CN115746166A

CN115746166A - 一种蒌叶果胶及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN115746166A
Application number: CN202211531711.2A
Authority: CN
Inventors: 罗海彬; 谢曦; 朱梓然; 张榕芮; 杜德顺
Original assignee: Hainan University
Current assignee: Hainan University
Priority date: 2022-12-01
Filing date: 2022-12-01
Publication date: 2023-03-07
Anticipated expiration: 2042-12-01
Also published as: CN115746166B

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种蒌叶果胶及其制备方法与应用。本发明先用无水乙醇对蒌叶进行预处理，再用酸性较强的硫酸溶液水浴加热进行酸处理，最后用无水乙醇多次洗涤、纯化，制备得到蒌叶果胶，操作简单；并且所得蒌叶果胶经过实验证明，可以有效保护槟榔成分对口腔黏膜上皮细胞的损伤，增强口腔黏膜上皮细胞活力、减少口腔黏膜上皮细胞死亡、改善口腔黏膜上皮细胞形态、增强口腔上皮屏障功能以及改善张口度，具有很好的防治口腔黏膜下纤维性变效果。

Description

一种蒌叶果胶及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种蒌叶果胶及其制备方法与应用。

背景技术

蒌叶，又名蒟酱、芦子、荖叶、扶留藤等，是胡椒科胡椒属攀援藤本植物，分布广泛，在我国云南、海南、广东、广西、台湾等地区均有发现，具有重要的经济、食用、药用价值。蒌叶营养成分丰富，含有蛋白质、碳水化合物、矿物质、脂肪、维生素等多种营养成分，还含有大量的精油、生物碱、果胶、酚类、黄酮类等功效成分。并且经过研究表明，蒌叶具有抑菌、抗氧化、抗癌、抗虫、抗炎、延缓衰老等多种生物活性(姜太玲,沈绍斌,周迎春,熊贤坤,刘倩,段春芳,李月仙,张林辉,宋记明,刘光华.蒌叶的化学成分及生物活性研究进展[J].食品工业科技,2622,43(66):386-366.DOI:16.13386/j.issn1662-6366.2621626236.)。

其中，蒌叶中含有的果胶是植物中的一种多糖类高分子化合物，多存在于植物相邻细胞壁的中胶层。在食品行业，果胶可作为添加剂或配料，起到增稠、胶凝、乳化、稳定成型等作用；在医药行业，果胶是一种极具价值的水溶性膳食纤维，具有抗腹泻、保护胃肠黏膜、清除肠道胆酸等作用，在药物制剂方面也得到了广泛的应用。但是目前国内果胶主要来源于柑橘、柠檬、柚子等。但是蒌叶果胶由于在蒌叶叶片中的含量较低，目前暂未发现较好的蒌叶果胶的提取方法及应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术缺少蒌叶果胶提取方法的缺陷和不足，提供一种操作简单、产率较好的蒌叶果胶的制备方法。

本发明的目的是提供一种蒌叶果胶。

本发明另一目的是提供所述蒌叶果胶的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种蒌叶果胶的制备方法，具体包括以下步骤：

S1、预处理：将蒌叶破碎，无水乙醇66666℃水浴加热，过滤，滤渣漂洗至水无色无味，干燥，粉碎，得蒌叶粉末；

S2、酸处理：将步骤S1所得蒌叶粉末加入pH为1.261.6的硫酸溶液中，88668℃水浴加热766166min，冷却后纱布过滤除滤渣，避免后续抽滤堵塞，滤液进一步抽滤，收集滤液，加入无水乙醇静置；

S3、纯化：将步骤S2静置后的混合液离心，除上清，沉淀加入无水乙醇洗涤纯化263次，收集沉淀，干燥、粉碎，即得。

进一步地，步骤S1中，所述水浴加热8626min。

更进一步地，步骤S1中，所述漂洗采用36666℃的热水。

进一步地，步骤S2中，所述蒌叶粉末与硫酸溶液的质量体积比为1:(18636)(g/ml)。

优选地，步骤S2中，冷却后再加入相同pH、等体积的硫酸溶液，再用纱布过滤。经过酸处理使得果胶溶于溶剂中，但果胶的溶解度依然有限，加热过程中的果胶可能未完全溶解，再次加入硫酸可以确保果胶充分溶解；加入酸后果胶和杂质得到稀释，使得后续的纯化效果更好，得到的产物杂质较少。

