CN115725709A - 一种利用16S rRNA基因测序技术检测里岔黑猪肠道菌群辅助育种的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用16S rRNA基因测序技术检测里岔黑猪肠道菌群辅助育种的方法，属于生物技术分子育种技术领域。包括：提取里岔黑猪粪便的总DNA并扩增，建库测序后分析得到与饲料利用率相关的普氏菌属、密螺旋体属、瘤胃球菌属和乳酸杆菌属的相对丰度信息和肠道微生物ɑ‑多样性指数，来辅助里岔黑猪育种。本发明通过检测里岔黑猪肠道菌群，辅助选择具有高饲料利用率的个体，通过与分子育种结合，可以极大提高育种效率，最终降低里岔黑猪养殖成本。
Description
技术领域
本发明属于生物技术分子育种技术领域，尤其涉及一种利用16S rRNA基因测序技术检测里岔黑猪肠道菌群辅助育种的方法。
背景技术
我国有多种优良的地方猪种质资源，其中里岔黑猪属于山东省著名的地方猪种，兼具瘦肉率高、繁殖力强、适应性强和肉品质好等诸多优良特性。随着养猪产业集约化、规模化的快速发展，里岔黑猪的养殖规模也越来越大。猪的集约化生产中，消耗在饲料上的费用比重超过总支出的60％，猪的饲料利用率在很大程度上影响养殖生产成本和总体经济效益。因此，亟需更加全面且多样化的育种策略，来提高生猪饲料利用率，节约成本，减少粮食资源的浪费，从而减少养殖污染。
目前的育种方法主要为基因组育种及人工选择育种，但饲料利用率的遗传力较低(0.1～0.2)，仅通过分子育种选择进展缓慢，难以有效对饲料利用率进行改良。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用16S rRNA基因测序技术检测里岔黑猪肠道菌群辅助育种的方法，本发明通过检测里岔黑猪肠道菌群，辅助选择具有高饲料利用率的个体，通过与分子育种结合，可以极大提高育种效率，最终降低里岔黑猪养殖成本。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种利用16S rRNA基因测序技术检测里岔黑猪肠道菌群辅助育种的方法，包括以下步骤：
1)提取里岔黑猪粪便的总DNA，以所述总DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物，将所述扩增产物进行建库并测序，得到原始测序序列；
2)将所述步骤1)得到的原始测序序列使用fastp软件进行质控，并使用FLASH软件进行拼接，过滤得到优化序列；
3)使用UPARSE软件根据97％的相似性对步骤2)得到的优化序列进行OTU聚类，得到与OTU代表序列相似性在97％以上的序列；
4)采用RDP classifier贝叶斯算法对步骤3)所述的与OTU代表序列相似性在97％以上的序列进行分类学分析，得到与饲料效率相关的普氏菌属、密螺旋体属、瘤胃球菌属和乳酸杆菌属的相对丰度信息；
5)根据OTU数目和相似性在97％以上的序列信息，计算里岔黑猪肠道微生物的ɑ-多样性指数；
6)根据步骤4)得到的相对丰度信息和步骤5)得到的ɑ-多样性指数辅助里岔黑猪育种；
所述肠道微生物的ɑ-多样性指数越低，肠道微生物群落多样性越高，所述里岔黑猪的饲料利用率越高；
所述普氏菌属的相对丰度信息越高，所述里岔黑猪的饲料利用率越低；
所述密螺旋体属、瘤胃球菌属和乳酸杆菌属的相对丰度信息越高，所述里岔黑猪的饲料利用率越高。
优选的，所述步骤1)PCR扩增使用的引物包括上游引物338F和下游引物806R；
所述上游引物338F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述下游引物806R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
优选的，所述步骤1)PCR扩增的反应体系包括：5×FastPfu Buffer 4μL、2.5mMdNTPs 2μL、浓度为5μM的上下游引物各0.8μL、FastPfu Polymerase0.4μL、BSA 0.2μL、总DNA 10ng，ddH2O补至20μL。
优选的，所述PCR扩增的程序包括：95℃3min；95℃30s，55℃30s，72℃45s，循环30次；72℃10min。
