CN112022906B - 荞麦壳非黄酮物质的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种荞麦壳非黄酮物质的制备方法，它包括：热水提取荞麦壳，得到BHE溶液；用D101大孔树脂吸附，用乙醇洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥，获得D101大孔树脂精制物；溶于15~20mL水，得到PBHE溶液，用AB‑8型大孔树脂吸附；以水冲洗；用洗脱剂洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥；重新溶于水，静置，过滤，除去不溶性杂质，将溶液加入到萃取装置中；加入有机溶剂，立即充分振荡，静置，分液，保留水层组分；浓缩，冷冻干燥，得到荞麦壳非黄酮物质；本发明优点：荞麦壳非黄酮物质具有较强的自由基清除活性和总抗氧化能力，对H2O2诱导的HepG2细胞氧化损伤有明显的细胞保护作用；具有抗糖尿病活性。

Description

荞麦壳非黄酮物质的制备方法
技术领域
本发明属于保健食品药品领域，具体涉及荞麦壳非黄酮物质的制备方法。
背景技术
荞麦（Fagopyrum esculentum），一种草本双子叶谷类作物，作为药食同源植物，具有很高的营养价值及经济价值。我国荞麦产量继俄罗斯之后，位居世界第二。荞麦中富含多种有营养价值的成分如淀粉、蛋白质、脂肪、维生素以及矿物质等，且含量高于大宗和小宗粮食，还含有许多有治疗功效的成分如黄酮、多酚、活性肽、脂肪酸、植物甾醇以及D-手性肌醇等。流行病学显示，经常食用荞麦可以有效地降低高血糖的发病率，可开发为绿色功能性食品。荞麦壳，作为荞麦加工中产生的含量最多的副产物，由于其具有清热明目作用，目前多做枕芯填充用。但荞麦壳中含有丰富的生物活性物质，如黄酮等，具有良好的药用功效，如不加以综合利用，将造成严重的资源浪费。
现有报道中，对于荞麦壳黄酮类物质的研究较多，但是荞麦壳中黄酮类物质并不是唯一具有良好功能活性的成分，其中的非黄酮物质也具有显著的抗蛋白质糖基化终末产物（Advanced Glycation End Products，AGEs）和抑制α-葡萄糖苷酶的活性，且含量很高，是非常值得关注的组分。
荞麦壳非黄酮的化学成分包括：色素、膳食纤维、原花青素、多糖、脂肪酸、矿物元素及有机酸等。荞麦壳由于其本身带有的颜色，常作为食品色素使用，是天然色素的来源之一。对于荞麦壳膳食纤维，研究最多就是其中水溶性膳食纤维和水不溶性膳食纤维的功能活性及提取工艺。水溶性膳食纤维主要调节糖脂代谢，减少血液中胆固醇含量，预防肥胖症；水不溶性膳食纤维则是具有促进肠道蠕动，促进水分吸收，治疗便秘等功效荞麦壳中富含的原花青素，属于活性多酚类化合物；现有报道说明了富含原花青素的荞麦及多种谷物的提取物表现出抗氧化，抗炎，抗糖尿病和抗癌等一系列生物活性，但大多数研究均在体外进行测定的，并且提取物中的非原花青素成分也发挥了一定的生物活性作用。关于荞麦壳非黄酮类化合物，特别是水溶性成分的研究很少。
在Ⅰ型与Ⅱ型糖尿病（Diabetes mellitus）中，Ⅱ型糖尿病在人群中更为普遍，还易患多种并发症，如眼睛、神经、肾脏、心脑血管等部位的慢性病变。
糖尿病及其并发症的产生，最主要的诱因就是氧化应激。活性氧（ROS）会导致胰岛β细胞损伤和降低外周组织对胰岛素的敏感性，并通过NF-κB、P38、MAKP、JNK/SAKP、AGE/AGER、蛋白激酶C(PKC)等途径抑制胰岛素的信号传导。过高水平的自由基通过葡萄糖氧化，蛋白质的非酶糖基化以及糖基化蛋白质的氧化降解和抗氧化防御机制的减弱导致一些细胞器和标志酶的损坏，脂质过氧化作用的增强以及胰岛素抵抗的发生，从而促进糖尿病及其并发症的发展。血糖的持续增高反过来也会造成ROS的过量产生。糖尿病与氧化应激之间互为影响，相互诱导，对机体的健康产生许多不利影响。
发明内容
本发明目的是提供一种荞麦壳非黄酮物质的制备方法。
荞麦壳非黄酮物质，它是由下述制备方法制备的，它包括：
1）荞麦壳除杂，干燥、粉碎，热水提取，得到BHE溶液；
2）用D101大孔树脂吸附步骤1）的BHE溶液，用65~75%乙醇洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥，获得D101大孔树脂精制物；
3）步骤2）所得的D101大孔树脂精制物溶于15~20mL水，得到PBHE溶液，用AB-8型大孔树脂吸附；以1~3BV/h流速用2~3倍柱体积的水冲洗，收集洗脱液，用于循环使用；以1~3BV/h流速的3BV纯水洗脱，收集洗脱液，干燥，得到粗提的BHNF-1；
4）再以4BV的1~10%乙醇洗脱，收集洗脱液，干燥，得到粗提的BHNF-2；
5）将粗提的BHNF-1、BHNF-2，分别重新溶于水，静置，过滤，除去不溶性杂质，将溶液加入到萃取装置中；加入氯仿，立即充分振荡，静置，分液，保留水层组分；加入乙酸乙酯，立即充分振荡，静置，分液，保留水层组分；加入正丁醇，立即充分振荡，静置，分液，保留水层组分；将水层组分浓缩，冷冻干燥，得到荞麦壳非黄酮物质BHNF-1和BHNF-2；
步骤2）所述的乙醇浓度为70%；
步骤1）所述的热水，用量为荞麦壳重量的40~60倍；
步骤4）所述的静置，为静置至液体分层且界线清晰。
荞麦壳非黄酮物质在制备治疗糖尿病药物的应用。
荞麦壳非黄酮物质在制备抗氧化类药物的应用。
本发明提供了一种荞麦壳非黄酮物质的制备方法，它包括：1）荞麦壳除杂，干燥、粉碎，热水提取，得到BHE溶液；2）用D101大孔树脂吸附，用65~75%乙醇洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥，获得D101大孔树脂精制物；3）步骤2）所得的D101大孔树脂精制物溶于15~20mL水，得到PBHE溶液，用AB-8型大孔树脂吸附；以1~3BV/h流速用2~3倍柱体积的水冲洗，收集洗脱液，用于循环使用；以1~3BV/h流速的3BV纯水洗脱，收集洗脱液，干燥，得到粗提的BHNF-1；4）再以4BV的1~10%乙醇洗脱，收集洗脱液，干燥，得到粗提的BHNF-2；5）将粗提的BHNF-1、BHNF-2，分别重新溶于水，静置，过滤，除去不溶性杂质，将溶液加入到萃取装置中；加入氯仿，立即充分振荡，静置，分液，保留水层组分；加入乙酸乙酯，立即充分振荡，静置，分液，保留水层组分；加入正丁醇，立即充分振荡，静置，分液，保留水层组分；将水层组分浓缩，冷冻干燥，得到荞麦壳非黄酮物质BHNF-1和BHNF-2；本发明优点：荞麦壳非黄酮物质具有较强的自由基清除活性和总抗氧化能力，对H2O2诱导的HepG2细胞氧化损伤有明显的细胞保护作用；荞麦壳提取物中具有显著抗氧化活性和抗糖尿病活性的非黄酮水溶性物质，且发现天然产物分离纯化过程中低成本、高得率的混合成分的功能活性要高于其中的单体化合物。
附图说明
图1 荞麦壳非黄酮物质的全波长扫描结果；
图2 荞麦壳非黄酮物质的红外光谱分析谱图；
图3 荞麦壳非黄酮物质的自由基清除活性；（A）•OH自由基，（B）