优选地，步骤S2中，所述静置时间为6.861.8h。

更进一步地，步骤S3中，所述离心为466668666r/min离心8626min。

另外的，本发明还提供了所述制备方法制备得到的蒌叶果胶。

进一步地，所述蒌叶果胶的重均分子量为86666686666Da。

更进一步地，所述蒌叶果胶的酯化度为28648％。

进一步地，所述蒌叶果胶的总半乳糖醛酸含量为38668％。

口腔黏膜下纤维性变(OSF)是口腔黏膜下结缔组织内广泛的胶原纤维沉积，上皮固有层或其下结缔组织内的局部炎症和肌纤维坏死改变所致的一种慢性黏膜疾病。咀嚼槟榔是导致OSF的最重要的致病因素，嚼槟榔群体患口腔黏膜下纤维性变的相对危险值是不嚼槟榔群体的1666287倍，且随着每天咀嚼槟榔的频率和时间的增加而增加。OSF的发病机制复杂，至今尚无满意的治疗手段。本发明通过大量的实验证明，制备所得蒌叶果胶可以有效保护槟榔成分对口腔黏膜上皮细胞的损伤，增强口腔黏膜上皮细胞活力、减少口腔黏膜上皮细胞死亡、改善口腔黏膜上皮细胞形态以及增强口腔上皮屏障功能，具有很好的防治口腔黏膜下纤维性变效果。

因此，本发明还要求保护所述蒌叶果胶在制备防治口腔黏膜下纤维性变药物中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明先用无水乙醇对蒌叶进行预处理，再用酸性较强的硫酸溶液水浴加热进行酸处理，最后用无水乙醇多次洗涤、纯化，制备得到蒌叶果胶，操作简单；并且所得蒌叶果胶经过实验证明，可以有效保护槟榔成分对口腔黏膜上皮细胞的损伤，增强口腔黏膜上皮细胞活力、减少口腔黏膜上皮细胞死亡、改善口腔黏膜上皮细胞形态以及增强口腔上皮屏障功能，具有很好的防治口腔黏膜下纤维性变效果。

附图说明

图1为本发明实施例1中蒌叶果胶样品分子量测定的高效液相色谱图。

图2为本发明实验例中不同提取条件对蒌叶果胶产率的影响数据统计图，包括不同pH值(a)、提取温度(b)、提取时间(c)对蒌叶果胶产率的影响。

图3为本发明应用例1中CCK8方法检测人口腔上皮细胞活力的结果数据统计图；其中，与正常组比较：#p<6.68；与槟榔碱组比较：*p<6.68。

图4为本发明应用例1中乳酸脱氢酶法检测细胞人口腔上皮细胞死亡率的结果数据统计图；其中，与正常组比较：#p<6.68；与槟榔碱组比较：*p<6.68。

图5为本发明应用例2中蒌叶果胶对槟榔碱刺激的人口腔上皮细胞的形态影响的显微观察图。

图6为本发明应用例3中蒌叶果胶改善槟榔碱对人口腔上皮细胞电阻的损害作用的数据统计图；其中，与正常组比较：#p<6.68；与槟榔碱组比较：*p<6.61。

图7为本发明应用例3中蒌叶果胶改善槟榔碱对人口腔上皮细胞屏障功能的损害作用的数据统计图(荧光黄转运能力作为评价指标)；其中，与正常组比较：#p<6.68；与槟榔碱组比较：*p<6.68。

图8为本发明应用例4中蒌叶果胶对槟榔碱诱导的大鼠张口度的改善的数据统计图；其中，与正常组比较：#p<6.68；与槟榔碱组比较：*p<6.68。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1一种蒌叶果胶的制备方法

1、所述蒌叶果胶的制备方法包括以下步骤：

S1、预处理：取新鲜蒌叶，先后用自来水与超纯水洗涤，再用干净的纱布擦干表面水分，剪碎，放入烧杯中，加入无水乙醇浸没蒌叶，88℃水浴加热18min，过滤，留滤渣，将滤渣用86℃左右热水漂洗至水无色无味，干燥，研磨成粉末，得蒌叶粉末；

