口9外侧设有的磨砂外侧结构I901和磨砂外侧结构II902是为了便于在二次过滤单元时使反应槽4通过出液口9与收集瓶14连接，并且磨砂的设计使出液口9有一定的防滑作用，可以增大出液口9与收集瓶14的摩擦力，保证一定的密封性。

其他结构与实施例1相同。

实施例4

如图1所示，一种适用于肉制品中芽孢分离富集的一体化抽滤装置，所述换膜口10为直径2.5～3.5cm的圆柱，左右敞口为直径3.5cm的圆形；所述支架包括支架I11和支架II12，支架I11和支架II12的间距为12～15cm。如图3所示，支架I11上端设有直径为3.6～4cm的圆形卡环I1102和卡扣I1101，圆形卡环I1102与卡扣I1101连接；支架II12上端设有直径为3.6～4cm的圆形卡环II1202和卡扣II1201，圆形卡环II1202和卡扣II1201连接；支架I11和支架II12下端均与底座13连接。换膜口10左端敞口便于使用镊子对滤膜支撑网II6上的二次过滤膜II进行更换。支架I11、II12上的卡扣I1101、II1201和卡环I1102、II1202有利于在进行肉制品中芽孢的一次过滤、收集与反应单元过程中保证反应槽4的稳定性，起到固定反应槽的作用。同时支架与底座13连接，底座13为支架上固定的反应槽4起到放置和支撑作用。

其他结构与实施例1相同。

实施例5

参见图1至图3，本发明所述的肉制品中芽孢分离富集的一体化抽滤装置，包括一次过滤单元、收集与反应单元和二次过滤单元和底架支撑单元四个部分。

一次过滤单元是将肉制品芽孢的混合物通过40μm的过滤膜去除大颗粒食品残渣来实现芽孢的一次分离富集。该单元主要包括进样口1、密封垫I2和滤膜支撑网结构I3，使用时在滤膜支撑网I3上放上孔径大小为40μm的过滤膜I，用密封垫I2压紧过滤膜I即可加样进行抽滤。其中，进样口1为8～10cm的圆柱，上下敞口为直径3.5cm的圆形，上端敞口便于进样，下端与反应槽相连便于收集；密封垫I2为圆环形橡胶材料，外圆直径为3.5cm，内圆直径为3.3cm；滤膜支撑网I3为中间镂空的直径为3.5cm的圆形结构，边缘有一圈3～4mm的实心结构(如图2所示)，其与密封垫I2结合达到压紧过滤膜I的作用，保证抽滤时过滤膜I的紧密性。

收集与反应单元不仅可以收集一次过滤单元处理后的过滤液，而且可以进一步完成肉制品中食品基质的酶解过程，使食品基质破碎为更小的颗粒，便于二次过滤单元的操作。该单元主体为圆球形玻璃反应槽4，圆球腔体直径为10～12cm，弧形内壁更利于液体的流动与收集。

二次过滤单元是将收集与反应单元处理后的芽孢混合液进一步经过3μm的过滤膜II进行分离富集，实现微生物菌体和芽孢的分离，便于进一步定量计数。该单元主要包括密封垫II5、滤膜支撑网II6、抽气口7、引流装置8、出液口9和换膜口10结构，使用时需将整个装置向右旋转90°进行二次过滤。其中，密封垫II5和滤膜支撑网II6的大小与作用与一次过滤单元的一致；引流装置8是为了防止抽滤时过滤液从抽气口7流走；抽气口7为直径1～1.2cm的圆形敞口结构；出液口9为直径2.0～2.2cm的圆形敞口，外侧为磨砂结构(如图1中901和902所示)；换膜口10在反应槽4左侧，其结构为2.5～3.5cm的圆柱，左右敞口为直径3.5cm的圆形，左端敞口可以在使用镊子对二次过滤的膜II进行更换，右端与反应槽相连。