Figure 350186DEST_PATH_IMAGE001
•自由基，（C）DPPH•自由基；
图4 荞麦壳非黄酮物质的总抗氧化能力；（A）FeSO4·7H2O的标准曲线，（B）总抗氧化能力；
图5 荞麦壳非黄酮物质对HepG2细胞的毒性作用；
图6 不同浓度的H2O2对HepG2细胞的损伤作用；
图7 荞麦壳非黄酮物质对H2O2诱导的HepG2细胞损伤的改善作用（A）细胞保护活性，（B）细胞修复活性；
图8损伤实验HepG2细胞的形态观察；a对照组，b 模型组，c BHNF-1组，d BHNF-2组；
图9 荞麦壳非黄酮物质对H2O2诱导的HepG2细胞内ROS水平的影响；a 对照组，b 模型组，c BHNF-1组，d BHNF-2组；
图10 荞麦壳非黄酮物质对HepG2细胞胞内氧化应激因子的影响；
图11 荞麦壳非黄酮物质对HepG2细胞胞外氧化应激因子的影响；
图12 荞麦壳非黄酮物质的抗糖尿病活性；
图13 荞麦壳非黄酮物质对HepG2细胞葡萄糖消耗的影响；
图14 不同浓度的葡萄糖对HepG2细胞的损伤作用；
图15 荞麦壳非黄酮物质对高糖诱导的HepG2细胞损伤的改善作用；（A）细胞保护活性，（B）细胞修复活性；
图16 保护组HepG2细胞的形态观察；a 对照组，b 模型组，c BHNF-1组，d BHNF-2组；
图17 荞麦壳非黄酮物质对高糖诱导的HepG2细胞内ROS水平的影响；a 对照组，b模型组，c BHNF-1组，d BHNF-2组；
图18 荞麦壳非黄酮物质对HepG2细胞胞内氧化应激因子的影响；
图19 荞麦壳非黄酮物质对HepG2细胞胞外氧化应激因子的影响。
具体实施方式
实施例1 荞麦壳非黄酮组分的制备
一、样品的处理
选用天然荞麦壳，除杂，干燥、粉碎，过0.25 mm(60目)筛；准确称取1g荞麦壳粉，置于50 mL离心管中，加热水保温提取水溶性成分，抽滤，滤液定容至100mL，得到BHE溶液，保存备用。
二、荞麦壳非黄酮组分的提取
1、大孔树脂的预处理
分别将D101大孔树脂、AB-8大孔树脂用95%乙醇浸泡24 h，对其进行初步除杂。滤去乙醇，用蒸馏水洗至无味。依次用4% HCl和4% NaOH溶液浸泡24h，每次浸泡结束后用蒸馏水洗至pH 7.0，最后浸泡于95%乙醇中，保存备用。
2、D101大孔树脂一次纯化
处理好的D101大孔树脂湿法装柱，待柱料平稳后，以2 mL/min流速加入BHE溶液100mL，待BHE溶液吸附后，蒸馏水以4BV/h流速洗去未吸附的BHE样品，最后用70%乙醇以2BV/h流速洗脱至流出液无颜色，洗脱液冷冻干燥后获得D101大孔树脂精制物（purifiedbuckwheat hull extract，PBHE）备用。
3、AB-8大孔树脂二次纯化
上一步骤得到的D101大孔树脂精制物，用20mL水全部溶解，得到PBHE溶液；处理好的AB-8型大孔树脂湿法装柱；待柱料平稳后，以0.5BV/h流速加入20mL PBHE溶液；上样完成后，先以2BV/h流速用2BV（2倍柱体积）的纯水冲洗，收集洗脱液，用于循环使用；以2BV/h流速的3BV纯水洗脱，收集洗脱液，干燥，得到粗提的BHNF-1；再以4BV的10%乙醇洗脱，收集洗脱液，干燥，得到粗提的BHNF-2。
实施例2 荞麦壳非黄酮物质的分离纯化
一、分离纯化
根据相似相溶原理，利用溶质在不同有机溶剂中的溶解度不同，将荞麦壳非黄酮组分中混有的有机杂质分离出来；主要的有机试剂的极性大小顺序为：水（最大）>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>四氢呋喃>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>异丙醚>二氯甲烷>三氯甲烷（氯仿）>溴乙烷>苯>四氯化碳>正己烷>煤油（最小）；本实验选择对于大多数有机物有效的氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水进行三相萃取，并且根据极性大小，依次采用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇，从而达到协同萃取的效果。
由于实施例1得到的荞麦壳非黄酮组分中有一定黄酮类物质残留，因此进行萃取；将两个粗提的荞麦壳非黄酮组分（组分1和2）分别溶于100mL蒸馏水中，静置30min使其充分溶解，过滤去除其中不溶性杂质，加入到分液漏斗中；用于萃取有机溶质的溶剂，即氯仿、乙酸乙酯、正丁醇，依次加入到盛有溶液的分液漏斗中立即充分振荡，使溶质与溶剂之间充分接触，静置分液漏斗，待液体分层且界线清晰后，再进行分液，重复上述操作直至溶质萃取完全，保留各有机溶剂及水层组分；经旋转蒸发仪浓缩并去除其中的溶剂后，经冷冻干燥，得到水层组分分别为BHNF-1组分和BHNF-2组分，即荞麦壳非黄酮物质；计算得率的公式如下：
Figure 847419DEST_PATH_IMAGE003
其中M溶质是氯仿层、乙酸乙酯层、正丁醇层和水层的溶质质量（mg），M样品是样品的总质量（mg）。
二、荞麦壳非黄酮物质的得率及总回收率
BHNF-1组分的含量及得率如表1所示；BHNF-1经逐级萃取后，氯仿层组分、乙酸乙酯层组分、正丁醇层组分的总得率约为24%，余下的水层组分即BHNF-1组分的含量为1.41g/2.5g，得率为56.4%，且总回收率为80%；
Figure 830419DEST_PATH_IMAGE004
BHNF-2组分的含量及得率如表2所示；BHNF-2组分经逐级萃取后，氯仿层组分、乙酸乙酯层组分、正丁醇层组分的总得率约为28%，余下的水层组分即BHNF-2组分的含量为2.27g/2.5g，得率为62.4%，且总回收率为90.8%，说明荞麦壳非黄酮组分在分离纯化过程中仅混有少量的有机杂质，逐级萃取后得到更加纯化的荞麦壳非黄酮物质BHNF-1和BHNF-2，有利于进行后续的定性分析及功能活性试验。
Figure 694470DEST_PATH_IMAGE005
实施例3 荞麦壳非黄酮物质的成分测定
一、显色反应
采用三氯化铁反应，将BHNF-1组分和BHNF-2组分分别配制成1mg/mL的样品溶液，分别加入三氯化铁溶液进行反应，观察溶液颜色变化。
采用盐酸-镁粉反应，将BHNF-1组分和BHNF-2组分分别配制成1 mg/mL的样品溶液，分别加入数滴浓盐酸及少量镁粉进行反应，观察溶液颜色变化。
结果：三氯化铁显色反应中BHNF-1组分和BHNF-2组分的溶液颜色均变深，呈棕黑色，说明荞麦壳非黄酮成分可能含有酚类成分或鞣质类成分。而在盐酸-镁粉试验中，BHNF-1组分和BHNF-2组分仅呈现样品本身的颜色，并无明显的颜色变化，说明其中无黄酮类化合物的存在。
二、溶解度测定
参照胡洁芳在《皇菊水溶性色素纯化、成分分析及其体外α-葡萄糖苷酶抑制活性研究》的方法，测定荞麦壳非黄酮成分的溶解度；取BHNF-1组分和BHNF-2组分各0.1g，分别加入等体积的不同溶剂（蒸馏水，DMSO，甲醇，乙醇）10mL，观察样品在不同溶剂中的溶解情况。