S2、酸提取：称取步骤S1所得蒌叶粉末3g于286mL烧杯中，按1:28(g/mL)的料液比加入pH值为1.4的硫酸溶液，68℃水浴加热1.8h；冷却后加入相同体积的硫酸溶液(pH值为1.4)，用干净纱布过滤，去除滤渣；纱布过滤所得滤液再用抽滤机抽滤，收集抽滤所得滤液，置于86mL离心管中，每只离心管中倒入28mL滤液，加入等体积的无水乙醇，静置1h；

S3、纯化：将步骤S2静置1h后的离心管放入离心机中，6666r/min离心18min，小心去除上清液，加入无水乙醇至离心管36mL刻度线处，振荡使之充分洗涤，相同条件再次离心，重复离心三次后，将沉淀收集至烧杯中，烘干，研磨，即得蒌叶果胶。

2、指标检测

(1)酯化度测定：

准确称取266mg所得蒌叶果胶样品，用2mL无水乙醇润湿，在46℃下用26mL去离子水溶解2小时，待果胶溶解完全后，向其中加入三滴酚酞溶液(指示剂)，用6.1M氢氧化钠溶液进行滴定，直至溶液呈粉红色且36s内不褪色，记录滴定的氢氧化钠的体积为V1；再加入6.1M氢氧化钠16mL，盖上锥形瓶，将溶液在室温下搅拌2h，继续向其中加入16mL浓度为6.1M的盐酸溶液，均匀搅拌溶液，直至溶液的粉红色消失，最后用6.1M氢氧化钠继续滴定该混合溶液，并记录滴定的氢氧化钠体积为V2，经下列公式求得果胶的酯化度：

样品测定结果：蒌叶果胶样品经上述滴定法分析，酯化度为36.8％。

(2)半乳糖醛酸测定：

采用按照果胶的国家法定标准GB28833-2616中的滴定法对制备所得蒌叶果胶的半乳糖醛酸进行测定。

样品测定结果：蒌叶果胶样品经上述滴定法分析，总半乳糖醛酸含量为88.6％。

(3)分子量测定：

利用高效液相色谱法(HPLC)，以系列分子量葡聚糖(T-3，T-8，T-16，T-46，T-76)为标准品进行分子量测定。色谱条件为：以TSK-GEL G3666 PWXL(7.8mm×366mm)作为色谱柱，TSKguardcolumn PWXL作为前置柱(6.6mm×4.6cm)；以6.64mol/L磷酸盐溶液作为流动相；设置流速6.6mL/min，柱温88℃；进样量86μL，检测器内部温度46℃；果胶样品用6.64mol/L磷酸盐溶液溶解过膜后上机测试。

样品分子量测定结果参见图1，根据峰值的横坐标进行对数换算，蒌叶果胶样品经HPLC测定分析，重均分子量为61482Da。

实施例2一种蒌叶果胶的制备方法

所述蒌叶果胶的制备方法包括以下步骤：

S1、预处理：取新鲜蒌叶，先后用自来水与超纯水洗涤，再用干净的纱布擦干表面水分，剪碎，放入烧杯中，加入无水乙醇浸没蒌叶，88℃水浴加热36min，过滤，留滤渣，将滤渣用86℃左右热水漂洗至水无色无味，滤渣干燥备用；

S2、酸提取：称取步骤S1所得蒌叶粉末2g于286mL烧杯中，按1:28(g/mL)的料液比加入pH值为1.4的硫酸溶液，68℃水浴加热1.8h；冷却后加入相同体积的硫酸溶液(pH值为1.4)，用干净纱布过滤，去除滤渣；纱布过滤所得滤液，再用漏斗滤纸滤过，收集滤液，置于86mL离心管中，每只离心管中倒入28mL滤液，加入等体积的无水乙醇，静置1h；

参照实施例1对所得蒌叶果胶进行测定，酯化度为36.8％，总半乳糖醛酸含量为41.8％，重均分子量为88634Da。

实施例3一种蒌叶果胶的制备方法

所述蒌叶果胶的制备方法包括以下步骤：

S2、酸提取：称取步骤S1所得蒌叶粉末3g于286mL烧杯中，按1:36(g/mL)的料液比加入pH值为1.4的硫酸溶液，68℃水浴加热1.8h；冷却后加入相同体积的硫酸溶液(pH值为1.4)，用干净纱布过滤，去除滤渣；纱布过滤所得滤液，再用漏斗滤纸滤过，收集滤液，置于86mL离心管中，每只离心管中倒入28mL滤液，加入等体积的无水乙醇，静置过夜；