底架支撑单元主要有支架I11、支架II12和底座13组成，其作用主要是放置和固定一体化抽滤装置，便于实验操作。支架I11和支架II12间距为12～15cm，支架下端与底座13相连，两个支架上端设有直径为3.6～4cm的圆形卡环用于固定装置，如图3中1101、1102、1201和1202所示。

基于上述装置，本发明还提供了一种针对肉制品中芽孢的分离富集与快速定量检测方法，下面结合应用例和附图对本发明作进一步详细描述和说明。

应用例

本应用例为利用一体化抽滤装置进行肉制品中芽孢的分离富集的方法，如图4所示，步骤如下：

步骤1样品前处理：无菌条件下随机取100g样品于300～400mL无菌水中，振摇5min制备成悬浊液，将悬浊液用孔径大小为100～200μm的无菌滤网过滤至灭菌后的烧杯中，依次用50～100mL的无菌水对滤网上层的滤渣进行两次清洗，去除悬浊液中大部分大颗粒(＞100～200μm)食物碎渣造成的介质干扰，并收集烧杯中的滤液。然后，将烧杯中的滤液通过低温高速离心机进行高速(8000～10000rpm)离心10min，将滤液中的细菌营养体、芽孢和少量残留的食物残渣进行浓缩得到富集物，并将其重量记为m。如图4(A)所示。

步骤2一次过滤阶段：将孔径大小为40μm的过滤膜I(直径为3.4～3.5cm)放在一次过滤单元的滤膜支撑网I3上，并用密封垫I2压紧过滤膜I，同时用橡胶塞塞上换膜口10和出液口9，通过抽气口7连接真空抽滤泵，完成装置准备工作。将“富集物:无菌水”按照“1:9”的比例进行稀释，使用涡旋震荡仪充分混匀60s，将得到的稀释液从进样口1加入，通过抽气口7进行真空抽滤，去除大颗粒(＞40μm)的食品残渣，实现芽孢的一次分离富集，如图4(B)所示。

步骤3二次过滤阶段：通过换膜口10对右侧的二次过滤单元进行过滤膜的安装，将孔径大小为3μm的过滤膜II(直径为3.4～3.5cm)放在二次过滤单元的滤膜支撑网II6上，并用密封垫II5压紧过滤膜II，出液口9连接收集瓶14(如图5所示)，同时用橡胶塞塞上换膜口10和进样口1，通过抽气口7连接真空抽滤泵，完成装置准备工作。将淀粉酶和脂肪酶按1:1比例混合并使用0.22μm滤膜过滤去除背景微生物干扰，50℃水浴10min活化，并参照酶活性正常值取10～30μL混合酶加入反应槽4的过滤液中一起在50℃水浴反应20min，主要目的是将残留的食物大分子残渣酶解成小分子，便于过滤操作和计数。酶解完成后将装置向右旋转90°使出液口9垂直向下与收集瓶14相连(如图5所示)，使用真空抽滤泵进行抽滤，实现食品残渣(＞3μm)和菌体与芽孢的分离。最后，将收集瓶14中的收集液使用8000～10000rpm离心10min得到芽孢富集物，如图4(B)所示。

步骤4定量检测方法的构建：芽孢含水量低使得芽孢在相差显微镜下呈现独有的中心“光亮”卵圆形的特点(如图6B所示)，并结合浮游生物计数板可以实现“网格区域化”计数的特点(如图7所示)，构建相差显微镜下镜检视野数量与芽孢数量的数学关系，并通过平板计数进行验证，实现芽孢的快速定量。

测试例1

为了验证上述步骤对肉制品中芽孢的快速检测的可行性，将浓度(以10为底数的对数表示)为6.89log(CFU/mL)产气荚膜梭菌芽孢反接进二次高温高压灭菌后的肠类肉制品中，按照上述步骤进行操作，通过相差显微镜观察酶解前后的微观图像确定酶解效果，并将产气荚膜梭菌芽孢富集物悬浊液经80℃20min热水浴处理后通过平板培养计数，记为S1，进而换算经过该方法操作后芽孢的初始浓度S和该方法操作过程中芽孢的获得率C，计算方法如公式(1)和(2)所示。