荞麦壳非黄酮成分的溶解度结果，如表3所示；BHNF-1组分和BHNF-2组分易溶于水，微溶于DMSO，不溶于甲醇或乙醇，即荞麦壳非黄酮成分与极性大的溶剂有很好的相溶性，说明BHNF-1组分和BHNF-2组分是水溶性好，极性较大的非黄酮物质。
Figure 86006DEST_PATH_IMAGE006
三、全波长扫描
波长扫描的目的在于选定一个波长范围，对样品进行测量，通过反映样品在不同波长下的吸光度值，确定出峰位置，判断样品的性质。
取少量BHNF-1组分和BHNF-2组分，使用蒸馏水溶解配成1mg/mL，蒸馏水作为空白溶剂对照，使用酶标仪进行全波长扫描，波长范围为220~1000 nm，扫描间距为1nm，扫描次数为3。以波长为横坐标，对应的吸光度值为纵坐标，绘制样品的全波长扫描曲线。
由于黄酮类化合物具有C6-C3-C6的基本结构，因此大多数黄酮类化合物的紫外光谱是由两个特征吸收峰组成的，同时出现在220 ~ 280 nm和300 ~ 400 nm范围内。与黄酮标准品芦丁的紫外光谱进行比较，荞麦壳非黄酮成分在220 ~ 1000 nm范围内经酶标仪扫描分析的结果如图1所示，BHNF-1组分和BHNF-2组分的最大吸收波长分别是309nm和311nm，扫描图谱具有明显差异；确定不是黄酮类化合物的特征吸收；BHNF-1组分和BHNF-2组分中含有羟基、羰基、糖类成分的特征吸收峰，还含有甲基、亚甲基、酚类等化学基团，推测其中含有多糖、色素、鞣质等物质，并且BHNF-2组分的吸收峰在1700 cm-1 ~ 1400 cm-1范围内比BHNF-1组分多，为芳香基团，推测BHNF-2组分在活性检测中要优于BHNF-1组分。通过上述试验，为荞麦壳非黄酮成分进一步的结构鉴定提供了基础数据。
四、红外光谱测定
红外光谱是物质定性的重要方法之一，通过红外吸收峰的位置与强度可以反映分子结构上的特点，即许多化学键都有特征波数，可以用来鉴别化合物的类型或确定其化学基团，具有特征性高、分析速度快、所需样品少、操作简便等优点。
参照董文明等人在《普洱茶茶褐素中2种水溶性成分研究》的方法，将样品和KBr分别准确称量2mg和200mg，BHNF-1组分和BHNF-2组分分别与KBr以1:100的比例在红外灯下研磨均匀，经压片机压片1min成半透明状薄片后，于红外光谱仪上扫描分析，扫描范围400~4000cm-1，分辨率为4 cm-1，扫描次数为16。先进行背景扫描，再扫描样品，得到红外光谱数据，以波数为横坐标，强度为纵坐标，绘制样品的红外光谱曲线。
结果：由于天然黄酮类化合物中含有烃氧基、甲氧基、异戊烯氧基和羟基等特征基团，因此黄酮类化合物在红外光谱上的特征峰为在3100~3460cm-1、1600~1640 cm-1，以及1372、1242、1058 cm-1范围的振动峰。而BHNF-1组分和BHNF-2组分在400 ~ 4000 cm-1的范围内，经红外光谱仪扫描分析，出峰结果如图2所示。与其他红外光谱数据相比，首先BHNF-1组分的红外光谱吸收峰为3393 cm-1、2925 cm-1、2353 cm-1、1712 cm-1、1386 cm-1、1048 cm-1、825 cm-1、766 cm-1、618 cm-1、534 cm-1，其中3393 cm-1为O-H伸缩振动，是羟基的特征吸收峰；2925 cm-1为甲基（-CH3）和亚甲基（-CH2-）的C-H反对称伸缩振动；1712 cm-1为C=O伸缩振动，是羰基的特征吸收峰；1386cm-1为C-H弯曲振动、1048cm-1为C-O伸缩振动；825 cm-1、766 cm-1为糖类成分的特征峰，以及在2353 cm-1、618 cm-1、534 cm-1处也具有较弱的吸收峰，说明BHNF-1组分是含有羟基、羰基及多糖基团等的高分子物质。其次BHNF-2组分的红外光谱吸收峰为3411 cm-1、2925 cm-1、2374 cm-1、1613 cm-1、1524 cm-1、1444 cm-1、1377 cm-1、1283 cm-1、1249 cm-1、1042 cm-1、819 cm-1、767 cm-1、617 cm-1、578 cm-1、533 cm-1，其中3411 cm-1为羟基O-H伸缩振动吸收峰；2925 cm-1为甲基（-CH3）和亚甲基（-CH2-）的C-H反对称伸缩振动峰；1613cm-1为含酚羟基的芳环骨架伸缩振动峰；1524cm-1、1444 cm-1为芳香环骨架振动吸收峰；1377cm-1可能为-C-CH3和-CH-(CH3)2基团；1283cm-1为O-H键的弯曲振动峰；1249cm-1、1042cm-1为C-O伸缩振动；819cm-1、767cm-1为糖环特征峰，以及在2374cm-1、617cm-1、578cm-1、533cm-1处也具有较弱的吸收峰，说明BHNF-2组分含有羟基、羰基、糖类及芳香基团等，推测其为多糖、色素、鞣质类等物质。
BHNF-1组分和BHNF-2组分中含有羟基、羰基、糖类成分的特征吸收峰，还含有甲基、亚甲基、酚类等化学基团，推测其中含有多糖、色素、鞣质等物质，并且BHNF-2组分的吸收峰在1700 cm-1 ~ 1400 cm-1范围内比BHNF-1组分多，为芳香基团，推测BHNF-2组分在活性检测中要优于BHNF-1组分。通过上述试验，为荞麦壳非黄酮成分进一步的结构鉴定提供了基础数据。
实施例4 荞麦壳非黄酮成分的抗氧化活性实验
材料来源：芦丁（标准品≥98%）购于南京景竹生物科技有限公司，抗坏血酸购于山东丰泰生物科技有限公司，HepG2细胞由吉林农业大学食品科学与工程学院提供。
测定经分离纯化得到的荞麦壳非黄酮物质BHNF-1、BHNF-2的抗氧化活性，具体如下：
一、荞麦壳非黄酮成分的自由基清除实验
1、清除羟自由基（•OH）能力的测定
利用Fenton反应生成的•OH与水杨酸反应生成2,3-二羟基苯甲酸的原理，采用水杨酸比色法[78]测定荞麦壳非黄酮成分对•OH的清除作用，芦丁和抗坏血酸作为阳性对照。试剂准备：3 mM FeSO4溶液，6 mM水杨酸-乙醇溶液和9 mM H2O2溶液；样品准备：浓度分别为125，250，500和1000 μg/mL的样品溶液。
反应体系1 mL，将样品溶液100 μL，FeSO4溶液300 μL，水杨酸-乙醇溶液300 μL及H2O2溶液300 μL依次加入1.5 mL离心管中，迅速振荡混匀后放入恒温水浴锅中，（37 ±0.1）°C水浴反应15 min，取出并用流水冷却，2000 r/min离心10 min。取上清液200 μL加入96孔板中并通过酶标仪在510 nm波长处测定其吸光度。每组样品做三次平行实验。计算公式如下：
Figure 111730DEST_PATH_IMAGE008
其中Ai为实验组；Aj为颜色对照组，用蒸馏水代替H2O2溶液；Ao为空白对照组，用蒸馏水代替样品。
2、清除超氧阴离子自由基
Figure RE-389054DEST_PATH_IMAGE007
能力的测定
利用邻苯三酚在碱性条件下迅速自氧化产生
Figure RE-137567DEST_PATH_IMAGE008