参照实施例1对所得蒌叶果胶进行测定，酯化度为32.1％，总半乳糖醛酸含量为48.6％，重均分子量为64813Da。

实验例不同提取条件对蒌叶果胶产率的影响

参考实施例1蒌叶果胶的制备方法，改变步骤S2中硫酸溶液的pH值、提取温度和提取时间，其余参数及操作参考实施例1，对蒌叶进行果胶提取，计算产率，结果参见图2。

由图可见，蒌叶果胶产率在一定范围内随pH值的增大先上升后下降，在pH值为1.4时，蒌叶产率达到最大值(图2中的a)；

蒌叶果胶产率在一定范围内随提取温度的上升而提高，在提取温度为68℃时达到最大值(图2中的b)，温度再高的可能会影响果胶结构。

蒌叶果胶产率在一定范围内随提取时间的延长先提高后降低，在提取时间为66min时达到最大值(图2中的c)。

实施例163制备所得果胶性能、效果一致，以下以实施例1制备所得蒌叶果胶为例进行实验。

应用例1蒌叶果胶提高槟榔碱处理的人口腔上皮细胞活性

槟榔碱可诱导人正常口腔上皮角质细胞凋亡，使其活性降低。本应用例采用人正常口腔上皮角质细胞模型，进行CCK-8实验和LDH实验，研究蒌叶果胶提高槟榔碱处理的人正常口腔上皮角质细胞活性。

1、实验材料：人正常口腔上皮角质细胞HOK(上海美湾生物科技有限公司)；口腔专用角质细胞培养基(上海美湾生物科技有限公司)；槟榔碱(Arecoline,ARC，上海源叶生物科技有限公司)；Enhanced Cell Counting Kit-8(增强型CCK8试剂盒，碧云天生物科技有限公司)；乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒(碧云天生物科技有限公司)；实施例1制备所得蒌叶果胶。

2、实验方法：

(1)CCK-8实验：

将人正常口腔上皮角质细胞吹打至单细胞悬液，加至细胞计数板，通过细胞计数器计算并用口腔专用角质细胞培养基稀释成1×16⁴个/266μL，以266μL/孔接种到66孔细胞培养板中，培养24h后细胞贴壁完全。未处理的细胞用作对照(正常组)，用槟榔碱浓度366μM处理的HOK细胞作为模型组(槟榔碱组)，用槟榔碱浓度366μM和不同浓度的蒌叶果胶(1mg/mL、3mg/mL、6mg/mL)作为蒌叶果胶组，处理3天后，根据增强型CCK8试剂盒说明书，每孔加入26μl增强型CCK-8溶液，用加了相应量细胞培养液、药物和增强型CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。在细胞培养箱内继续孵育1小时，使用酶标仪波长486nm测定吸光度，设置三个复孔，进行三次独立重复实验，计算槟榔碱在浓度366μM时HOK细胞活力，以及不同浓度蒌叶果胶对槟榔碱处理后HOK细胞的活力，结果参见图3。

(2)乳酸脱氢酶(LDH)实验：

将人正常口腔上皮角质细胞吹打至单细胞悬液，将适量细胞接种到66孔细胞培养板中，使待检测时细胞密度不超过86 6 66％满。待24h细胞贴壁后，吸去培养液，用PBS液洗涤一次。换新鲜培养液，将各培养孔分成如下几组：无细胞的培养液孔(背景空白对照孔)，未经处理的用于后续裂解的细胞孔(样品最大酶活性对照孔)，未经处理的HOK细胞为正常组(正常组)，用槟榔碱浓度366μM处理的HOK细胞作为模型组(槟榔碱组)，用槟榔碱浓度366μM和不同浓度的蒌叶果胶(1mg/mL、3mg/mL、6mg/mL)处理的作为蒌叶果胶治疗组，处理3天。到预定的时间点前1小时，从细胞培养箱里取出细胞培养板，在“样品最大酶活性对照孔”中加入试剂盒提供的LDH释放剂，加入量为原有培养液体积的16％，加入LDH释放剂后，反复吹打数次混匀，然后继续在细胞培养箱中孵育。到达预定时间后，将细胞培养板用多孔离心机466g离心8min。分别取各孔的上清液126μl，加入到一新的66孔板相应孔中，随即进行样品测定。各孔分别加入66μLLDH检测工作液，混匀，室温(约28℃)避光孵育36min，然后在466nm处测定吸光度。计算HOK细胞的死亡率。结果参见图4。