图6为本发明实施例6中酶解前后镜检结果，其中(A)为酶解前镜检结果；(B)为酶解后镜检结果。图6结果表明，酶解前显微镜视野中存在大部分食物残渣，严重干扰对芽孢的观察且实验操作容易堵塞，酶解后显微镜视野下可以清楚地看到芽孢且实验操作不受干扰。

S＝S1/(100/m) (1)

C＝C1/C2 (2)

注：

S——经过该方法操作前肉制品中芽孢的初始浓度，单位为CFU/mL；

S1——经过该方法操作后富集物的芽孢浓度，单位为CFU/mL；

M——100g肠类肉制品经该方法操作后得到富集物的重量，单位为g；

C——操作过程中芽孢获得率，单位为％；

C1——S的以10为底的对数值，单位为log(CFU/mL)；

C2——S1的以10为底的对数值，单位为log(CFU/mL)。

表1为操作过程中芽孢的获得率。

表1操作过程中芽孢的获得率

C1(lg(CFU/mL))	C2(lg(CFU/mL))	C(％)
			6.73	6.89	97.70

如表1所示，该方法操作过程中产气荚膜梭菌孢的最终获得率为97.70％，过程损失可忽略不计。因此，该方法可行性良好。

测试例2

为了建立肉制品中芽孢通过相差显微镜镜检的快速定量检测方法，本实例以肉制品中常见的产气荚膜梭菌芽孢为例，通过0.1mL的浮游生物计数板进行计数。具体操作如下：将产气荚膜梭菌芽孢80℃处理20min促进其萌发，并将其在TSC培养基上厌氧培养24～48h，得到该芽孢平板计数浓度，并将产气荚膜梭菌芽孢稀释为10²CFU/mL、10³CFU/mL、10⁴CFU/mL和10⁵CFU/mL的不同浓度梯度，依次滴加在0.1mL的浮游生物计数板，每个计数板有100个方格，可以实现“网格区域化”计数，计数原则为随机五点取样法，浮游生物计数板结构示意图如图7所示。图7为本发明实施例7中浮游生物计数板结构示意图。在相差显微镜下记出中心“光亮”卵圆形，使用40×物镜随机取100个视野的总数记为A1，通过公式(3)进行计算，并将镜检计数结果转换为log值与纯芽孢原始浓度进行对比，结果如表2和图8所示。

图8为本实例中平板计数结果与镜检结果对比图。如图8所示，芽孢的平板计数结果与芽孢的镜检结果在同一数量级，平板计数结果偏小的原因可能与芽孢的休眠状态有关，但其结果差异较小可忽略不计。通过相差显微镜镜检的方法更加直观的观察到芽孢的形态，快速计算芽孢数量，且计数结果更具有代表性。进一步地，可以将肉制品通过上述步骤1、2和3操作后得到富集物，通过相差显微镜快速直观地计算富集物中食源性芽孢的数量，最终可以通过公式(4)计算得到肉制品中原始的芽孢数量。肉制品中富集物的芽孢浓度与肉制品原始状态的芽孢数量对应关系示例如表3所示。

A＝(A1/100)×16×100×10 (3)

B1＝A/(100/m) (4)

注：

A——富集物相差显微镜镜检计数结果，单位为CFU/mL；

A1——富集物在40×物镜随机取100个视野的芽孢总数，单位为个；

16——40×物镜的视野面积为1/16个小方格；

100——浮游生物计数板有100个小方格；

B1——肉制品中原始的芽孢数量，单位g/个；

m——100g肉制品经该方法操作后得到富集物的重量，单位为g。

表2浮游生物计数板镜检计数结果

平板计数结果(CFU/mL)	100个视野镜检数量(个)
		4.7×10<sup>2</sup>	5
4.7×10<sup>3</sup>	46
		4.7×10<sup>4</sup>	289

