CN115737495A - 具有抗炎抗氧化美白抗皱功效的四季花精华提取液及其制备方法 - Google Patents
具有抗炎抗氧化美白抗皱功效的四季花精华提取液及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及化妆品领域，公开了一种具有抗炎抗氧化美白抗皱功效的四季花精华提取液及其制备方法，根据传统中医“以花养颜”的理论依据，结合一年四季人体皮肤具有不同问题的特点，精选春季的桃花、夏季的香水莲花、秋季的菊花以及冬季的梅花作为原料进行有机组合，运用生物酶法提取结合醇提工艺，避免传统酶提提取后需要进行长时间高温加热使酶灭活的步骤从而导致浪费时间、能源以及导致提取液颜色加深和活性成分氧化的缺点，且与现有醇提不同的是，采用先酶解破坏原料细胞壁的方式可以极大提高醇提效率，所需提取时间更短，提取液活性成分更高。本发明为天然植物配方，成分简单，功效明确。
Description
技术领域
本发明涉及化妆品领域，具体是具有抗炎抗氧化美白抗皱功效的四季花精华提取液及其制备方法。
背景技术
随着经济的发展以及人们生活水平的提高，人们对“美”越来越追求，但是，随着全球环境污染的加剧和现代人们作息时间的不规律，导致人体皮肤的问题日益严重。一年分为春先秋冬四个季节。各季节天气不同，人体皮肤所表现的特点及面临的皮肤问题也不同。
春季百草萌发，过敏原也随之增多，皮肤过敏性疾病的发病率也大大增加。春季春风岁微，风中的湿度仍然过低，在肌肤毛孔张开的同时，干燥的春风会导致肌肤水分、矿物质及其他营养成分流失过快而变得干燥。所以人们往往觉得回春时节，脸上皮肤干燥、脱屑、瘙痒，此时皮肤需要加强保湿抗炎舒敏。
夏日炎炎，气温的显著提高会增强人们的机体代谢能力。皮肤失水、泌油过多，日晒过度，此时皮肤要注意防晒以及保湿锁水。
秋季萧瑟，风急天高，此时皮肤会过度干燥以及出现晒后不良反应，出现色斑、皱纹。这时皮肤需要做好美白与抗氧化。
从秋到冬，气候变得寒冷，因低温影响，此时皮肤代谢减慢，皮肤抵抗力下降，毛孔收缩，微循环变慢，要注意滋润补水，防皱防冻伤。
为应对一年四季的肌肤变化特点，人们急需一款具有卓越的抗炎、抗氧化、美白以及抗皱功效的产品来应对四季变化带来的护肤问题。现有化妆品大多注重的是保湿、美白，组分通常包含甘油、丁二醇、辛甘醇、透明质酸钠、去离子水、相应物料的提取物，其原料较多，成分相对复杂，且比较容易引起过敏。本发明依据“以花养颜”的传统中医理念，精选四季最具代表性的花卉作为原料，经过现代的提取纯化技术，并通过现代检测手段来验证其美容功效，为化妆品行业提供了四季养颜的新思路和新产品。
CN113873997A公开了一种功能性化妆品组合物，其包含选自下组的一种或多种：绿茶提取物、桃花提取物、艾蒿提取物、夏枯草提取物、车前草提取物、奎尔帕特赤竹叶提取物、茵陈蒿提取物、杜仲提取物、荷花提取物、石竹提取物、红花提取物、杏仁提取物、菊花提取物、枣提取物、黄芩提取物、姜提取物、甘草提取物、白术根茎提取物、陈皮提取物、姜黄提取物、山茶花提取物、山药提取物、松针提取物、桑白皮提取物，对皮肤具有抗衰老、美白、抗炎和抗皱的功能。但是它的不足之处是该发明虽然该发明添加了许多的功效原料，但是将一些功效原料进行简单的罗列组合，无任何的逻辑可言，且该发明未站在产品应用角度，由于添加了过多的原料，导致该产品成分驳杂，很难应用于化妆品配方中，实用性差。且该发明只是借助简单的醇提加热工艺进行制备，提取效率低下，造成了时间以及能源的浪费。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是运用现代提取纯化工艺制备一款成分简单，提取效率比较高，具有抗炎、抗氧化、美白、抗皱功效的四季花精华提取液，有效的解决脸部皮肤出现的干燥、脱屑、瘙痒、色斑、生成皱纹或被冻伤的问题。
