CN115737471A - 一种抗光损伤的柞蚕丝素肽脂质体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种抗光损伤的柞蚕丝素肽脂质体的制备方法，是将柞蚕丝素肽、硅藻多糖和硅藻壳进行复配，进而通过脂质体技术封装，同时加入嗜酸乳杆菌，各组分相辅相成、彼此增效，能够有效抵御紫外线辐射，抑制光损伤。柞蚕丝素肽与硅藻多糖具有生物相容性，两者能够形成共价络合物，释放功能性肽段，可显著提高脂质体的DPPH自由基和羟基自由基清除活性及抗氧化能力；硅藻壳能够为柞蚕丝素肽与硅藻多糖提供保护屏障，提高二者的作用面积与扩散速度，有效增强脂质体抵抗高温、高寒以及紫外线辐射的能力；嗜酸乳杆菌作为表面活性剂，可有效增加脂质体的稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及一种柞蚕丝素肽脂质体的制备方法，尤其是一种抗光损伤的柞蚕丝素肽脂质体的制备方法。
背景技术
紫外线能够破坏机体抗氧化防御系统，激活核转录因子、表皮生长因子和肿瘤坏死因子等细胞的合成及释放，导致皮肤中的蛋白质、脂类、核酸等生物大分子产生严重氧化损伤（光损伤），直接表现为皮肤晒伤，光损伤累积可导致光老化甚至是光致癌。
为了防止光损伤，目前市场上已有许多防晒产品，主要有物理防晒及化学防晒等。物理防晒的主要成分是二氧化钛、氧化锌等，其原理主要是阻挡紫外线波长UVA和UVB的对皮肤的伤害，物理防晒相对比较温和，可适用于角质层比较薄的敏感肌肤；化学防晒的主要成分是二苯酮、水杨酸和乙基己酯等，其原理主要是通过化学成分在肌肤表面形成一层保护膜，来吸收紫外线并通过新陈代谢排出体外，化学防晒相比较于物理防晒更具有刺激性，不适合敏感肌肤使用，只适用于干性或者油性等角质层厚肌肤。然而，无论是物理防晒和化学防晒，通常是在涂抹30分钟后才发生作用且持续防晒时间只有几小时。
丝素肽是丝素蛋白水解的小分子肽类，主要来自家蚕丝素、柞蚕丝素和天蚕丝素等。丝素肽具有营养、抑菌、吸湿保湿性、遮蔽紫外线及增强细胞活力等功能，适用于皮肤表面的保湿、美白、防晒、促修复等。但是丝素肽易溶于水，附着于皮肤表面的单纯丝素肽溶液，随着水分的流失其营养修护的有效成分仅仅停留在皮肤表层，不能完全深入肌肤深层，难以实现持久性的靶向保护作用。
公开号为CN 105777933 B的中国发明专利，公开了一种“海藻多糖的制备及其在化妆品中的应用”，是将海藻粉碎后经甲醇除杂，残渣充分脱除甲醇后再利用热酸提取法提取其中酸溶性多糖，再通过醇沉除去生物利用率较低的大分子多糖类成分，剩余溶液回收乙醇后，透析，冷冻干燥，得到海藻多糖。具有显著的抗氧化作用和保湿活性，可用于化妆品领域。
公开号为CN112978738A的公开了“一种从海洋单细胞硅藻提取纯净硅藻壳的方法”，具体步骤如下：（1）制备藻泥；（2）酸热法处理藻泥；（3）洗涤烘干。硅藻壳体作为一种结构独特的新型材料，具有高度有序的三维多孔结构、大的比表面积及耐热等优良特性，在化工、环境和建材等方面受到广泛应用和研究。近年来，硅藻壳作为生物医用材料的潜能也逐渐被开发出来。
脂质体技术最早应用于医药行业，之后才应用于化妆品行业。磷脂组成的球形脂质体可以将活性成分包裹在里面，有效提高其生物学效价。同时，磷脂也是细胞膜的主要成分，皮肤的角质层也是磷脂双层结构，与脂质体具有良好的亲和性。脂质体包裹的活性成分能够更好的穿透角质层，进入表皮层的更深层并不断释放活性物质，进而发挥更好的功效。然而，脂质体制备过程中多添加吐温类、司盘类、泊洛沙姆类等化学表面活性剂，这些物质大多降解性差、生物相容性低，对皮肤有一定刺激性，易产生溶血及过敏反应。
迄今为止并没有关于以柞蚕丝素肽、硅藻多糖、硅藻壳及嗜酸乳杆菌为原料，制备可有效吸收紫外线的抗光损伤的柞蚕丝素肽脂质体的相关报道。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种抗光损伤的柞蚕丝素肽材料及其制备方法。