表3肉制品富集物中芽孢镜检数量与肉制品中芽孢原始数量对应关系表

A1(个)	A(CFU/mL)	m(g)	B1(g/个)
				5	8×10<sup>2</sup>	1.5	1.2×10<sup>1</sup>
10	1.6×10<sup>3</sup>	1.8	2.8×10<sup>1</sup>
				20	3.2×10<sup>3</sup>	1.6	5.1×10<sup>1</sup>
40	6.4×10<sup>3</sup>	2.8	1.79×10<sup>2</sup>
				80	1.28×10<sup>4</sup>	1.4	1.79×10<sup>2</sup>
100	1.6×10<sup>4</sup>	1.1	1.76×10<sup>2</sup>

表2、表3分别为纯芽孢原始浓度与浮游生物计数板镜检计数结果对比关系表和肉制品中富集物的芽孢浓度与肉制品原始状态的芽孢数量对应关系表，由表2和图8可知芽孢的平板计数结果与芽孢的镜检结果在同一数量级，平板计数结果偏小的原因可能与芽孢的休眠状态有关，但其结果差异较小可忽略不计，芽孢的镜检结果更能直接准确的反映芽孢的浓度。由表3可知，在已知浮游生物计数板在40×物镜随机取100个视野的芽孢总数和100g肉制品经该方法操作后得到富集物的重量的前提下可以根据上述公式(4)计算出肉制品中芽孢原始数量。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种适用于肉制品中芽孢分离富集的一体化抽滤装置，其特征在于：包括三颈反应槽、支架和底座(13)，三颈反应槽通过支架与底座(13)固定连接；所述三颈反应槽包括进样口(1)、反应槽(4)、出液口(9)和换膜口(10)，所述进样口(1)、出液口(9)、换膜口(10)分别与反应槽(4)连接形成三颈反应槽，其中所述反应槽(4)为圆球形，所述进样口(1)中心线与出液口(9)中心线的夹角、进样口(1)中心线与换膜口(10)中心线的夹角均为90°，出液口(9)与换膜口(10)对立设置。

2.根据权利要求1所述的适用于肉制品中芽孢分离富集的一体化抽滤装置，其特征在于：所述进样口(1)为上下敞口的圆柱，圆柱的高为8～10cm，直径为3.5cm；所述反应槽(4)的圆球腔体直径为10～12cm；进样口(1)与反应槽(4)之间设有密封垫I(2)和滤膜支撑网I(3)，密封垫I(2)与滤膜支撑网I(3)接触，滤膜支撑网I(3)与反应槽(4)接触。

3.根据权利要求1或2所述的适用于肉制品中芽孢分离富集的一体化抽滤装置，其特征在于：所述密封垫I(2)为圆环形，外圆直径为3.5cm，内圆直径为3.3cm；所述滤膜支撑网I(3)为中间镂空呈网状的直径3.5cm的圆形结构，圆形结构边缘处为直径3～4mm的实心结构。

4.根据权利要求1所述的适用于肉制品中芽孢分离富集的一体化抽滤装置，其特征在于：所述出液口(9)为带有抽气口(7)和引流装置(8)的圆形敞口，出液口(9)与反应槽(4)之间设有密封垫II(5)和滤膜支撑网II(6)，密封垫II(5)与滤膜支撑网II(6)接触，滤膜支撑网II(6)与反应槽(4)接触；所述出液口(9)为直径2.0～2.2cm的圆形敞口，外侧还设有磨砂外侧结构I(901)和磨砂外侧结构II(902)，出液口(9)通过磨砂外侧结构I(901)和磨砂外侧结构II(902)与收集瓶(14)连接。