为了解决上述问题，本发明提供一种具有抗炎抗氧化美白抗皱功效的四季花精华提取液及其制备方法。
本发明的技术方案为：具有抗炎抗氧化美白抗皱功效的四季花精华提取液，按重量百分比计算，包含以下组份：
桃花提取物0.1%-0.5%；
莲花提取物0.1%-0.5%；
菊花提取物0.1%-0.5%；
梅花提取物0.1%-0.5%；
丁二醇30%-50%；
余量为水。
具有抗炎抗氧化美白抗皱功效的四季花精华提取液的制备方法，各花放在一起统一提取并浓缩制备成精华提取液，包括以下步骤：
步骤一、取桃花、莲花、菊花、梅花原料分别粉碎成50-100目的粉末；原料粉碎后有利于活性成分的溶出，增强产品功效。
步骤二、将上述原料分别加入纯水中，再依次加入原料质量0.2%-0.5%的纤维素酶和原料质量0.2%-0.5%的果胶酶，混合均匀，这样纤维素酶和果胶酶可以均匀分散在提取溶剂中，使这两种酶可以更加有效地破坏原料细胞壁，使原料胞内活性成分溶出到提取液中。
步骤三、将步骤二混合后的溶液分别在35℃-40℃水浴加热条件下搅拌酶解1-3小时，破坏原料的细胞壁，方便后续使用乙醇水溶液进行提取，提高提取效率，缩短提取时间。
步骤四、将步骤三酶解后的溶液进行60℃-70℃的水浴。
步骤五、将步骤四水浴后的溶液进行1μm过滤后检测其固含量，70℃浓缩至干，按上述比例配比后0.45μm滤膜过滤，即为成品。
进一步的，步骤一中，粉碎采用小型药材粉碎机切割粉碎，通过该粉碎机将桃花、联华、菊花和梅花分别切割粉碎。
进一步的，步骤二中纯水为原料的5-10倍，便于对原料与纤维素酶和果胶酶混合。
进一步的，步骤三中，酶解1-3小时后加入原料5-10倍的95%乙醇，混合均匀。使之前加入的纤维素酶和果胶酶失活变性，避免了传统酶提技术中酶提后长时间高温灭活导致提取液活性物降低以及颜色加深的缺点。
进一步的，步骤四中，水浴3-5小时，对溶液进行加热。
本发明相对于现有技术，具有如下有益效果：
1.本发明组份为桃花提取物、莲花提取物、菊花提取物、梅花提取物、丁二醇、余量为水，产品成分简单明确，运用独特的生物酶解与醇提相结合的方法，提取效率更高,所以提取液活性物含量更高，现代研究证实桃花提取物具有抗氧化、抑制酪氨酸酶活性的作用；莲花含有蛋白质、酚类、糖类以及黄酮类成分，具有美容养颜的作用；菊花富含类黄酮类物质和维生素以及氨基酸，具有抗氧化、抗衰老的功效；梅花中富含多酚物质具有良好的抗氧化效果，梅花中的总黄酮含量较高具有抑制酪氨酸酶，干扰黑色素形成的作用。并且本发明的功效经过科学实验验证，证实其具有十分显著的美白、抗氧化、抗炎和抗皱功效。
2.本发明根据传统中医“以花养颜”的理论依据，精选春季的桃花、夏季的香水莲花、秋季的菊花以及冬季的梅花作为原料，成分简单明了，而非简单的使用功效原料罗列堆砌，运用现代提取工艺进行加工，并对本发明的功效进行验证，证实了本发明具有显著的美白抗炎抗氧化以及抗皱的效果，在化妆品配方中实用性强，提取效率高，产品活性物含量高。
3.本发明提取液的制备方法通过先使用纤维素酶和果胶酶对原料进行酶解，提高提取效率，然后利用高浓度的乙醇水溶液使纤维素酶和果胶酶失活，避免了常规生物酶提取法中长时间高温加热给酶灭活导致的提取物含量减少以及提取液颜色加深的缺点，同时在采用生物酶破坏原料的细胞壁，且与现有醇提不同的是，采用先酶解破坏原料细胞壁的方式可以极大提高醇提效率，可以使高浓度的乙醇水溶液更高效地提取原料中的黄酮类以及醛类活性物质。因为本发明的制备方法比一般工艺提取效率更高，且没有经过高温灭活处理不会发生提取液颜色的氧化加深，所以通过本方法制备的提取液与一般工艺制备的提取液相比，活性物含量更高，颜色更浅，因此美容功效更强。