本发明的技术解决方案是：一种抗光损伤的柞蚕丝素肽脂质体的制备方法，按照如下步骤进行：
步骤1.称取定量的柞蚕丝素肽于烧杯中，加入硅藻多糖和硅藻壳，溶解于1/10~2/10体积PH值为7~9的PBS缓冲溶液中，得到水相，所述柞蚕丝素肽、硅藻多糖和硅藻壳的质量份数分别为40~50份、4~6份、2~5份；
步骤2.称取定量的磷脂、胆固醇和维生素E置于1/5~2/5体积氯仿溶液中，搅拌至完全溶解，得到有机相，所述磷脂、胆固醇和维生素E的质量份数分别为4~6份、40~65份、2~5份；
步骤3.将所得水相及有机相混合后进行第一次超声处理，得到白色乳浊液，在37℃的水浴温度下进行旋转蒸发除去有机溶剂并在烧瓶内壁上形成乳浊液薄膜；再加入质量份数为3~6份的嗜酸乳杆菌及2/5~3/5体积PH值为7~9的PBS缓冲溶液，进行第二次旋转蒸发，使乳浊液薄膜脱落至PBS缓冲溶液中并除尽残余的有机溶剂，之后再进行第二次超声处理；最后再加入2/10~3/10体积PH值为7~9的PBS缓冲溶液定容。
所述磷脂为大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂或氢化大豆磷脂。
所述步骤3第一次超声处理时长为2~4 min，第二次超声处理时长为4~6 min。
本发明是将柞蚕丝素肽、硅藻多糖和硅藻壳进行复配，进而通过脂质体技术封装，同时加入嗜酸乳杆菌，各组分相辅相成、彼此增效，能够有效抵御紫外线辐射，抑制光损伤。柞蚕丝素肽与硅藻多糖具有生物相容性，两者能够形成共价络合物，释放功能性肽段，可显著提高脂质体的DPPH自由基和羟基自由基清除活性及抗氧化能力；硅藻壳能够为柞蚕丝素肽与硅藻多糖提供保护屏障，提高二者的作用面积与扩散速度，有效增强脂质体抵抗高温、高寒以及紫外线辐射的能力；嗜酸乳杆菌作为表面活性剂，可有效增加脂质体的稳定性。本发明制备方法简单、原料来源广、生产成本低，具有绿色环保、无毒副作用等特点，在有效抑制光损伤的前提下，对肌肤不刺激，无过敏等安全风险，具有较高的生物学效价。
附图说明
图1是本发明实施例柞蚕丝素肽脂质体形貌电镜图。
图2是本发明实施例柞蚕丝素肽脂质体结构示意图。
图3是本发明实施例柞蚕丝素肽脂质体抗紫外诱导小鼠皮肤细胞氧化实验效果图。
图4是本发明实施例柞蚕丝素肽脂质体抗紫外诱导人皮肤细胞凋亡实验效果图。
图5是本发明实施例柞蚕丝素肽脂质体抗紫外诱导斑马鱼尾鳍光损伤效果图。
具体实施方式
实施例1：
本发明的一种抗光损伤的柞蚕丝素肽脂质体的制备方法，按照如下步骤进行：
步骤1.称取定量的柞蚕丝素肽于烧杯中，加入硅藻多糖和硅藻壳，溶解于1/10体积PH值为8的PBS缓冲溶液中，得到水相，所述柞蚕丝素肽、硅藻多糖和硅藻壳的质量份数分别为50份、6份、4份；
步骤2.称取定量的大豆卵磷脂、胆固醇和维生素E置于1/5体积氯仿溶液中，搅拌至完全溶解，得到有机相，所述大豆卵磷脂、胆固醇和维生素E的质量份数分别为6份、60份、5份；
步骤3.将所得水相及有机相混合后置于容器内进行第一次超声处理3 min，得到白色乳浊液，在37 ℃的水浴温度下进行旋转蒸发除去有机溶剂并在烧瓶内壁上形成乳浊液薄膜；再加入质量份数为4份的嗜酸乳杆菌及3/5体积PH值为8的PBS缓冲溶液，进行第二次旋转蒸发，使乳浊液薄膜脱落至PBS缓冲溶液中并除尽残余的有机溶剂，之后再进行第二次超声处理5 min；最后再加入3/10体积PH值为8的PBS缓冲溶液定容。
实施例2：
本发明的一种抗光损伤的柞蚕丝素肽脂质体的制备方法，按照如下步骤进行：
步骤1.称取定量的柞蚕丝素肽于烧杯中，加入硅藻多糖和硅藻壳，溶解于2/10体积PH值为7的PBS缓冲溶液中，得到水相，所述柞蚕丝素肽、硅藻多糖和硅藻壳的质量份数分别为40份、4份、5份；
步骤2.称取定量的蛋黄卵磷脂、胆固醇和维生素E置于2/5体积氯仿溶液中，搅拌至完全溶解，得到有机相，所述蛋黄卵磷脂、胆固醇和维生素E的质量份数分别为4份、65份、2份；