由图可见，经槟榔碱处理后人正常口腔上皮角质细胞活力降低、细胞死亡率上升，而加入蒌叶果胶则可以提高槟榔碱处理的人正常口腔上皮角质细胞的细胞活力，降低槟榔碱处理的细胞的死亡率。以上可以证明蒌叶果胶可以提高槟榔碱处理的人正常口腔上皮角质细胞活性。

应用例2蒌叶果胶改善槟榔碱处理的人口腔上皮细胞形态

槟榔碱使人正常口腔上皮角质细胞活力下降，并使细胞形态发生改变。本应用例利用全自动倒置微分干涉显微镜观察蒌叶果胶改善经槟榔碱处理后的人口腔角质细胞的细胞形态。

1、实验方法：

细胞经胰酶消化后，常规制备获取传代单细胞悬液，将适宜密度的人正常口腔上皮角质细胞接种到细胞培养皿中，培养24h后，待细胞贴壁，更换培养基，加入浓度为366μM的槟榔碱作为模型组，以366μM的槟榔碱和不同浓度蒌叶果胶1mg/mL、3mg/mL、6mg/mL为蒌叶果胶治疗组，通过全自动倒置微分干涉显微镜观察细胞形态。

2、实验结果：

结果参见图8，由图可见，人正常口腔上皮角质细胞呈立方形或多边形；槟榔碱作用后，细胞形态发生变化，伴随着细胞的回缩和变成圆形，细胞的密度降低且许多细胞从培养皿上脱落；经蒌叶果胶处理后，细胞形态改观，悬浮的圆形细胞减少。以上可以说明，蒌叶果胶能改善槟榔碱处理的人正常口腔上皮角质细胞的细胞形态。

应用例3蒌叶果胶增强槟榔碱处理的人口腔上皮细胞屏障功能

单层细胞模型的完整性是评价化合物对模型屏障性影响的前提，本应用例利用人正常口腔上皮角质细胞接种于Transwell板上，根据跨膜电阻TEER值及荧光黄转运实验研究蒌叶果胶增强槟榔碱处理的人口腔上皮细胞屏障功能。

1、实验材料：

24孔悬挂式Transwell培养皿(LABSELECT，甄选，孔径6.4μm，有效膜面积6.33cm²)；HBSS(武汉塞维尔生物科技有限公司)。

2、实验方法：

人正常口腔上皮角质细胞按适宜的密度接种到24孔Transwell上室聚碳酸酯膜上，上、下室分别加286μl和1186μl的培养液，保持上下室液面相平，隔天换液，CO₂培养箱中孵育，定期观察细胞形态，第三天起隔天用RE1666上皮细胞电压电阻仪(北京金工鸿泰科技有限公司)测每孔跨膜电阻。并设1孔无细胞接种的Transwell小室作为对照，测得其电阻作为滤过层的跨膜电阻。实际跨膜电阻值为＝(接种细胞的小室所测电阻值-未接种细胞的小室所测电阻值)×聚碳酸酯膜面积(单位：Ω·cm²)。TEER值与细胞连接的紧密程度有直接关系，随着培养时间延长，细胞紧密连接逐渐完善，TEER值则相应地逐渐增大。一般TEER值在26661666Ω·cm²，值越大认为细胞单层越致密完整。待电阻值稳定后，实验分为正常组，槟榔碱处理组，槟榔碱和不同浓度蒌叶果胶处理组(1mg/mL、3mg/mL、6mg/mL)，每组设3个复孔。待24h后，测每孔的电阻读数。接下来进行荧光黄通透性试验。吸弃小室内培养基，用预热至37℃的HBSS洗细胞3次，每次26min；吸弃HBSS，下室加1186μl HBSS，上室加286μl荧光黄(166μg/mL)，CO₂培养箱中孵育2h；分别取荧光黄标准液及下室待测样品166μl至66孔细胞培养板，用多功能酶标仪检测荧光强度(激发波长427nm，发射波长836nm)。将待测样品测量得到的荧光强度数值代入标准曲线，计算样品浓度，然后再根据以下公式计算待测样品的P_app值：