附图说明
图1为本发明四季花精华液抗炎测试细胞毒性结果图。
图2为本发明四季花精华液抑制NO生成结果图。
图3为本发明四季花精华提取液对DPPH自由基清除率结果图。
图4为本发明四季花精华液美白测试细胞毒性结果图。
图5为本发明四季花精华液的单位细胞黑色素生成率结果图。
图6为本发明四季花精华液的单位细胞黑色素分泌率结果图。
图7为本发明四季花精华液抗皱测试细胞毒性结果图。
图8为本发明四季花精华液抑制MMP-1基因表达结果图。
图9为本发明四季花精华液促进collagen type 1基因表达结果图。
具体实施方式
下面结合特定的具体实施例对本发明的实施方式作进一步详述。
实施例1
本发明提供了一种具有抗炎抗氧化美白抗皱功效的四季花精华提取液，按重量百分比计算，包含以下组份：
桃花提取物0.2%
莲花提取物0.2%
菊花提取物0.2%
梅花提取物0.2%
丁二醇50%
余量为水。
具有抗炎抗氧化美白抗皱功效的四季花精华提取液，各花分别提取统一由以下步骤提取并浓缩制备成精华提取液：
步骤一、取桃花、莲花、菊花、梅花分别粉碎成粉末；
步骤二、将上述原料分别加入到10倍纯水中，分别依次加入原料质量0.2%的酶活力为3500u/g的纤维素酶和原料质量0.2%的酶活力为60000u/g的果胶酶，混合均匀；
步骤三、35℃水浴加热搅拌酶解1小时破坏原料的细胞壁，方便后续使用乙醇水溶液进行提取，提高提取效率，缩短提取时间；然后加入原料10倍的95%乙醇，混合均匀，使之前加入的纤维素酶和果胶酶失活变性，避免了传统酶提技术中酶提后长时间高温灭活导致提取液活性物降低以及颜色加深的缺点；
步骤四、分别60℃水浴3小时；
步骤五、1μm过滤后检测其固含量，70℃分别浓缩至干，按上述比例配比，0.45μm滤膜过滤后装瓶，即为成品。
实施例2
本发明提供了一种具有抗炎抗氧化美白抗皱功效的四季花精华提取液，按重量百分比计算，包含以下组份：
桃花提取物0.2%
莲花提取物0.2%
菊花提取物0.3%
梅花提取物0.3%
丁二醇50%
余量为水。
各花分别提取统一由以下步骤提取并浓缩制备成精华提取液：
步骤一、取桃花、莲花、菊花、梅花原料粉碎成粉末；
步骤二、将上述原料加入到其6倍纯水中，依次加入原料质量0.5%的酶活力为3500u/g的纤维素酶和原料质量0.5%的酶活力为60000u/g的果胶酶，混合均匀；
步骤三、40℃水浴加热搅拌酶解2小时破坏原料的细胞壁，方便后续使用乙醇水溶液进行提取，提高提取效率，缩短提取时间；然后加入原料5倍的95%乙醇，混合均匀，使之前加入的纤维素酶和果胶酶失活变性，避免了传统酶提技术中酶提后长时间高温灭活导致提取液活性物降低以及颜色加深的缺点；
步骤四、70℃分别水浴4小时；
步骤五、1μm过滤后检测其固含量，70℃浓缩至干，按上述比例配比，0.45μm滤膜过滤后装瓶，即为成品。
实施例3
本发明提供了一种具有抗炎抗氧化美白抗皱功效的四季花精华提取液，按重量百分比计算，包含以下组份：
桃花提取物0.3%
莲花提取物0.3%
菊花提取物0.3%
梅花提取物0.3%
丁二醇50%
余量为水。
各花分别提取统一由以下步骤提取并浓缩制备成精华提取液：
步骤一、取桃花、莲花、菊花、梅花原料粉碎成粉末；
步骤二、将上述原料加入到其5倍纯水中，依次加入原料质量0.5%的酶活力为3500u/g的纤维素酶和原料质量0.5%的酶活力为60000u/g的果胶酶,混合均匀；
