CN101220100B

CN101220100B - 一种南瓜多糖分离纯化的方法及所得组分的用途

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Publication number: CN101220100B
Application number: CN200710017285A
Authority: CN
Inventors: 王锐; 樊瀛哲; 于烨; 刘静
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2007-01-10
Filing date: 2007-01-10
Publication date: 2010-05-12
Anticipated expiration: 2027-01-10
Also published as: CN101220100A

Abstract

本发明涉及采用热水溶解和乙醇分级沉淀的分离技术从南瓜中分离得到南瓜多糖的三种组分50％乙醇沉淀物，70％乙醇沉淀物和80％乙醇沉淀物。其步骤是采用热水浸提获得南瓜水提液，有机溶剂沉淀，沉淀用水溶解，上清液浓缩，除蛋白，经乙醇分级沉淀获得南瓜多糖的三种组分50％乙醇沉淀物，70％乙醇沉淀物和80％乙醇沉淀物。本发明方法工艺简单，适宜工业化生产。经生物活性试验表明，三种多糖组分无毒副作用，多糖组分50％乙醇沉淀物和70％乙醇沉淀物能抑制大鼠胰岛β细胞的凋亡和保护损伤的大鼠胰岛β细胞，80％乙醇沉淀物能抑制白血病细胞增殖，诱导其凋亡和分化。

Description

一种南瓜多糖分离纯化的方法及所得组分的用途

技术领域

本发明涉及一种糖类分离纯化的方法及所得组分的用途，具体讲是采用热水溶解和乙醇分级沉淀的分离技术从南瓜中分离纯化得到南瓜多糖的三种组分及这三种组分的用途。

背景技术

南瓜是葫芦科植物，果实无毒，是药食两用植物。据《滇南本草》记载，南瓜性温，味甘无毒，入脾、胃二经，能润肺益气、化痰排浓、驱虫解毒、治咳止喘，疗肺痈与便泌，并有利尿美容等作用。科学研究实验证表明：南瓜富含多种氨基酸、多糖、蛋白质、维生素、淀粉、葫芦巴碱、纤维素、植物油以及部分微量元素。南瓜具有补中益气，排毒，驱虫，降低血压、血脂和胆固醇等功效，特别是对糖尿病有着非常好的疗效。近年来，国内外专家对南瓜多糖多有研究，人们通过对多糖的分离和纯化使得这一高分子聚合物在生命科学领域的研究有了重大发展。传统的南瓜多糖的分离纯化技术是将南瓜热水浸提，水提液用有机溶剂沉淀，沉淀用水溶解后，上清液经透析或膜分离，然后浓缩干燥，粗多糖采用离子交换纤维素柱层析和葡聚糖凝胶等分子筛柱层析对其进行纯化得到两种多糖组分PP-I和PP-II。该技术的不足之处是分离纯化步骤复杂，所需分离介质成本较高。另外有研究表明：南瓜多糖有降低糖尿病小鼠的血糖的作用，但其降糖机制尚不清楚，因此南瓜多糖的开发和用途是一个有待于进一步研究的新课题。

发明内容

南瓜作为一种药食两用植物，资源丰富，价格低廉；作为普通菜肴，受到食用者青睐，作为长效、无毒、降血糖、调血脂药物或食疗剂，具有可进一步开发利用的价值和研究前景。随着南瓜多糖在药理学功效日趋显现，本发明的目的旨在提供一种南瓜多糖分离纯化的方法。即采用热水溶解和乙醇分级沉淀的分离纯化方法，从南瓜中分离得到南瓜多糖的三种组分：50％乙醇沉淀物，70％乙醇沉淀物和80％乙醇沉淀物。

本发明的另一目的是提供上述分离纯化得到的三种组分50％乙醇沉淀物和70％乙醇沉淀物在防治糖尿病的用途；80％乙醇沉淀物可作为一种潜在的白血病化疗药物的用途。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种南瓜多糖的分离纯化方法，其步骤是：