和有色中间物质的原理，采用邻苯三酚自氧化法[79]测定荞麦壳非黄酮成分对
Figure RE-350DEST_PATH_IMAGE009
的清除作用，芦丁和抗坏血酸作为阳性对照。试剂准备：50 mM Tris-HCl缓冲溶液（pH = 8.2，现用现配），25 mM邻苯三酚溶液和8mol/L的HCl溶液（其中Tris-HCl缓冲溶液和邻苯三酚溶液在25°C下预热20 min）；样品准备：浓度分别为125，250，500和1000 μg/mL的样品溶液。
反应体系200 μL，将样品溶液40 μL，Tris-HCl缓冲溶液120 μL和邻苯三酚溶液20μL依次加入96孔板中并迅速混匀，室温反应5 min后，加入8 mol/L HCl溶液20 μL来终止反应，并快速测定其在420 nm波长处的吸光度。每组样品做三次平行实验。计算公式如下：
Figure 354755DEST_PATH_IMAGE014
其中Ai为实验组；Aj为颜色对照组，用蒸馏水代替邻苯三酚溶液；Ao为空白对照组，用蒸馏水代替样品。
3、清除二苯基苦基苯肼自由基（DPPH•）能力的测定
利用DPPH溶于乙醇溶液呈紫色的原理，采用二苯基苦基苯肼法测定荞麦壳非黄酮成分对DPPH•的清除作用，芦丁和抗坏血酸作为阳性对照。试剂准备：80 μg/mL DPPH-乙醇溶液；样品准备：浓度分别为2.5，12.5，25和125 μg/mL的样品溶液。
反应体系200 μL，将样品溶液50 μL和DPPH-乙醇溶液150 μL加入96孔板中并混匀，在室温条件下避光反应30 min后，测定其在517 nm波长处的吸光度。每组样品做三次平行实验。计算公式如下：
Figure 295029DEST_PATH_IMAGE016
其中Ai为实验组；Aj为颜色对照组，用无水乙醇代替DPPH-乙醇溶液；Ao为空白对照组，用蒸馏水代替样品。
结果：自由基的过量产生会损伤机体的组织和细胞，添加抗氧化剂可以抑制自由基的产生或阻断其与底物的氧化偶联，在这种情况下该物质的自由基清除活性基于自由基或氧化产物的含量进行检测。本文采用羟自由基（•OH）体系，超氧阴离子自由基
Figure 21677DEST_PATH_IMAGE017
体系，二苯基苦基苯肼自由基（DPPH•）体系对荞麦壳非黄酮成分的抗氧化活性进行测定。抗坏血酸，又称维生素C，公认的高效抗氧化剂，具有很强的抗氧化能力；芦丁，主要的黄酮类化合物之一，并且在荞麦壳中含量丰富，也具有很强的抗氧化活性，因此选取抗坏血酸和芦丁作为阳性对照。
l 如图3A所示，荞麦壳非黄酮成分的•OH清除率在125~1000 g/mL的浓度范围内，随着浓度的增加而显著增大，体现出良好的量效关系。BHNF-1组分和BHNF-2组分的IC50值分别为313.63 ±7.64 μg/mL和365.41 ± 9.60 μg/mL，虽略低于阳性对照组芦丁和抗坏血酸，但也体现出其良好的•OH清除能力。如图3B所示，荞麦壳非黄酮成分清除
Figure 654784DEST_PATH_IMAGE018
的能力也呈现出浓度依赖性，即随着浓度的增大清除率也明显增加，BHNF-1组分和BHNF-2组分的IC50值分别为1193.60 ± 82.25 μg/mL和1123.51± 152.08μg/mL，与其良好的•OH清除能力相比，对
Figure 464784DEST_PATH_IMAGE018
的清除能力明显较低，这可能是由于荞麦壳非黄酮成分对不同自由基的敏感度不同所导致的。如图3C所示，荞麦壳非黄酮成分对DPPH•的清除活性，在125μg/mL浓度下均达到75%以上，BHNF-1组分和BHNF-2组分的IC50值分别为28.63 ± 0.82 μg/mL和20.66 ±0.20 μg/mL，体现出高敏感度的DPPH•清除活性。
总体上，BHNF-1和BHNF-2组分的自由基清除活性，虽然在同一浓度下低于阳性对照组芦丁和抗坏血酸，但也具有较强的自由基清除能力。
二、总抗氧化能力（T-AOC）的测定
通过T-AOC试剂盒（微板法）评估荞麦壳非黄酮成分的总抗氧化能力，具体操作按试剂盒说明书进行。该方法基于样品中Fe3+-TPTZ还原为Fe2+-TPTZ，并且在酸性pH下呈现蓝色的特性，利用FRAP法测定其总抗氧化能力，芦丁和抗坏血酸作为阳性对照。所用试剂均由试剂盒提供，样品准备：浓度为250 μg/mL的样品溶液。
反应体系185μL，将样品溶液5μL和FRAP工作溶液（试剂混合液）180 μL加入96孔板中并混匀，在37°C下水浴反应5 min后，测定其在593 nm波长处的吸光度。每组样品做三次平行实验。通过0.15 ~ 1.5 mM FeSO4·7H2O溶液之间的线性关系绘制标准曲线，总抗氧化能力用mmol FeSO4·7H2O当量/g来表示，简写为mmol FE/g。
结果：采用FRAP法可以排除一些内源性的干扰因素，从而更准确全面地评价荞麦壳非黄酮成分的总抗氧化能力。以FeSO4·7H2O的OD值为横坐标，质量浓度为纵坐标，得到FeSO4·7H2O标准曲线，如图4A所示，方程为Y = 3.7208X-0.3275，R2 = 0.9967。
如图4B所示，根据标准曲线方程计算得出，BHNF-1组分和BHNF-2组分的总抗氧化能力分别为，略低于阳性对照组芦丁（45.02± 0.16 mmol FE/g）和抗坏血酸（46.10 ±0.28 mmol FE/g）。由此，可以得出结论：荞麦壳非黄酮成分具有较强的总抗氧化能力。
三、细胞生物学法测定抗氧化活性
1、细胞培养
按细胞培养的常规方法，进行细胞复苏，传代，冻存等基本操作；其中，完全培养基的配制比例为：DMEM培养基：FBS：双抗 = 89:10:1，细胞冻存液的配制比例为：DMEM培养基：FBS：DMSO = 6:3:1。
2、毒性试验
取处于对数生长期的HepG2细胞进行传代并稀释至细胞密度为2×105个/mL时接种于96孔板中，每孔100μL，培养24h至细胞贴壁于细胞培养箱中。吸出培养基，加入不同浓度的用无血清培养基（DMEM培养基：双抗=99:1）稀释的样品溶液（50，100，200，500和1000μg/mL），每孔100μL，继续培养细胞24h，所述样品分别为BHNF-1和BHNF-2组分；弃培养液，每孔加入100μL 0.5mg/mL MTT溶液，37°C作用细胞4h后，每孔加入150μL DMSO，在酶标仪中振荡10 min，使结晶全部溶解，于490nm波长处测定其吸光度。每组样品做6个复孔，计算细胞存活率，公式如下：
Figure 943170DEST_PATH_IMAGE020
其中A1为不同浓度样品组的吸光度；A2为对照组的吸光度，用无血清培养基代替样品溶液；A0为空白组的吸光度。
结果：利用活细胞中线粒体酶活性的定量反应来确定存活细胞的数目及活力的MTT法来测定荞麦壳非黄酮成分对HepG2细胞的毒性作用，结果如图5所示。