步骤三、40℃水浴加热搅拌酶解2小时破坏原料的细胞壁，方便后续使用乙醇水溶液进行提取，提高提取效率，缩短提取时间；然后加入原料8倍的95%乙醇，混合均匀，使之前加入的纤维素酶和果胶酶失活变性，避免了传统酶提技术中酶提后长时间高温灭活导致提取液活性物降低以及颜色加深的缺点；
步骤四、70℃分别水浴5小时；
步骤五、1μm过滤后检测其固含量，70℃浓缩至干，按上述比例配比，0.45μm滤膜过滤后装瓶，即为成品。
为了更好的说明本发明的有益效果，进行功效评价实验：
一、四季花精华提取液抗炎功效评价实验
1. 实验目的
为将舒四季花精华提取液作为化妆品使用，进行了细胞内抗炎症功效评价。
2. 实验方法
细胞毒性评价 (MTT assay)
在24孔板上接种细胞培养24小时后，更换成无血清培养基，按不同浓度处理后培养。培养结束后将细胞内更换为包含MTT溶液的培养基进行反应，结束反应后去除上清液，添加二甲基亚砜(DMSO)溶解生成的MTT 甲瓒结晶后，使用酶标仪在570nm波长下测量吸光度。
NO 生成分析
在24孔板上接种巨噬细胞（Raw264.7）培养，进行抗炎实验时，在新的培养基内将脂多糖(LPS)和试料处理后在37°C, 5% CO2 微生物培养器内培养。培养结束后回收细胞的培养基转移到96孔板，加入格里斯试剂（Griess’ reagent）进行反应，使用酶标仪测量吸光度。与抑制NO生成的脂多糖比较后可体现吸光度的百分比。在去除培养液的孔板上放上加入MTT溶液的培养基进行反应。去除上清液后添加二甲基亚砜(DMSO)溶解生成的MTT 甲瓒结晶体后，使用酶标仪测量吸光度。进行增进免疫实验时，无脂多糖处理直接单独处理试料后进行相同的实验过程。
3. 实验结果
细胞毒性评价表(MTT assay)
由细胞毒性评价表和图1可知，四季花精华提取液至5%浓度为止无细胞毒性。
1) NO一氧化氮生成分析表
由NO一氧化氮生成分析表，以及图2可知，四季花精华提取液从 1% 浓度开始出现浓度依存性抑制NO生成的抗炎功效。
4. 结论
四季花精华对于脂多糖引发的炎症，可阻碍iNOS的活性，抑制NO生成可以治疗炎症。因此四季花精华提取液在1% ~ 5%浓度下有显著抗炎功效，可作为缓解炎症的化妆品推荐使用。
二、四季花精华提取液清除DPPH自由基实验
一）试剂准备
步骤一、3.943mgDPPH用95%乙醇定容至50mL
步骤二、10mg左右维E用95%乙醇定容至100mL
步骤三、四季花精华提取液
二）实验步骤
步骤一、 UV校零，95%乙醇作为空白样
步骤二、预实验（DPPH浓度选择）
500μL DPPH+1000μL 95%乙醇震荡10s，静置10min，测吸光度值（520nm处吸光度值0.45-0.55，则可作为以下实验DPPH溶液）
步骤三、维E的测定
| 维E（μL） | 95%乙醇（μL） | DPPH（μL） | 乙醇（μL） | |
| S/样 | 100 | 900 | 500 | 0 |
| SB/样 | 100 | 900 | 0 | 500 |
| C/样溶 | 0 | 100+900 | 500 | 0 |
| CB/样溶 | 0 | 100+900 | 0 | 500 |
加入DPPH或95%乙醇后，震荡10s，静置10min，测吸光度值
步骤四、实验
| 样/样溶（μL） | 95%乙醇（μL） | DPPH（μL） | 乙醇（μL） | |
| S/样 | 0-1000 | 1000-0 | 500 | 0 |
| SB/样 | 0-1000 | 1000-0 | 0 | 500 |