步骤3.将所得水相及有机相混合后置于容器内进行第一次超声处理4 min，得到白色乳浊液，在37 ℃的水浴温度下进行旋转蒸发除去有机溶剂并在烧瓶内壁上形成乳浊液薄膜；再加入质量份数为6份的嗜酸乳杆菌及2/5体积PH值为7的PBS缓冲溶液，进行第二次旋转蒸发，使乳浊液薄膜脱落至PBS缓冲溶液中并除尽残余的有机溶剂，之后再进行第二次超声处理6 min；最后再加入2/10体积PH值为7的PBS缓冲溶液定容。
实施例3：
本发明的一种抗光损伤的柞蚕丝素肽脂质体的制备方法，按照如下步骤进行：
步骤1.称取定量的柞蚕丝素肽于烧杯中，加入硅藻多糖和硅藻壳，溶解于1/10体积PH值为9的PBS缓冲溶液中，得到水相，所述柞蚕丝素肽、硅藻多糖和硅藻壳的质量份数分别为45份、5份、3份；
步骤2.称取定量的氢化大豆磷脂、胆固醇和维生素E置于1/5体积氯仿溶液中，搅拌至完全溶解，得到有机相，所述氢化大豆磷脂、胆固醇和维生素E的质量份数分别为5份、40份、3份；
步骤3.将所得水相及有机相混合后置于容器内进行第一次超声处理2 min，得到白色乳浊液，在37 ℃的水浴温度下进行旋转蒸发除去有机溶剂并在烧瓶内壁上形成乳浊液薄膜；再加入质量份数为3份的嗜酸乳杆菌及2/5体积PH值为9的PBS缓冲溶液，进行第二次旋转蒸发，使乳浊液薄膜脱落至PBS缓冲溶液中并除尽残余的有机溶剂，之后再进行第二次超声处理4 min；最后再加入3/10体积PH值为9的PBS缓冲溶液定容。
以上各实施例中的柞蚕丝素肽购自湖州未来生物科技有限公司，嗜酸乳杆菌（100亿/克-1000亿/克）、磷脂、胆固醇和维生素E等均为外购商品，硅藻多糖及硅藻壳分别以硅藻为原料，按照公开号为CN 105777933 B和CN 112978738 A所公开的方法制备而成，其硅藻购自中国科学院海洋研究所海藻种质库（编号MASCC-0035）。
对实施例1制备的柞蚕丝素肽脂质体进行形貌表征，通过透射电镜分析，柞蚕丝素肽脂质体形貌电镜图如图1所示，可以直观观察到材料的形态呈微球状。柞蚕丝素肽脂质体结构示意图如图2所示，柞蚕丝素肽与硅藻多糖具有生物相容性，两者能够形成共价络合物；硅藻壳能够为柞蚕丝素肽与硅藻多糖提供保护屏障；嗜酸乳杆菌作为表面活性剂，可有效增加脂质体的稳定性。
实验：
1.对小鼠成纤维细胞Balb/c3T3的抗光损伤氧化作用
将小鼠胚胎成纤维细胞Balb/c3T3从液氮取出，孵化后将对数生长期的Balb/c3T3细胞接种于多孔培养板上中，每孔190 μL，于37 ℃、5% CO2 培养箱内培养4 h，共7组（空白组、模型组、对照组、本发明实施例1组、对比例1~3组），每组3个重复；待细胞沉淀后，除空白组、模型组外，其余各组每孔中加入10 μL样品继续培养24h，然后除空白组外，其余各组依据细胞存活率选择合适剂量组进行紫外诱导损伤处理；弃除上清液，用PBS清洗细胞三次，按照南京建成科技有限公司试剂盒中方法对细胞进行处理，收集上清液，参照试剂盒说明书，分别测定细胞中过氧化物歧化酶（SOD）活力和过氧化物酶活性（CAT），谷胱甘肽（GSH）及丙二醛（MDA）含量。
各组样品如下：
对照组：按照本发明实施例1的方法制备，但步骤1中只加入质量份数为60的柞蚕丝素肽；
本发明实施例1组：本发明实施例1制备的柞蚕丝素肽脂质体；
对比例1：按照本发明实施例1的方法制备，但步骤3中不加入嗜酸乳杆菌；
对比例2：按照本发明实施例1的方法制备，但步骤1中不加入硅藻壳；
对比例3：按照本发明实施例1的方法制备，但步骤1中不加入柞蚕丝素肽和硅藻壳，硅藻多糖的质量份数为60份。
结果如图3所示，本发明实施例1的柞蚕丝素肽脂质体与其它组相比，可以显著提高成纤维细胞Balb/c3T3内SOD、CAT酶活力及GSH含量，降低MDA含量，说明本发明实施例的柞蚕丝素肽脂质体对紫外辐射造成的细胞氧化损伤具有保护作用。
2.抑制紫外诱导人表皮细胞HACAT的光损伤凋亡作用