(1)取新鲜成熟的南瓜，去皮，去籽，切片，经0.38％亚硫酸氢钠溶液浸泡60min后，取出冲洗干净，添加3倍重量的蒸馏水，在75～80℃水浴上，搅拌提取3次，时间分别为6小时，4小时和4小时，过滤；

(2)将上述所得滤液合并后，离心，取上清液真空浓缩，在浓缩液中加入3倍体积的95％乙醇搅拌均匀，冰箱放置过夜，离心得沉淀物；

(3)取沉淀物以去离子水充分溶解，Sevag法除蛋白：即水溶液中加入1/2体积的氯仿和正丁醇混合液，氯仿∶正丁醇＝4∶1，振荡使其充分混匀，然后3000rmin^-1的转速离心15min，除去水溶液与有机溶液交界处的灰白色变性蛋白。水溶液仍按上述方法反复去蛋白，共3次；

(4)水溶液浓缩后，加入95％乙醇，使溶液中乙醇含量为50％，，加入乙醇后静置过夜，溶液离心，得到沉淀物，沉淀物用95％乙醇，无水乙醇，丙酮依次洗涤，冷冻干燥。得到分离后的南瓜多糖组分50％乙醇沉淀物；上述50％乙醇溶液中再加入95％乙醇，使溶液中乙醇含量为70％，，加入乙醇后静置过夜，溶液离心，得到沉淀物，沉淀物用95％乙醇，无水乙醇，丙酮依次洗涤，冷冻干燥。得到分离后的南瓜多糖组分70％乙醇沉淀物；上述70％乙醇溶液中再加入95％乙醇，使溶液中乙醇含量为80％，，加入乙醇后静置过夜，溶液离心，得到沉淀物，沉淀物用95％乙醇，无水乙醇，丙酮依次洗涤，冷冻干燥。得到分离后的南瓜多糖组分80％乙醇沉淀物。

50％乙醇沉淀物：白色粉末，易溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂，水溶液为无色透明粘稠状液体，PH值为6.24，多糖含量为11.9％，茚三酮反应颜色无明显变化，紫外光谱分析在260nm，280nm处略有吸收，说明含有微量蛋白质和核酸。

70％乙醇沉淀物：淡黄色粉末，易溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂，水溶液为无色透明粘稠状液体，PH值为6.26，多糖含量为19.7％，茚三酮反应显紫色，紫外光谱分析在260nm，280nm处有吸收，说明含有少量蛋白质和核酸。

80％乙醇沉淀物：白色粉末，易溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂，水溶液为无色透明粘稠状液体，PH值为6.31，多糖含量为22.5％，茚三酮反应显紫色，紫外光谱分析在260nm，280nm处有吸收，说明含有少量蛋白质和核酸。

本发明经分离纯化得到的南瓜多糖的三种组分：50％乙醇沉淀物，70％乙醇沉淀物和80％乙醇沉淀物，其用途分述如下：

本发明得到的南瓜多糖的分离组分50％乙醇沉淀物和70％乙醇沉淀物对糖尿病的防治作用的研究主要通过MTT法测定大鼠胰岛β细胞存活率，光学显微镜观察胰岛β细胞形态等实验，检测了南瓜多糖组分50％乙醇沉淀物和70％乙醇沉淀物对大鼠胰岛β细胞的作用。本发明发现50％乙醇沉淀物和70％乙醇沉淀物对四氧嘧啶损伤的大鼠胰岛β细胞有一定的保护作用(见图1)，并能抑制体外培养的大鼠胰岛β细胞的凋亡(见图2)，由此说明南瓜多糖50％乙醇沉淀物和70％乙醇沉淀物可能通过保护和修复损伤的胰岛β细胞对糖尿病有一定的防治作用。