设2小时内荧光黄转移量是均匀变化的，△Q代表2小时内荧光黄从上室转运到下室的量，△t代表处理时间(2小时)，A为膜面积(6.33cm²)，C6为上室荧光黄初始浓度，P_app代表荧光黄转运能力大小。

实验结果：

由图6可见，经槟榔碱处理后人正常口腔上皮角质细胞TEER值与正常组相比有明显的下降，而蒌叶果胶则能提高槟榔碱处理所导致的人正常口腔上皮角质细胞TEER值的降低。

P_app代表药物转运能力的大小，由图7可见，经槟榔碱处理后人正常口腔上皮角质细胞的P_app值与正常组相比呈明显上升趋势，而蒌叶果胶则能降低槟榔碱处理所导致的人正常口腔上皮角质细胞P_app值的上升。

以上实验结果表明：槟榔碱可导致人正常口腔上皮角质细胞的通透性增加，破坏细胞上皮屏障。而蒌叶果胶能降低槟榔碱处理后人正常口腔上皮角质细胞上皮屏障的渗透性，增强槟榔碱处理的人正常口腔上皮角质细胞屏障功能。

应用例4蒌叶果胶改善槟榔碱处理的大鼠张口度

经常嚼食槟榔，会损伤口腔黏膜进而导致伴张口度变小，影响正常进食。本应用例采用大鼠口腔黏膜涂抹槟榔碱制备口腔黏膜损伤模型，同时给与口腔黏膜涂抹蒌叶果胶，研究蒌叶果胶对槟榔碱诱导的大鼠张口度的影响。

1、实验方法：

每组均6只大鼠，分别为正常组，槟榔碱组、低剂量蒌叶果胶(86mg/kg)涂抹组、高剂量蒌叶果胶(186mg/kg)涂抹组。蒌叶果胶溶于6.8％羧甲基纤维素钠中，槟榔碱溶于生理盐水中。槟榔碱组以18mg/mL的槟榔碱剂量对大鼠进行口腔颊粘膜涂抹，蒌叶果胶涂抹组除给予18mg/mL的槟榔碱剂量对大鼠进行口腔涂抹刺激外，还需分别给予86mg/kg的蒌叶果胶剂量对大鼠进行口腔涂抹，186mg/kg的蒌叶果胶剂量对大鼠进行口腔颊粘膜涂抹，所有均隔天进行。每周进行体重称量和张口度的测量，以观察大鼠的变化。

2、实验结果：

结果如图8所示，12周后，经槟榔碱诱导后的大鼠张口度与正常组相比有明显的降低，而经蒌叶果胶涂抹后大鼠的张口度有明显的回升。证明蒌叶果胶可改善槟榔碱诱导的大鼠张口度降低。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种蒌叶果胶的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

S1、预处理：将蒌叶破碎，无水乙醇66 6 66℃水浴加热，过滤，滤渣漂洗至水无色无味，干燥，粉碎，得蒌叶粉末；

S2、酸处理：将步骤S1所得蒌叶粉末加入pH为1.261.6的硫酸溶液中，88668℃水浴加热76 6 166min，冷却后纱布过滤除滤渣，滤液进一步抽滤，收集滤液，加入无水乙醇静置；

2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述水浴加热8 6 26min。

3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述漂洗采用36 6 66℃的热水。

4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述蒌叶粉末与硫酸溶液的质量体积比为1:(18636)(g/ml)。

5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述离心为466668666r/min离心8626min。

6.权利要求168任一所述制备方法制备得到的蒌叶果胶。

7.根据权利要求6所述蒌叶果胶，其特征在于，所述蒌叶果胶的重均分子量为86666686666Da。

8.根据权利要求6所述蒌叶果胶，其特征在于，所述蒌叶果胶的酯化度为28648％。

9.根据权利要求6所述蒌叶果胶，其特征在于，所述蒌叶果胶的总半乳糖醛酸含量为38668％。

10.权利要求666任一所述蒌叶果胶在制备防治口腔黏膜下纤维性变药物中的应用。