将HaCaT以每孔5×105个细胞均匀接种于孔板中，置细胞孵箱内孵育过夜。同上述实验1相同，共7组（空白组、模型组、对照组、本发明实施例1组、对比例1~3组），每组3个重复；然后除空白组外，其余各组依据细胞存活率选择合适剂量组进行紫外诱导损伤处理，建立紫外损伤模型，之后除空白组、模型组外，其余各组每孔中加入10 μL样品继续培养48 h。吸弃培养基，PBS洗三次，加入无EDTA的胰酶消化，900 rpm离心5 min收集细胞，PBS洗3次。将5×Binding Buffer用三蒸水1:4稀释，加100 μL 1×Binding Buffer于样品中。加入2 μL Annexin V-FITC (AV)和1 μL Propidium lodide (PI)，混匀，避光15 min后再向每样品中加200 μL 1×Binding Buffer，混匀，过滤膜后上机检测，即通过流式细胞术检测各组对紫外损伤皮肤细胞HaCaT凋亡的影响。
各组所用样品同上述实验1。
结果如图4所示，与空白组相比，模型组紫外照射后细胞凋亡显著增加，而本发明实施例1相比其它各组细胞凋亡抑制作用的效果更显著，在抗光损伤作用方面具有增效作用。
3.对紫外诱导斑马鱼尾鳍光损伤修复作用
随机选取斑马鱼于孔板中，每孔20尾，共7组（空白组、模型组、对照组、本发明实施例1组、对比例1~3组），每组6个重复；除空白组、模型组外，其余各组每孔中加入10 μL样品，28℃条件下避光孵化2h后；除空白组，其余各组均在紫外光下进行照射，建立紫外损伤模型（表现为尾鳍皱缩）。之后（1）在28℃继续孵化22h，每个组随机选取10尾斑马鱼置于解剖显微镜下拍照，用高级图像处理软件采集数据，分析尾鳍数据，测定斑马鱼尾鳍面积的变化；（2）28℃避光48h，各组均加入CM-H2DCFDA，每组选取10尾至96孔板，每孔1尾，容量100μl，各组28℃避光20h后，利用酶标仪采集数据，分析ROS荧光值。
各组所用样品同上述实验1。
通过测定斑马鱼尾鳍面积的变化及ROS荧光值的变化，评价其光损伤修复作用，结果如图5所示，本发明实施例1、对比例1和对比例2的抗光损伤作用均明显好于对照例，且本发明实施例1的抗光损伤作用优于对比例1、对比例2和对比例3，说明本发明实施例1制备的柞蚕丝素肽脂质体对斑马鱼光损伤具有显著的预防作用。
综合以上试验结果，说明本发明的柞蚕丝素肽脂质体能够有效防御紫外线等光辐射损伤，并可以对肌肤起到保护修复作用，在抗光损伤方面具有显著的增效作用。
Claims (3)
1.一种抗光损伤的柞蚕丝素肽脂质体的制备方法，其特征在于按照如下步骤进行：
步骤1.称取定量的柞蚕丝素肽于烧杯中，加入硅藻多糖和硅藻壳，溶解于1/10~2/10体积PH值为7~9的PBS缓冲溶液中，得到水相，所述柞蚕丝素肽、硅藻多糖和硅藻壳的质量份数分别为40~50份、4~6份、2~5份；
步骤2.称取定量的磷脂、胆固醇和维生素E置于1/5~2/5体积氯仿溶液中，搅拌至完全溶解，得到有机相，所述磷脂、胆固醇和维生素E的质量份数分别为4~6份、40~65份、2~5份；
步骤3.将所得水相及有机相混合后进行第一次超声处理，得到白色乳浊液，在37 ℃的水浴温度下进行旋转蒸发除去有机溶剂并在烧瓶内壁上形成乳浊液薄膜；再加入质量份数为3~6份的嗜酸乳杆菌及2/5~3/5体积PH值为7~9的PBS缓冲溶液，进行第二次旋转蒸发，使乳浊液薄膜脱落至PBS缓冲溶液中并除尽残余的有机溶剂，之后再进行第二次超声处理；最后再加入2/10~3/10体积PH值为7~9的PBS缓冲溶液定容。
2.根据权利要求1所述的抗光损伤的柞蚕丝素肽脂质体的制备方法，其特征在于所述磷脂为大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂或氢化大豆磷脂。
3.根据权利要求1或2所述的抗光损伤的柞蚕丝素肽脂质体的制备方法，其特征在于所述步骤3第一次超声处理时长为2~4 min，第二次超声处理时长为4~6 min。
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