本发明的南瓜多糖80％乙醇沉淀物对白血病潜在的治疗作用的研究主要应用生长曲线测定法，检测不同浓度的80％乙醇沉淀物对人红白血病细胞株K562细胞增殖的影响；用流式细胞仪检测药物对K562细胞凋亡的影响；根据细胞形态、硝基蓝四氮唑(NBT)还原能力来测定K562细胞分化。本发明发现80％乙醇沉淀物能明显抑制K562细胞的增殖(见图3)，抑制作用呈时间和浓度依赖性；并能诱导K562细胞凋亡和分化(见图4)，由此说明南瓜多糖80％乙醇沉淀物可作为一种潜在的白血病化疗药物。

本发明的优点和产生的有益效果：

本发明的特点是分离纯化的操作步骤相对简单，所需分离介质成本低，适宜大规模工业化生产；南瓜多糖50％乙醇沉淀物和70％乙醇沉淀物对糖尿病有一定的防治作用，80％乙醇沉淀物可作为一种潜在的白血病化疗药物，具备极高的药用前景。

附图说明

图1.南瓜多糖(50％乙醇沉淀物和70％乙醇沉淀物)对四氧嘧啶损伤的大鼠胰岛β细胞的保护作用。

图2.不同浓度的南瓜多糖(50％乙醇沉淀物和70％乙醇沉淀物)对大鼠胰岛β细胞凋亡的保护作用。

图3.南瓜多糖(80％乙醇沉淀物)对K562细胞增殖的抑制作用。

图4.南瓜多糖(80％乙醇沉淀物)对K562细胞分化的作用。

具体实施方式

实施例1

取新鲜成熟的南瓜，去皮，去籽，切成厚度为0.2-0.5mm的南瓜片，放入烧杯中，加入0.38％亚硫酸氢钠溶液浸泡60min后，取出南瓜片，冲洗干净，放入三角瓶中，添加3倍重量的蒸馏水，在75～80℃水浴上，用玻璃棒搅拌提取3次，时间分别为6小时，4小时和4小时。提取后滤液用滤纸过滤。将所得滤液合并后，倒入烧杯中。离心，取上清液用旋转蒸发仪真空浓缩。滤液真空浓缩后，将浓缩液倒入烧杯中，在浓缩液中加入3倍体积的95％乙醇，用玻璃棒搅拌均匀，冰箱放置过夜，离心得沉淀物。取沉淀物以去离子水充分溶解得到水溶液，倒入烧杯中。Sevag法除蛋白：即在水溶液中加入1/2体积的氯仿和正丁醇混合液，氯仿∶正丁醇＝4∶1，振荡使其充分混匀，然后3000rmin^-1离心15min，除去水溶液与有机溶液交界处的灰白色变性蛋白。水溶液仍按此法反复去蛋白，共3次。除去蛋白后的水溶液用旋转蒸发仪真空浓缩，浓缩液倒入烧杯中，加入95％乙醇，用乙醇比重计测定溶液中的乙醇含量，使溶液中乙醇含量为50％，，加入乙醇后静置过夜，溶液离心，得到沉淀物，把沉淀物收集到烧杯中，沉淀物用95％乙醇，无水乙醇，丙酮依次洗涤，冷冻干燥。得到分离后的南瓜多糖组分50％乙醇沉淀物。上述50％乙醇溶液中再加入95％乙醇，用乙醇比重计测定溶液中的乙醇含量，使溶液中乙醇含量为70％，，加入乙醇后静置过夜，溶液离心，得到沉淀物，把沉淀物收集到烧杯中，沉淀物用95％乙醇，无水乙醇，丙酮依次洗涤，冷冻干燥。得到分离后的南瓜多糖组分70％乙醇沉淀物。上述70％乙醇溶液中再加入95％乙醇，用乙醇比重计测定溶液中的乙醇含量，使溶液中乙醇含量为80％，，加入乙醇后静置过夜，溶液离心，得到沉淀物，把沉淀物收集到烧杯中，沉淀物用95％乙醇，无水乙醇，丙酮依次洗涤，冷冻干燥。得到分离后的南瓜多糖组分80％乙醇沉淀物。