荞麦壳非黄酮物质对HepG2细胞无毒性作用，反而有一定的增殖作用；BHNF-1组分在50~1000 μg/mL的浓度范围内，细胞存活率随浓度的增加呈现增大的趋势，而且细胞存活率均在100%以上，说明BHNF-1组分无毒性作用且有一定的增殖作用。BHNF-2组分在50~200μg/mL的浓度范围下，细胞存活率随浓度的增加而增加，而在200~1000μg/mL的浓度范围时则呈现下降趋势，500~1000μg/mL时下降尤为明显，但总体上细胞存活率均在80%以上，说明BHNF-2组分无明显毒性作用且低浓度下有一定的增殖效果。与荞麦壳非黄酮物质形成鲜明对比的是，阳性对照组芦丁和抗坏血酸对细胞有明显的毒性作用，即在浓度为50~1000μg/mL时细胞存活率呈剂量依赖性降低；因此，选取低浓度50μg/mL作为后续试验的加样浓度。
3、H2O2浓度的筛选
H2O2作为重要的活性氧之一，具有极易透过细胞膜、易获得且性质相对稳定的特点，能与细胞内铁离子生成高活性自由基，从而通过一系列反应产生氧化应激，已被广泛用于研究多种生物活性物质改善氧化应激能力的模型。HepG2细胞作为人源的肝癌细胞，与正常的肝细胞形态及生理状态相似，且更易于体外培养，细胞活力较好，常用于不同功能的模型建立。因此，本研究采用H2O2诱导HepG2细胞建立细胞氧化损伤模型；
同上述毒性实验的操作，使HepG2细胞培养至贴壁；吸出培养基，加入不同浓度的H2O2稀释液（1，2，3.5，5和10 mM，用无血清培养基稀释）于96孔板中，每孔100 μL，继续诱导细胞4 h，弃培养液，每孔加入100 μL 0.5 mg/mL MTT溶液，37°C作用细胞4 h后，每孔加入150 μL DMSO，在酶标仪中振荡10 min，使结晶全部溶解，于490 nm波长处测定其吸光度。每组样品做6个复孔，通过测定细胞存活率，来选择后续H2O2诱导的细胞氧化损伤模型的建模浓度。计算细胞存活率的公式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE021
其中A1为不同浓度H2O2处理组的吸光度；A2为对照组的吸光度，用无血清培养基代替H2O2溶液；A0为空白组的吸光度。
结果：如图6所示，细胞存活率随H2O2的浓度的增加而显著下降，在1 ~ 10 mM的浓度范围内呈剂量依赖性。细胞存活率分别为97.67 ± 2.96%（1 mM），91.56 ± 3.49%（2mM），51.39 ± 2.03%（3.5 mM），23.43 ± 6.14%（5 mM），4.67 ± 1.17%（10 mM）。根据细胞的半数抑制浓度，可以得出细胞存活率约为50%时，对应的H2O2浓度为3.5 mM，此浓度下可以产生适当的氧化应激损伤，因此选取该浓度作为H2O2诱导HepG2细胞氧化损伤的建模浓度。
4、对细胞损伤的改善作用的测定
对细胞损伤的保护作用的测定：在96孔板中，待细胞培养至贴壁后，吸出培养基，先加入100 μL样品溶液保护细胞20 h，再加入100 μL一定浓度的H2O2溶液诱导细胞4 h，采用MTT法测定细胞存活率；
对细胞损伤的修复作用的测定：在96孔板中，待细胞培养至贴壁后，吸出培养基，先加入100 μL一定浓度的H2O2溶液诱导细胞氧化损伤4 h，再加入100 μL样品溶液修复细胞20 h，同样采用MTT法测定细胞存活率；
所述样品分别为BHNF-1和BHNF-2组分。
结果：荞麦壳非黄酮成分对H2O2诱导的HepG2细胞损伤的保护作用，结果如图7A所示。与对照组相比，模型组的细胞存活率为57.88 ±4.41%，细胞活力显著降低（P < 0.05）。与模型组相比，预先加入BHNF-1组分和BHNF-2组分处理的细胞存活率分别为91.35 ±2.46%和82.50 ±4.98%，细胞活力明显提高（P < 0.05），说明荞麦壳非黄酮成分可以保护HepG2细胞免受H2O2诱导的氧化损伤。而阳性对照组芦丁和抗坏血酸对H2O2诱导的HepG2细胞损伤也具有一定的保护作用，但效果明显低于荞麦壳非黄酮成分。HepG2细胞的形态变化如图8所示，对照组的细胞形态呈现不规则的梭形，细胞轮廓清晰，视野内分布均匀（图8a）；而模型组的细胞仅用H2O2处理，细胞形态发生明显变化，细胞轮廓模糊，细胞间隙变大，无明显细胞结构，视野内分布不均，有部分细胞死亡（图8b）；与模型组相比，预先加入BHNF-1组分和BHNF-2组分处理的细胞，在形态和数量上均有一定的恢复（图8c,d）。因此，从细胞存活率和细胞形态数目变化两方面同时表明，荞麦壳非黄酮成分对H2O2诱导的HepG2细胞氧化损伤有明显的保护作用。
荞麦壳非黄酮成分对H2O2诱导的HepG2细胞损伤的修复作用，结果如图7B所示；与对照组相比，模型组的细胞存活率为54.99 ±1.20%，细胞活力显著降低（P < 0.05）。与模型组相比，在3.5 mM H2O2诱导细胞氧化损伤后加入BHNF-1组分和BHNF-2组分处理的细胞存活率分别为55.99 ±1.88%和54.19± 1.51%，细胞活力无显著性差异（P > 0.05），阳性对照组芦丁和抗坏血酸的效果类似，说明荞麦壳非黄酮成分对H2O2诱导的HepG2细胞氧化损伤无修复作用。因此，后续试验仅对细胞保护活性进行进一步研究。
5、细胞内ROS的测定
使用活性氧（ROS）试剂盒来测定细胞内ROS水平。将处于对数生长期的HepG2细胞以1×105 个/mL的细胞密度接种在24孔板中，培养至细胞贴壁后，吸出培养基。先用100 μL样品溶液预处理细胞20 h，再通过100 μL一定浓度的H2O2溶液诱导细胞4 h，弃去H2O2溶液，用PBS洗涤2次，将10 µM 的DCFH-DA添加到每个孔中，并继续培养40 min。再用PBS洗涤2次，通过荧光倒置显微镜进行观察。
然后通过胰酶消化，将细胞收集在1.5 mL离心管中，用无血清培养基洗涤2次，并重悬于PBS中，用荧光酶标仪在激发波长485 nm和发射波长525 nm下测定其荧光强度，并计算其相对荧光强度。计算公式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE023
其中FL1为不同样品处理组的荧光强度；FL0为对照组的荧光强度，未加样品和H2O2溶液处理（仅含细胞）。
结果：通过检测细胞内荧光物质的荧光强度来间接反映细胞内ROS的生成量，进一步验证荞麦壳非黄酮成分的细胞抗氧化作用。如图9所示，经H2O2处理细胞4 h，模型组细胞的荧光强度明显升高（P < 0.05），与对照组相比，荧光强度增加了3倍，说明细胞内ROS大量合成，产生氧化应激。而BHNF-1组分和BHNF-2组分对细胞进行预处理，荧光强度显著降低（P < 0.05），有效地抑制了ROS的生成，这与在荧光显微镜下观察到的细胞状态相一致。阳性对照组芦丁和抗坏血酸也能够抑制ROS生成，并且与荞麦壳非黄酮成分无显著性差异。结果表明，荞麦壳非黄酮成分通过抑制细胞内ROS积累来保护HepG2细胞免受H2O2诱导的氧化损伤。
6、荞麦壳非黄酮物质对HepG2细胞胞内外氧化应激因子的影响
超氧化物歧化酶（SOD）能够催化
Figure RE-575294DEST_PATH_IMAGE017