5.根据权利要求4所述的适用于肉制品中芽孢分离富集的一体化抽滤装置，其特征在于：所述抽气口(7)为直径1～1.2cm的圆形敞口。

6.根据权利要求1所述的适用于肉制品中芽孢分离富集的一体化抽滤装置，其特征在于：所述换膜口(10)为直径2.5～3.5cm的圆柱，左右敞口为直径3.5cm的圆形；所述支架包括支架I(11)和支架II(12)，支架I(11)和支架II(12)的间距为12～15cm，支架I(11)上端设有直径为3.6～4cm的圆形卡环I(1102)和卡扣I(1101)，圆形卡环I(1102)与卡扣I(1101)连接；支架II(12)上端设有直径为3.6～4cm的圆形卡环II(1202)和卡扣II(1201)，圆形卡环II(1202)和卡扣II(1201)连接；支架I(11)和支架II(12)下端均与底座(13)连接。

7.一种肉制品中芽孢分离富集及快速定量检测方法，其特征在于：利用权利要求1、2或4-6任一项所述的一体化抽滤装置进行分离富集，步骤如下：

S1、样品预处理：无菌条件下取样品于无菌水中振摇制备成悬浊液，将悬浊液用无菌滤网过滤至灭菌后的烧杯中，用无菌水对滤网上层的滤渣进行两次清洗，并收集烧杯中的滤液；然后将烧杯中的滤液进行高速离心；

S2、一次过滤：将过滤膜I放在滤膜支撑网I(3)上，并用密封垫I(2)压紧过滤膜I，同时用橡胶塞塞上换膜口(10)和出液口(9)，通过抽气口(7)连接真空抽滤泵，完成装置准备工作后；

将步骤S1所得的富集物与无菌水按比例稀释，充分混匀后将得到的稀释液从进样口(1)经密封垫I(2)和滤膜支撑网I(3)进入反应槽(4)中，进行真空抽滤，得到过滤液，实现芽孢的一次分离富集；

S3、二次过滤：通过换膜口(10)将过滤膜II放在滤膜支撑网II(6)上，并用密封垫II(5)压紧过滤膜II，出液口(9)连接收集瓶(14)，同时用橡胶塞塞上换膜口(10)和进样口(1)，通过抽气口(7)连接真空抽滤泵，完成装置准备工作；

将淀粉酶和脂肪酶混合活化后从换膜口(10)加入至反应槽(4)步骤S2所得的过滤液中，酶解反应，反应完成后将反应槽(4)向右旋转90°，使出液口(9)垂直向下，进行真空抽滤，最后将收集瓶(14)中的收集液离心，得到芽孢富集物；

S4、将步骤S3所得的芽孢富集物于相差显微镜下进行观察，选择呈现中心“光亮”卵圆形的光斑并结合浮游生物计数板进行网格区域化计数，构建相差显微镜下镜检视野数量与芽孢数量的数学关系，并通过平板计数进行验证，实现芽孢的快速定量检测。

8.根据权利要求7所述的肉制品中芽孢分离富集的方法，其特征在于：所述步骤S1中样品与无菌水的质量体积比为100g:(300～400)mL，振摇的时间为5min，无菌滤网的孔径大小为200～200μm，高速离心的转速为8000～10000rpm，高速离心的时间为10min。

9.根据权利要求7或8所述的肉制品中芽孢分离富集的方法，其特征在于：所述步骤S2中过滤膜I的直径为2.4～3.5cm，孔径为40μm；富集物与无菌水按质量比1:9进行混合，充分混匀的时间为60s。

10.根据权利要求9所述的肉制品中芽孢分离富集的方法，其特征在于：所述步骤S3中过滤膜II的直径为3.4～3.5cm，孔径为3μm；淀粉酶和脂肪酶的混合比例为1:1，活化的温度为50℃，活化的时间为10min；酶解反应的温度为50℃，酶解反应的时间为20min，离心转速为8000～10000rpm，离心时间为10min。

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