实验1

南瓜多糖(PP-1和PP-2)的生物活性实验

(一)胰岛细胞分离、纯化和培养

参照Gotoh等方法，取Wistar大鼠，6％水合氯醛按0.75mL/100g大腿肌肉注射麻醉，75％乙醇浸泡5min，无菌间超净工作台常规皮肤消毒，沿腹正中线剪开皮肤，充分暴露腹腔，寻找胆总管，并结扎其十二指肠入口处，逆行胆总管插管，注入胶原酶V(1g/L)约8-10mL，可见胰腺膨胀，顺序分离胰腺，置预冷的D-Hank’s液(5mL)中，用D-Hank’s液洗两遍，并用眼科镊剪碎胰腺组织.37℃水浴静置消化20min后，加入4℃D-Hank’s液终止消化，吹散后过80目网筛，将滤过物800r/min离心5min，弃上清后，沉淀物中加入Ficoll400梯度离心液(25％、23％、20％、11％)，1000r/min离心10min，对光亮，用裸眼在11％与20％，20％与23％层面提取白色粒状悬浮物，用含血清的培养液离心洗两遍，弃去上清夜，双硫腙染色后倒置显微镜下细胞计数，台盼蓝染色观察细胞活性.将纯化的胰岛细胞置于RPMI1640完全培养基(含15％胎牛血清，100IU/mL青霉素，100μg/mL链霉素，10mmol/L HEPES)，37℃，含5％CO₂的饱和湿度培养箱中培养，并根据细胞贴壁时间差分离纯化胰岛细胞，即培养24小时后观察细胞生长状态，确认细胞生长良好后，将细胞从瓶底轻轻吹下，收集培养液并离心，加入新的培养液，以5×10⁵/孔细胞数接种于24孔培养板，每2天换液1次，继续培养7-21天，作为实验用细胞。

(二)南瓜多糖(50％乙醇沉淀物和70％乙醇沉淀物)能够抑制四氧嘧啶诱导的胰岛β细胞的损伤作用

观察对南瓜多糖(50％乙醇沉淀物和70％乙醇沉淀物)对由四氧嘧啶诱导胰岛β细胞损伤的保护作用：在96孔细胞培养板中，接种胰岛β细胞(细胞密度1×10⁶/mL)，分别加入10μl南瓜多糖(50％乙醇沉淀物和70％乙醇沉淀物)，浓度为0.1-0.6mg/mL，培养2小时，然后加入四氧嘧啶(浓度为2mmol/L)。培养24小时后，每孔加入10μl MTT(5mg/mL)，继续培养4小时后，吸取培养液，加入与培养液相同量的异丙醇溶液，设置只加培养液孔为对照组，37℃饱和湿度放置过夜后，在酶联免疫测定仪(Bio-Rad 550，USA)570nm测定光密度(OD)，细胞存活率按下面公式计算：存活率(％)＝药物组OD/空白对照OD×100。

MTT比色试验表明，南瓜多糖(50％乙醇沉淀物和70％乙醇沉淀物)与胰岛β细胞共同孵育2小时后，加入四氧嘧啶共同培养24小时，在50％乙醇沉淀物浓度为0.6mg/mL和70％乙醇沉淀物浓度为0.1mg/mL时，吸光值与四氧嘧啶诱导损伤对照组的吸光值相比具有显著性差异(P＜0.01)，说明胰岛β细胞存活率高于诱导损伤对照组，表现出南瓜多糖(50％乙醇沉淀物和70％乙醇沉淀物)对胰岛β细胞损伤的保护作用(如图1)。

图1柱形图说明了南瓜多糖对四氧嘧啶损伤的大鼠胰岛β细胞的保护作用。胰岛β细胞中加入南瓜多糖孵育2小时，再加入四氧嘧啶(2mmol/L)作用24小时。MTT比色法检测细胞存活率。x±s，n＝6。*P＜0.01相比于四氧嘧啶损伤组。