| C/样溶 | 0-1000 | 1000-0 | 500 | 0 |
| CB/样溶 | 0-1000 | 1000-0 | 0 | 500 |
加入DPPH或95%乙醇后，震荡10s，静置10min
步骤五、分别在520nm处测吸光度，制作表格，作图，得IC50值。
计算公式：抑制率（%）=[1-（S-SB）/(C-CB)]*100
三）结果
| 样品量 (uL) | 浓度 (uL/mL) | DPPH(%) |
| 2 | 1.33 | 37.86 |
| 5 | 3.33 | 57.38 |
| 10 | 6.67 | 81.54 |
由DPPH自由基实验的数据，以及图3可知如下结果：为了镇静和抑制皮肤老化不仅需要生物体内的活性氧还需要能够抑制皮肤中过剩活性氧并去除生成的活性氧的系统。四季花精华提取液在DPPH实验中确认了对自由基的浓度依赖性抑制，IC50值约为2.6uL/mL。
因此，可以判断出四季花精华提取液具有显著的抗氧化效果，推荐为抗老化功效的化妆品。
三、四季花精华提取液美白功效评价
1. 实验目的
黑色素生成细胞内黑色素的量或细胞内外的总黑色素量量化后，对美白成分细胞的黑色素生成阻碍效果进行评价。
2. 实验方法
细胞毒性评价 (MTT assay)
在6孔板上接种B16黑色素瘤细胞培养,培养后细胞的培养基更换为新的培养基，试料按不同浓度处理后再培养。培养结束后细胞与MTT溶液反应，结束反应后去除上清液，添加二甲基亚砜(DMSO)溶解生成的MTT 甲瓒结晶后，使用酶标仪测定吸光度。
细胞内外的黑色素量测定
在6孔板上接种B16黑色素瘤细胞培养,培养后细胞的培养基更换为新的培养基，试料按不同浓度处理后再培养。培养结束后回收细胞的培养基，转移到96孔板上，测定吸光度以测定细胞外黑色素的量。回收培养基的plate用PBS清洗后，处理NaOH，细胞转移至tube。完全溶解的细胞转移至96孔板上后，测定吸光度以测定细胞内黑色素的量。
3. 实验结果
细胞毒性评价表 (MTT assay)
由细胞毒性评价表和图4可知，1%浓度为止未观察到细胞毒性。因此本实验最大进行至1% 的浓度。
单位细胞黑色素生成率表
由单位细胞黑色素生成率表和图5可知，四季花精华提取液有浓度依存性阻碍单位细胞黑色素的生成的功效。
单位细胞黑色素分泌率表
由单位细胞黑色素分泌率表和图6可知，四季花精华提取液在0.5%浓度下有减少15.64%单位黑色素分泌的功效。
4. 结论
为验证四季花精华提取液的美白功效，检测了细胞内黑色素的生成及分泌量。实验结果显示，四季花精华提取液到 0.5%为止都没有细胞毒性, 0.5% 浓度下有减少黑色素生成及分泌的功效，具有显著的美白效果。
因此, 四季花精华提取液通过抑制黑色素生成，淡化黑斑，瑕疵，拥有提亮暗沉肤色的功效，推荐作为美白化妆品使用。
四、四季花精华提取液抗皱功效评价
1. 实验目的
为评价四季花精华提取液的抗皱功效进行实验。
2. 实验方法
细胞毒性评价 (MTT assay)
在24孔板上接种细胞培养24小时后，更换成无血清培养基，按不同浓度处理后培养。培养结束后将细胞内更换为包含MTT溶液的培养基进行反应，结束反应后去除上清液，添加二甲基亚砜(DMSO)溶解生成的MTT 甲瓒结晶后，使用酶标仪在570nm波长下测量吸光度。
抗皱相关遗传基因表达评价法
在60 mm 培养皿内接种人纤维芽细胞(dermal fibroblast)培养,用缓冲液清洗后，UVA照射，更换成无血清培养基后处理试料后在37°C, 5% CO2 微生物培养器内培养.使用QIAzolTM裂解试剂收集细胞，按照制造商方法分离RNA。分离后的RNA定量后，合成cDNA进行Real-time PCR (Applied Biosystems试剂盒,快速实时定量PCR仪) 。