•歧化生成O2和H2O2，过氧化物酶（POD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和过氧化氢酶（CAT）可以催化H2O2分解，使细胞免受H2O2的毒害，它们广泛分布于生物体内，是生物防御体系的关键酶，在机体调控氧化与抗氧化平衡中起到关键作用。脂质氧化终产物丙二醛（MDA），可以反映机体脂质过氧化速率和强度，也是评价潜在抗氧化能力的重要参数之一。通过测定SOD，GSH-Px，POD及CAT酶活性，MDA含量以及细胞总抗氧化能力等氧化应激因子在H2O2诱导的氧化损伤过程中表达水平的变化来说明荞麦壳非黄酮成分通过发挥细胞抗氧化作用实现对HepG2细胞的保护活性。
HepG2细胞按照细胞密度为2×105个/mL接种于96孔板，待细胞培养至贴壁后，吸出培养基，先加入100 μL样品溶液处理细胞20 h，再加入100 μL H2O2溶液诱导细胞4 h后，弃去上清液，每孔用PBS洗涤3次，加入100 µL的1% Triton X-100溶液（PBS稀释），超声15 s（加速细胞裂解，使细胞裂解均匀）后，室温裂解细胞30 min，收集细胞裂解液并做好标记，-80°C冻存备用。POD、CAT、SOD、GSH-Px、MDA及T-AOC各个氧化应激指标的测定方法均按照试剂盒说明书进行。
结果如下：
1）荞麦壳非黄酮成分对HepG2细胞胞内氧化应激因子的影响
如图10所示。设定对照组的值为1，与对照组相比，模型组细胞的POD活性显著降低了83.94%（图10A），CAT活性降低了38.33%（图10B），T-AOC降低了49.99%（图10C），MDA含量则明显增加了3.22倍（图10D），说明细胞已产生严重的氧化应激（P < 0.05）。与模型组相比，加入BHNF-1组分和BHNF-2组分预处理，胞内POD活性分别显著增加了72.97%和73.32%（P <0.05），且效果优于阳性对照组芦丁和抗坏血酸；而胞内CAT活性与模型组无显著性差异（P > 0.05），可能与样品浓度较低有关，但芦丁却体现出最高的CAT活力，活性显著增加了26.33%；BHNF-1组分和抗坏血酸呈现较高的胞内T-AOC，分别为29.61 ±0.50 U/mL和35.56± 0.50 U/mL，BHNF-2组分和芦丁则与模型组无显著性差异；荞麦壳非黄酮成分和芦丁有效地抑制了胞内MDA的合成，降低了MDA含量，抗坏血酸则没有明显效果。上述结果表明，在H2O2诱导下，荞麦壳非黄酮成分作用于细胞发挥抗氧化作用时，不同的氧化应激因子在胞内的表达水平不同，没有规律性变化，这可能与其作用途径不同有关。
2）荞麦壳非黄酮成分对HepG2细胞胞外氧化应激因子的影响
结果如图11所示。与对照组相比，模型组细胞的SOD活性（图11A）、GSH-Px活性（图11B）、POD活性（图11C）、CAT活性（图11D）及T-AOC（图11E）均显著降低，MDA含量（图11F）显著增加（P < 0.05）。加入BHNF-1组分和BHNF-2组分预处理，胞外SOD活性显著增加（P<0.05），其中BHNF-2组分的效果最为明显，分别是对照组和模型组SOD活性的1.11倍和3.71倍，说明SOD的合成及分泌速率大大提高，加速
Figure RE-136769DEST_PATH_IMAGE018
•的歧化进程；胞外GSH-Px的活性与SOD呈相似趋势，其中BHNF-1组分的效果最为显著，分别是对照组和模型组GSH-Px活性的1.43倍和3.06倍，促进H2O2分解；胞外POD活性也显著增加（P < 0.05），与胞内POD活性效果类似，BHNF-2组分要优于BHNF-1组分和芦丁；而与胞内CAT活力变化相比，胞外CAT活性明显增加（P <0.05），这可能是CAT分泌到胞外发挥的抗氧化效果更显著；与模型组相比，胞外T-AOC均有所提高且具有显著性差异（P < 0.05）；荞麦壳非黄酮成分和抗坏血酸均有效地抑制了胞外MDA的积累，且抗坏血酸效果最好，几乎达到受损前的MDA水平，芦丁则没有明显效果。上述结果表明，胞内和胞外不同的氧化应激因子表达水平仍存在一定差别。
综上，荞麦壳非黄酮成分通过提高胞内外抗氧化酶活性和T-AOC，降低MDA含量来发挥细胞抗氧化作用，因不同样品在氧化应激因子表达水平上呈现的效果不同，推测其抵抗H2O2诱导的细胞氧化应激损伤的途径不同。
实施例5 荞麦壳非黄酮成分的抗糖尿病活性实验
一、化学法测定活性
1、MGO-BSA体系下AGEs的制备
晚期糖基化终末产物（Advanced glycation end products，AGEs）是指蛋白质、脂质或核酸等大分子与葡萄糖或其他还原糖发生非酶糖基化反应的终末产物，AGEs不仅可以由葡萄糖-牛血清白蛋白（Glucose-Bovine serum albumin，G-BSA）体系制备产生，还可以由活性二羰基化合物甲基乙二醛（AGEs的前体物质）-牛血清白蛋白（Methylglyoxal-bovine serum albumin，MGO-BSA）体系制备产生，且MGO-BSA体系反应更活跃，反应速率更快，具有更重要的研究意义。
参照现有方法制备MGO-BSA体系的AGEs。该实验在无菌操作台中进行，所用仪器及材料均需灭菌。试剂准备：100 mM PBS（pH = 7.4，Na2HPO4：NaH2PO4 = 4:1，现用现配），20mg/mL BSA溶液（取2 g BSA溶于100 mL PBS中）及20 mM MGO溶液（取28.8 mg MGO于PBS中，定容至20 mL）。
将上述配好的MGO和BSA溶液以1:20的比例混合均匀后分装于1.5 mL离心管中，每管560 μL，做好标记并用封口膜封好，50℃避光条件下水浴培养24h制备AGEs。
2、抗糖尿病活性的测定
反应体系600 μL，将制备好的AGEs取出，加入不同浓度的样品稀释液（25，50和200μg/mL）40 μL，所述样品分别为BHNF-1和BHNF-2组分，充分混匀后50℃避光条件下水浴培养24 h，取200 μL于96孔黑色酶标板中并通过荧光酶标仪在激发波长360 nm和发射波长460nm，增益50的条件下，测定其荧光强度。氨基胍（AG）作为阳性对照。每组样品做三次平行实验。计算公式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE029
其中FL1为加入不同浓度样品组的荧光强度；FL2为只加MGO和BSA组的荧光强度；FL0为只加BSA组的荧光强度。
结果：AGEs的过度累积及摄入会直接与机体内各种组织细胞相互作用，破坏其正常生理功能，造成机体糖脂代谢紊乱，从而引发糖尿病及其并发症，因此能否抑制AGEs生成作为衡量物质是否具有抗糖尿病活性的重要指标之一。氨基胍（AG），一类亲核联胺化合物，是经典的抗AGEs药物，作为阳性对照。
荞麦壳非黄酮成分的抗糖尿病活性，结果如图12所示。在MGO-BSA体系中，荞麦壳非黄酮成分对AGEs生成的抑制率呈浓度依赖性增加的趋势。BHNF-1组分表现出较好的抑制活性，在浓度为25、50、200 μg/mL时抑制率分别为44.11 ±0.93%、48.22 ±0.24%、76.54± 0.71%；BHNF-2组分的效果类似，抑制率分别为43.44±0.30%、48.65 ±1.23%、71.33 ±0.26%，均略低于阳性对照组AG在同一浓度下的抑制率58.25 ±0.42%、69.22 ± 0.04%、84.05 ± 0.26%。