优选的，所述步骤2)原始测序序列质控和拼接包括：过滤reads尾部质量值20以下的碱基，设置50bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50bp以下的reads，去除含N碱基的reads；根据PE reads之间的overlap关系，将成对reads拼接成一条序列，最小overlap长度为10bp；拼接序列的overlap区允许的最大错配比率为0.2，筛选不符合序列并去除；根据序列首尾两端的barcode和引物区分样品，并调整序列方向，barcode允许的错配数为0，最大引物错配数为2。
优选的，所述步骤3)OTU聚类包括：对步骤2)获得的优化序列提取非重复序列，并去除没有重复的单序列；按照97％相似性对非重复序列进行OTU聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU代表序列；将所有优化序列map至OTU代表序列，得到与OTU代表序列相似性在97％以上的序列。
优选的，所述步骤4)分类学分析包括：比对Silva 16S rRNA数据库，设置比对阈值为70％。
优选的，所述步骤5)ɑ-多样性指数包括Simpson指数。
本发明通过检测其肠道菌群特征，α-多样性指数及相关菌种的丰度：乳酸杆菌属，密螺旋体属，瘤胃球菌属，普氏菌属，辅助判断高饲料利用率和低饲料利用率的个体，结合基因组分子育种技术，能够有效选择高饲料利用率的个体，减少饲料资源的浪费，降低养殖成本，具有极大的辅助育种参考价值。
本发明的有益效果为：
本发明通过检测里岔黑猪粪便样品的肠道菌群数据，分析比对关键菌属丰度及α-多样性指数的高低，能够辅助选择出具有高饲料利用率的里岔黑猪，与现有的分子基因组检测方式结合，能够有效判断里岔黑猪的饲料利用潜力，为精准育种提供了分子基础。其次，本发明取粪便进行检测，不会对里岔黑猪造成应激，不影响正常生产，安全性较高，并且16s检测费用低廉，能有效推广利用。
具体实施方式
实施例1
本发明提供了一种利用16S rRNA基因测序技术检测里岔黑猪肠道菌群辅助育种的方法，包括以下步骤：
1)提取里岔黑猪粪便的总DNA，以所述总DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物，将所述扩增产物进行建库并测序，得到原始测序序列；
2)将所述步骤1)得到的原始测序序列使用fastp软件进行质控，并使用FLASH软件进行拼接，过滤得到优化序列；
3)使用UPARSE软件根据97％的相似性对步骤2)得到的优化序列进行OTU聚类，得到与OTU代表序列相似性在97％以上的序列；
4)采用RDP classifier贝叶斯算法对步骤3)所述的与OTU代表序列相似性在97％以上的序列进行分类学分析，得到与饲料效率相关的普氏菌属、密螺旋体属、瘤胃球菌属和乳酸杆菌属中的相对丰度信息；
5)根据OTU数目和相似性在97％以上的序列信息，计算里岔黑猪肠道微生物的ɑ-多样性指数；
6)根据步骤4)得到的相对丰度信息和步骤5)得到的ɑ-多样性指数辅助里岔黑猪育种；
所述肠道微生物的ɑ-多样性指数越低，肠道微生物群落多样性越高，所述里岔黑猪的饲料利用率越高；
所述普氏菌属的相对丰度信息越高，所述里岔黑猪的饲料利用率越低；
所述密螺旋体属、瘤胃球菌属和乳酸杆菌属的相对丰度信息越高，所述里岔黑猪的饲料利用率越高。
本发明提取里岔黑猪粪便的总DNA，以所述总DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物。
本发明对提取里岔黑猪粪便的总DNA的方法没有特殊限定，本领域技术人员采用常规方法即可，如使用
Pro Kit试剂盒对粪便DNA进行抽提，具体的：
1)添加0.5g样品、800μL CD1到试剂盒配套研磨管中，研磨仪中震荡40s，速度6m/s；
2)将研磨管放入离心机，室温14000rpm，离心3min；
3)将上清转移到2mL离心管中，加入200μL CD2，混匀；
4)室温14000rpm，离心3min；
5)将上清转移到2mL离心管中，加入600μL CD3，混匀；
6)取650μL混合液至吸附柱，室温14000rpm，离心3min，弃滤液；