光学显微镜观察结果：原代分离纯化的大鼠胰岛细胞，培养7天后，以胰岛细胞团的形式贴壁，折光度强，生长有发育良好的突起，细胞均贴壁，形态完整。加入四氧嘧啶后，可见大部分细胞形态肿胀，聚集成团，贴壁细胞缩短或消失，有些细胞轮廓不清，细胞膜的连续性消失。加入南瓜多糖(50％乙醇沉淀物和70％乙醇沉淀物)处理后，具有完整形态的细胞数目增多，细胞折光度明显恢复，染色质浓缩明显减少，形态接近正常。

(三)南瓜多糖(50％乙醇沉淀物和70％乙醇沉淀物)抑制胰岛β细胞的凋亡

原代分离纯化的大鼠胰岛细胞，在体外培养的时候容易出现细胞凋亡现象，所以观察南瓜多糖(50％乙醇沉淀物和70％乙醇沉淀物)对胰岛β细胞自身凋亡的保护作用：在96孔细胞培养板中，接种胰岛β细胞(细胞密度1×10⁶/mL)，分别加入10μl南瓜多糖(50％乙醇沉淀物和70％乙醇沉淀物)，浓度为0.1-0.6mg/mL，培养24小时后，利用MTT法检测细胞存活率。

MTT比色试验表明，南瓜多糖(50％乙醇沉淀物和70％乙醇沉淀物)与胰岛β细胞共同培养24小时后，在50％乙醇沉淀物浓度为0.6mg/mL(P＜0.01)和70％乙醇沉淀物浓度为0.1mg/mL和0.3mg/ml(P＜0.05)时，吸光值与对照组的吸光值相比出现显著性差异，说明胰岛β细胞存活率高于对照组，表现出南瓜多糖(50％乙醇沉淀物和70％乙醇沉淀物)对胰岛β细胞生长的保护作用，能够抑制胰岛β细胞的凋亡(如图2).

图2柱形图说明了不同浓度的南瓜多糖对大鼠胰岛β细胞凋亡的保护作用。胰岛β细胞中加入南瓜多糖孵育24小时，MTT比色法检测细胞存活率。x±s，n＝6。*P＜0.01相比于对照组，**P＜0.05相比于对照组。

实验2

南瓜多糖(80％乙醇沉淀物)的生物活性实验

(一)南瓜多糖(80％乙醇沉淀物)对K562细胞增殖的影响

采用台盼蓝染色计数法，绘制K562细胞生长曲线，观察80％乙醇沉淀物对K562细胞增殖的影响。取对数生长期的K562细胞置于RPMI1640完全培养基(含15％小牛血清，100IU/mL青霉素，100μg/mL链霉素，10mmol/LHEPES)中，37℃，含5％CO₂的饱和湿度培养箱中培养。在24孔细胞培养板中，接种K562细胞(细胞密度3×10⁴/mL)，分别加入100μl南瓜多糖(80％乙醇沉淀物)，浓度为0.15-0.4mg/mL，培养96小时。分别在培养第72和96小时取样，然后进行台盼蓝染色，计数活细胞数(如图3)。

图3折线图说明了南瓜多糖(80％乙醇沉淀物)对K562细胞增殖的抑制作用。K562细胞(细胞密度3×10⁴/mL)，分别加入南瓜多糖(80％乙醇沉淀物)，浓度为0.15-0.4mg/mL，培养96小时。分别在培养第72和96小时取样，然后进行台盼蓝染色，计数活细胞数。x±s，n＝3。