二、细胞生物学法测定活性
1、细胞培养
按细胞培养的常规方法，进行细胞复苏，传代，冻存等基本操作；其中，完全培养基的配制比例为：DMEM培养基：FBS：双抗 = 89:10:1，细胞冻存液的配制比例为：DMEM培养基：FBS：DMSO = 6:3:1。
2、毒性试验
通过MTT法测定样品对细胞的毒性影响，具体操作：
取处于对数生长期的HepG2细胞进行传代并稀释至细胞密度为2×105个/mL时接种于96孔板中，每孔100μL，培养24h至细胞贴壁于细胞培养箱中。吸出培养基，加入不同浓度的用无血清培养基（DMEM培养基：双抗=99:1）稀释的样品溶液（50，100，200，500和1000μg/mL），每孔100μL，继续培养细胞24h，所述样品分别为BHNF-1和BHNF-2组分；弃培养液，每孔加入100μL 0.5mg/mL MTT溶液，37°C作用细胞4h后，每孔加入150μL DMSO，在酶标仪中振荡10 min，使结晶全部溶解，于490nm波长处测定其吸光度。每组样品做6个复孔，计算细胞存活率，公式如下：
Figure 870488DEST_PATH_IMAGE020
其中A1为不同浓度样品组的吸光度；A2为对照组的吸光度，用无血清培养基代替样品溶液；A0为空白组的吸光度。
3、葡萄糖消耗试验
取处于对数生长期的HepG2细胞，以2×105个/mL的细胞密度接种于96孔板中，每孔100 μL，培养24 h至细胞长至80%左右。吸出培养基，加入100 μL无血清培养基饥饿处理12 h，使细胞适应无血清环境，弃去培养基，再加入样品稀释液于96孔板中，每孔100 μL，继续培养细胞24 h，采用葡萄糖氧化酶法检测培养基中葡萄糖含量（Glucose consumption，GC）。为防止细胞增殖或死亡产生的误差，依照MTT法选定同一样品浓度进行测定，每组样品做6个复孔。葡萄糖消耗率（GC rate）的计算公式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE031
其中GC1为样品组的培养基葡萄糖含量；GC2为对照组的培养基葡萄糖含量（未加细胞）。
结果：肝细胞作为糖脂代谢过程中重要的靶细胞，采用HepG2细胞代替正常肝细胞进行体外培养，来测定荞麦壳非黄酮成分的葡萄糖消耗情况，判断其是否具有降糖作用，结果如图13所示。BHNF-1组分和BHNF-2组分均体现出显著的葡萄糖消耗能力，其中BHNF-1组分的促糖消耗效果较好。BHNF-1组分和BHNF-2组分显著提高了葡萄糖消耗率（P < 0.05），分别达到了63.99±4.13%和61.32 ± 2.07%。而阳性对照组芦丁和抗坏血酸也具有一定的降糖作用，效果低于荞麦壳非黄酮成分。
4、高糖诱导的HepG2细胞损伤模型的建立
取处于对数生长期的HepG2细胞，按照细胞密度为2×105个/mL接种于96孔板，每孔100μL，培养24h至细胞贴壁。吸出培养基，加入不同浓度的葡萄糖稀释液（200，400，500，800和1000mM，用无血清培养基稀释）于96孔板中，每孔100μL，继续诱导细胞4h，弃培养液，每孔加入100μL 0.5mg/mL的MTT溶液，37°C作用细胞4h后，每孔加入150μL DMSO，在酶标仪中振荡10min，使结晶全部溶解，于490nm波长处测定其吸光度。每组样品做6个复孔，通过测定细胞存活率，选择后续高糖诱导的细胞损伤模型的建模浓度。计算细胞存活率的公式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE032
其中A1为不同浓度葡萄糖溶液处理组的吸光度；A2为对照组的吸光度，用无血清培养基代替葡萄糖溶液；A0为空白组的吸光度。
结果：长期处于高糖环境会造成细胞的严重损伤，高糖可诱导HepG2细胞产生显著的氧化应激，并在糖尿病及其并发症的发展中起重要作用。
如图14所示，HepG2细胞的细胞存活率随葡萄糖浓度的增加而显著下降，在200 ~1000 mM浓度范围内，细胞存活率分别为98.50 ± 1.28%（200 mM），81.25±2.49%（500mM），78.43 ± 1.93%（600 mM），50.87 ±5.75%（800 mM），1.23 ± 0.33%（1000 mM），且呈剂量依赖性降低。根据细胞的半数抑制浓度，葡萄糖浓度为800 mM时，细胞存活率约为50%，因此选择该浓度作为高糖诱导的HepG2细胞损伤模型的建模浓度。而本实验所需的高糖建模浓度较高，这可能与细胞代数、细胞培养条件、作用时间等不同有关。
5、对细胞损伤的改善作用的测定
对细胞损伤的保护作用的测定：在96孔板中，待细胞培养至贴壁后，吸出培养基，先加入100μL样品溶液保护细胞20h，再加入100 μL一定浓度的高糖溶液诱导细胞4h，采用MTT法测定细胞存活率；
对细胞损伤的修复作用的测定：在96孔板中，待细胞培养至贴壁后，吸出培养基，先加入100μL一定浓度的高糖溶液诱导细胞损伤4h，再加入100μL样品溶液修复细胞20 h，同样采用MTT法测定细胞存活率；
所述的样品为非黄酮物质BHNF-1、BHNF-2。
结果：荞麦壳非黄酮成分对高糖诱导的HepG2细胞损伤的保护作用，结果如图15A所示。与对照组相比，模型组的细胞存活率为47.62±3.77%，细胞活力显著降低（P<0.05）；加入BHNF-1组分和BHNF-2组分对细胞进行预处理，再加入800 mM葡萄糖溶液，细胞活力有了明显的提升（P <0.05），分别达到了93.15±3.10%和85.40±5.43%，说明荞麦壳非黄酮成分可以抵抗高糖诱导的HepG2细胞损伤，并且通过对对照组、模型组、BHNF-1组和BHNF-2组的HepG2细胞形态观察，进一步证明了荞麦壳非黄酮成分的细胞保护活性。如图16所示，对照组细胞在显微镜视野下轮廓清晰，分布均匀，充满整个视野（图16a）；而模型组细胞仅用高糖刺激后，细胞数目明显减少，细胞形态变圆，说明已出现氧化损伤（图16b）；加入样品对细胞预保护，细胞数目和形态有一定的恢复但不完全（图16c,d）。而阳性对照组芦丁和抗坏血酸的细胞存活率则呈现出与H2O2处理组相似的趋势，即芦丁和抗坏血酸对高糖诱导的HepG2细胞损伤有一定的保护作用，细胞存活率分别是60.71±1.08%（P<0.05）和49.66±0.67%（P>0.05），均弱于荞麦壳非黄酮成分。由此表明荞麦壳非黄酮成分对高糖诱导的HepG2细胞损伤具有显著的保护作用。
荞麦壳非黄酮成分对高糖诱导的HepG2细胞损伤的修复作用，结果如图15B所示。与对照组相比，模型组的细胞存活率为34.39±0.88%，细胞活力显著下降（P<0.05）；先加入高糖诱导细胞损伤，再加入样品进行修复，BHNF-1组和BHNF-2组的细胞存活率分别为35.88±0.56%（P > 0.05）和36.72±1.36%（P<0.05），与模型组间细胞活力差异不大，无明显修复作用，阳性对照组芦丁和抗坏血酸效果类似，说明荞麦壳非黄酮成分对高糖诱导的HepG2细胞损伤无明显修复作用。