7)再取剩余混合液至吸附柱，室温14000rpm，离心3min，弃滤液；
8)添加500μL EA至吸附柱中，室温14000rpm，离心1min，弃滤液；
9)添加500μL C5至吸附柱中，室温14000rpm，离心1min，弃滤液；
10)室温14000rpm离心3min，去除残留溶液；
11)将吸附柱放入新的2mL离心管中，开盖放置3min；
12)添加100μL C6至吸附柱中；
13)室温14000rpm离心1min洗脱，弃柱，得到总DNA。
14)使用1％琼脂糖凝胶电泳和超微量分光光度计检测抽提基因组DNA。
在本发明中，所述PCR扩增使用的引物包括上游引物338F和下游引物806R；所述上游引物338F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述下游引物806R的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示，具体如下：
SEQ ID No.1：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；
SEQ ID No.2：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。
在本发明中，所述PCR扩增的反应体系包括：5×FastPfu Buffer 4μL、2.5mMdNTPs 2μL、浓度为5μM的上下游引物各0.8μL、FastPfu Polymerase0.4μL、BSA 0.2μL、总DNA 10ng，ddH2O补至20μL。在本发明中，所述PCR扩增的程序优选包括：95℃3min；95℃30s，55℃30s，72℃45s，循环反应30次；72℃10min。
本发明将得到的扩增产物进行建库测序，得到的原始测序序列使用fastp软件进行质控，并使用FLASH软件进行拼接，过滤得到优化序列。
本发明将得到的优化序列使用UPARSE软件根据97％的相似性进行OTU聚类，得到与OTU代表序列相似性在97％以上的序列。在本发明中，所述OTU聚类优选包括：对优化序列提取非重复序列，去除没有重复的单序列；按照97％相似性对非重复序列(不含单序列)进行OTU聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU代表序列；将所有优化序列map至OTU代表序列，得到与OTU代表序列相似性在97％以上的序列。
本发明采用RDP classifier贝叶斯算法对与OTU代表序列相似性在97％以上的序列进行分类学分析，得到普氏菌属、密螺旋体属、瘤胃球菌属和乳酸杆菌属的相对丰度信息。在本发明中，所述分类学分析优选包括：比对Silva 16S rRNA数据库(v138)，设置比对阈值为70％。
本发明根据OTU数目和序列信息，计算肠道微生物的ɑ-多样性指数。在本发明中，所述ɑ-多样性指数优选包括simpson指数。
本发明根据得到的相对丰度信息和得到的ɑ-多样性指数辅助里岔黑猪育种；所述ɑ-多样性指数(Simpson)越低，肠道微生物群落多样性越高，所述里岔黑猪的饲料利用率越高；所述普氏菌属的相对丰度信息越高，所述里岔黑猪的饲料利用率越低；所述密螺旋体属、瘤胃球菌属和乳酸杆菌属的相对丰度信息越高，所述里岔黑猪的饲料利用率越高。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例2
以本发明进行里岔黑猪的辅助判别试验，以验证本方法的准确性。
选择断奶批次相同、健康状况良好、体重在25±1kg的纯种里岔黑母猪200头，在同一栋猪舍中进行饲养，10～12头猪一栏，自由采食玉米-豆粕型商品日粮，除了相同的免疫程序外，保证试验猪在试验期内不被饲喂或注射药物抗生素类物质。采用自动饲喂记料系统，通过电子耳标识别，记录试验猪群中每个个体从120(约50kg)到165日龄期间的饲料采食量和体重变化，根据饲料转化率(FCR，feed conversion ratio)公式，饲料转化率(％)＝饲料采食量/体增重，计算出所有个体的在这一段时期的饲料转化率。
对试验猪群按照饲料转化率计算值的大小进行排序，选择饲料转化率高低两端的个体各20头，分为两组，饲料转化率数值高的个体相对饲料效率低，设成低组，饲料转化率数值低的个体饲料效率相对高，称之为高组，见表1。