3. 实验结果
细胞毒性评价表 (MTT assay)
由细胞毒性评价表和图7可知，四季花精华提取液在2%浓度下未观察到细胞毒性。因此本实验最大浓度进行到2%为止。
抗皱相关遗传基因表达评价表
2-1) MMP-1
由MMP-1表格和图8可知，四季花精华提取液出现了在全浓度下因UVA而增加的MMP-1表达有被阻碍的效果。
2-2) Col-1
由Col-1表格和图9可知，四季花精华提取液在全浓度下可增加因UVA而被阻碍的collagen type 1表达的功效。
4. 结论
为将四季花精华提取液作为化妆品使用，在细胞中进行了抗皱功效评价。研究表明紫外线(UVA)通过特异性分解真皮主要基质成分Collagen I, III, V 及基底膜主要基质成分collagen IV, VII, proteoglycans, laminin等的多种MMPs合成的调节，来分解皮肤真皮层的细胞等基质成分及弹力纤维，诱导皮肤皱纹及光老化的产生。
因此四季花精华提取液的全浓度在被紫外线照射的人皮肤纤维芽细胞中都可阻碍引发皮肤皱纹及光老化的MMP-1的活性，增加干预皮肤弹力的Col-1的表达，具有显著的抗皱功效。
综合上面四个实验结论可知，本发明作为一款化妆品组合物具有显著的抗炎抗氧化美白以及抗皱的功效。
Claims (6)
1.具有抗炎抗氧化美白抗皱功效的四季花精华提取液，其特征在于，所述提取液由以下质量份数的原料配比而成：
桃花提取物0.1%-0.5%；
莲花提取物0.1%-0.5%；
菊花提取物0.1%-0.5%；
梅花提取物0.1%-0.5%；
丁二醇30%-50%；
余量为水。
2.具有抗炎抗氧化美白抗皱功效的四季花精华提取液的制备方法，其特征在于，所述的制备方法如下：
步骤一、取桃花、莲花、菊花、梅花原料分别粉碎成50-100目的粉末；
步骤二、将上述原料分别加入到纯水中，再依次加入原料质量的0.2%-0.5%的酶活力为3500u/g的纤维素酶和原料质量0.2%-0.5%的酶活力为60000u/g的果胶酶，混合均匀；
步骤三、将步骤二混合后的溶液在35℃-40℃水浴加热条件下搅拌酶解1-3小时，使步骤二中的纤维素酶和果胶酶在最适酶解温度下进行酶解反应，有效提高酶解效率；
步骤四、将步骤三酶解后的溶液分别进行60℃-70℃的水浴；
步骤五、将步骤四水浴后的溶液进行1μm过滤后检测其固含量，70℃旋蒸仪分别浓缩至干，即为桃花提取物、莲花提取物、菊花提取物以及梅花提取物，按照比例配比稀释，0.45微米滤膜过滤后即得成品。
3.根据权利要求2所述的具有抗炎抗氧化美白抗皱功效的四季花精华提取液的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，粉碎采用小型药材粉碎机切割粉碎。
4.根据权利要求2所述的具有抗炎抗氧化美白抗皱功效的四季花精华提取液的制备方法，其特征在于，所述步骤二中纯水为原料的5-10倍。
5.根据权利要求2所述的具有抗炎抗氧化美白抗皱功效的四季花精华提取液的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，酶解1-3小时后加入原料5-10倍的95%乙醇，混合均匀。
6.根据权利要求2所述的具有抗炎抗氧化美白抗皱功效的四季花精华提取液的制备方法，其特征在于，所述步骤四中，水浴3-5小时。
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