综上，荞麦壳非黄酮成分可以有效地保护HepG2细胞免受高糖诱导的氧化损伤。同样地，对于高糖诱导下的细胞保护活性进行进一步研究。
6、荞麦壳非黄酮成分对HepG2细胞内ROS水平的影响
方法同实施例4的细胞内ROS的测定方法，仅将H2O2溶液换为一定浓度的高糖溶液；
通过细胞内ROS水平的变化反映机体内血糖水平，从而判断AGEs的生成量，作为检测糖尿病及其并发症的手段之一。如图17所示，设定对照组细胞的荧光强度为1，模型组细胞的荧光强度是对照组的2.41倍，荧光强度显著增加（P < 0.05），加入BHNF-1组分和BHNF-2组分对细胞进行预处理，再加入高糖溶液进行干预，细胞的荧光强度显著下降（P <0.05），尽管两组分间无显著性差异，但BHNF-2组分的效果略优于BHNF-1组分，阳性对照组中芦丁的清除ROS能力最好，几乎恢复到受损前的ROS水平，推测荞麦壳非黄酮成分在高糖诱导下的清除ROS能力低于黄酮单体。从细胞的形态观察，与对照组细胞的状态相比（图17a），模型组细胞的绿色荧光明显增强且细胞形态变圆（图17b），说明细胞出现损伤；加入两种荞麦壳非黄酮成分预处理，绿色荧光明显减弱，形态上有一定恢复（图17c,d）。结果表明，荞麦壳非黄酮成分能够抵抗在高糖诱导下ROS对细胞的伤害。
7、胞内外氧化应激指标的测定
方法：HepG2细胞的前处理及各个氧化应激指标的测定方法同实施例4。
结果：通过HepG2细胞胞内外氧化应激因子的表达水平上的变化，进一步说明荞麦壳非黄酮成分能够有效控制由高糖环境造成的氧化损伤，进而对抑制糖尿病及其并发症的产生起着重要作用。
1）荞麦壳非黄酮成分对HepG2细胞胞内氧化应激因子的影响
结果如图18所示。设定对照组细胞的值为1，与对照组相比，模型组细胞的POD活力显著降低了56.26%（图18A），CAT活力降低了24.67%（图18B），T-AOC也显著降低了78.55%（图18C），MDA含量明显增加了3.37倍（图18D），均产生显著性差异变化（P < 0.05），说明HepG2细胞在高糖诱导下产生氧化应激。加入两种荞麦壳非黄酮成分预处理，胞内POD活性有所增加，但与模型组相比差异不显著（P > 0.05），相比之下芦丁的POD活力最好，与模型组细胞相比显著增加了15.81%（P < 0.05）；胞内CAT活性的变化趋势与POD活性的类似，但BHNF-2组的CAT活性明显比模型组细胞增加了9.67%（P < 0.05），优于BHNF-1组，而芦丁仍体现最高的CAT活力，显著增加了21.00%（P < 0.05）；从胞内T-AOC来看，BHNF-1组和BHNF-2组的细胞T-AOC均显著提高了25%左右（P < 0.05），T-AOC值分别为7.06 ± 0.25 U/mL和7.33 ±0.20 U/mL；并且两种荞麦壳非黄酮成分均能显著降低胞内MDA含量（P<0.05），与模型组相比分别减少了43.60%和29.65%，而阳性对照组的效果要更为显著。上述结果表明，荞麦壳非黄酮成分通过上调胞内POD、CAT等酶活力，提高细胞T-AOC和降低MDA含量来抵抗高糖诱导的细胞氧化损伤。
2）荞麦壳非黄酮成分对HepG2细胞胞外氧化应激因子的影响
结果如图19所示。与对照组相比，模型组细胞的SOD活性（图19A）、GSH-Px活性（图19B）、POD活性（图19C）、CAT活性（图19D）及T-AOC（图19E）均显著降低，MDA含量（图19F）显著增加（P < 0.05）。加入两种荞麦壳非黄酮成分预处理，胞外SOD活性显著增加（P < 0.05），分别比模型组SOD活性增加了55.52%和51.41%；而在胞外GSH-Px活性因子的表达中，BHNF-1组具有最高的GSH-Px活力，与模型组相比显著增加了62.30%（P < 0.05）；胞外POD活性和CAT活性显示出相同的趋势，荞麦壳非黄酮成分的效果优于阳性对照组，且BHNF-2组的效果要优于BHNF-1组，即BHNF-2组的POD活性和CAT活性分别比模型组显著增加了40.29%和55.02%（P < 0.05）；在两种荞麦壳非黄酮成分中，BHNF-1组具有较高的胞外T-AOC，为2.67± 0.07 U/mL，比模型组增加了36.31%（P < 0.05），而在阳性对照组中芦丁具有最高的细胞T-AOC；两种荞麦壳非黄酮成分和阳性对照组芦丁和抗坏血酸均能有效地降低胞外MDA含量，除芦丁外，BHNF-1组、BHNF-2组及抗坏血酸组都与对照组细胞的MDA含量无显著性差异，说明通过样品处理细胞几乎恢复到受损前MDA水平。上述结果表明，胞外氧化应激因子的表达水平与胞内不尽相同，但都具有相同的趋势，即都通过提高一些抗氧化酶活性和细胞总抗氧化能力及降低MDA含量来发挥细胞抗氧化作用，从而使细胞避免在高糖环境下遭受氧化损伤。
综上，胞外氧化应激因子的上调趋势更为明显，推测对于高糖诱导的氧化损伤在细胞外的调控效果更好。与H2O2组相比，高糖组的氧化应激效果并没有那么明显，推测高糖诱导的细胞损伤并不是仅通过氧化应激一种途径产生。

Claims (4)

1.荞麦壳非黄酮物质BHNF-1或BHNF-2在制备抗氧化类药物的应用；
所述的荞麦壳非黄酮物质，它是由下述制备方法制备的，它包括：
1）荞麦壳除杂，干燥、粉碎，热水提取，得到BHE溶液；
2）用D101大孔树脂吸附步骤1）的BHE溶液，用65~75%乙醇洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥，获得D101大孔树脂精制物；
3）步骤2）所得的D101大孔树脂精制物溶于15~20mL水，得到PBHE溶液，用AB-8型大孔树脂吸附；以1~3BV/h流速用2~3倍柱体积的水冲洗后；以1~3BV/h流速的3BV纯水洗脱，收集洗脱液，干燥，得到粗提的BHNF-1；
4）再以4BV的1~10%乙醇洗脱，收集洗脱液，干燥，得到粗提的BHNF-2；
5）将粗提的BHNF-1、BHNF-2，分别重新溶于水，静置，过滤，除去不溶性杂质，将溶液加入到萃取装置中；加入氯仿，立即充分振荡，静置，分液，保留水层组分；加入乙酸乙酯，立即充分振荡，静置，分液，保留水层组分；加入正丁醇，立即充分振荡，静置，分液，保留水层组分；将水层组分浓缩，冷冻干燥，得到荞麦壳非黄酮物质BHNF-1和BHNF-2。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤2）所述的乙醇浓度为70%。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤1）所述的热水，用量为荞麦壳重量的40~60倍。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤5）所述的静置，为静置至液体分层且界线清晰。
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