(二)南瓜多糖(80％乙醇沉淀物)对K562细胞凋亡的影响

取对数生长期的K562细胞置于RPMI1640完全培养基(含15％小牛血清，100IU/mL青霉素，100μg/mL链霉素，10mmol/L HEPES)中，37℃，含5％CO₂的饱和湿度培养箱中培养。接种K562细胞(细胞密度3×10⁴/mL)于细胞培养瓶中，分别加入南瓜多糖(80％乙醇沉淀物)，浓度为0.2-0.4mg/mL，培养72小时。收集细胞，FITC/PI双染，流式细胞仪测定细胞凋亡率。数据表明，南瓜多糖(80％乙醇沉淀物)能诱导K562细胞凋亡(如表1)。

表1.南瓜多糖(80％乙醇沉淀物)作用K562细胞72小时对细胞凋亡率的影响

(三)南瓜多糖(80％乙醇沉淀物)对K562细胞分化的影响

取对数生长期的K562细胞置于RPMI1640完全培养基中，37℃，含5％CO₂的饱和湿度培养箱中培养。接种K562细胞(细胞密度3×10⁴/mL)于细胞培养瓶中，分别加入南瓜多糖(80％乙醇沉淀物)，浓度为0.2-0.4mg/mL，培养72小时.收集细胞，NBT染色，检测K562细胞的分化.南瓜多糖(80％乙醇沉淀物)作用72小时后，K562细胞的NBT还原能力增加，有分化的趋势(如图4).

图4柱形图说明了南瓜多糖(80％乙醇沉淀物)对K562细胞分化的作用。K562细胞(细胞密度3×10⁴/mL)，分别加入南瓜多糖(80％乙醇沉淀物)，浓度为0.15-0.4mg/mL，培养72小时，进行NBT染色，观察细胞分化程度。x±s，n＝3。

Claims

1.一种南瓜多糖的分离纯化方法，其特征在于：

(1)取新鲜成熟的南瓜，去皮，去籽，切片，经0.38％亚硫酸氢钠溶液浸泡60min后，取出冲洗干净，添加3倍重量的蒸馏水在75～80℃水浴上，搅拌提取3次，时间分别为6小时，4小时和4小时，过滤；

(2).将所得滤液合并后，离心，取上清液真空浓缩，在浓缩液中加入3倍体积95％乙醇搅拌均匀，冰箱放置过夜，离心得沉淀物；

(3).取沉淀物用去离子水充分溶解得到水溶液，Sevag法除蛋白：即在水溶液中加入1/2体积的氯仿和正丁醇混合溶液，氯仿∶正丁醇＝4∶1，振荡使其充分混匀，然后3000rmin^-1离心15min，除去水溶液与有机溶液交界处的灰白色变性蛋白；水溶液仍按此法反复去蛋白，共3次；

(4).水溶液浓缩后，加入95％乙醇，使溶液中乙醇含量为50％，加入乙醇后静置过夜，溶液离心，得到沉淀物，沉淀物用95％乙醇，无水乙醇，丙酮依次洗涤，冷冻干燥，得到分离后的南瓜多糖组分50％乙醇沉淀物；上述50％乙醇溶液中再加入95％乙醇，使溶液中乙醇含量为70％，加入乙醇后静置过夜，溶液离心，得到沉淀物，沉淀物用95％乙醇，无水乙醇，丙酮依次洗涤，冷冻干燥，得到分离后的南瓜多糖组分70％乙醇沉淀物；上述70％乙醇溶液中再加入95％乙醇，使溶液中乙醇含量为80％，加入乙醇后静置过夜，溶液离心，得到沉淀物，沉淀物用95％乙醇，无水乙醇，丙酮依次洗涤，冷冻干燥，得到分离后的南瓜多糖组分80％乙醇沉淀物。

2.一种根据权利要求1的南瓜多糖分离纯化方法得到分离后的南瓜多糖组分50％乙醇沉淀物和70％乙醇沉淀物作为防治糖尿病药物的用途以及分离后的南瓜多糖组分80％乙醇沉淀物作为一种潜在的白血病化疗药物的用途。