表1不同组别饲料转化率(％)
| 指标 | 低组 | 高组 | P值 |
| 样本量 | 20 | 20 | |
| 饲料转化率 | 2.049±0.065 | 2.834±0.145 | 2.522E-23 |
| 日采食量 | 1.883±0.124 | 2.245±0.214 | 1.047E-07 |
| 平均日增重 | 0.920±0.074 | 0.794±0.087 | 1.582E-05 |
| 初始体重 | 50.860±1.444 | 50.535±0.528 | 0.350 |
| 结测体重 | 92.274±3.237 | 86.266±4.170 | 1.002E-05 |
采用本发明的方法对两组长白母猪进行检测。
首先，提取两组猪的粪便样本，提取总DNA，具体为使用
Pro Kit试剂盒对粪便DNA进行抽提，获得粪便基因组DNA，具体为：
1)添加0.5g样品、800μL CD1到试剂盒配套研磨管中，研磨仪中震荡40s，速度6m/s；
2)将研磨管放入离心机，室温14000rpm，离心3min；
3)将上清转移到2mL离心管中，加入200μL CD2，混匀；
4)室温14000rpm，离心3min；
5)将上清转移到2mL离心管中，加入600μL CD3，混匀；
6)取650μL混合液至吸附柱，室温14000rpm，离心3min，弃滤液；
7)再取剩余混合液至吸附柱，室温14000rpm，离心3min，弃滤液；
8)添加500μL EA至吸附柱中，室温14000rpm，离心1min，弃滤液；
9)添加500μL C5至吸附柱中，室温14000rpm，离心1min，弃滤液；
10)室温14000rpm离心3min，去除残留溶液；
11)将吸附柱放入新的2mL离心管中，开盖放置3min；
12)添加100μL C6至吸附柱中；
13)室温14000rpm离心1min洗脱，弃柱，得到总DNA。
14)使用1％琼脂糖凝胶电泳和超微量分光光度计检测抽提基因组DNA。。
接下来，对粪便DNA进行PCR扩增，PCR扩增使用的引物具体如下：
上游引物338F(SEQ ID No.1)：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；
下游引物806R(SEQ ID No.2)：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。
PCR扩增的反应体系为：5×FastPfu Buffer 4μL、2.5mM dNTPs 2μL、浓度为5μM的上下游引物各0.8μL、FastPfu Polymerase 0.4μL、BSA 0.2μL、总DNA 10ng，ddH2O补至20μL。PCR扩增的具体步骤为：95℃预变性3min；接着95℃30s，55℃退火30s，72℃延长45s，循环反应30次，最后72℃扩增10min，回收PCR产物进行后续检测。使用2％琼脂糖凝胶电泳检测产物。对PCR产物进行纯化及荧光定量。
建库测序及肠道菌群数据分析，具体的：对测序获得的原始数据进行质控，使用UPARSE软件，根据97％的相似度对序列进行OTU聚类，具体流程如下：对优化序列提取非重复序列，去除没有重复的单序列；按照97％相似性对非重复序列(不含单序列)进行OTU聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU代表序列；将所有优化序列map至OTU代表序列，选出与OTU代表序列相似性在97％以上的序列。
采用RDP classifier贝叶斯算法对97％相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，比对Silva 16S rRNA数据库(v138)，设置比对阈值为70％，获得乳酸杆菌属、、瘤胃球菌属、密螺旋体属、普氏菌属等饲料利用率标记菌种的相对丰度信息。并根据样本OTU数目及序列信息，计算样本菌群的α-多样性指数(simpson指数)。
采用上述方法，分析高组和低组的菌群丰度信息。通过对比，发现不同饲料利用率猪相关菌种的丰度与预期吻合，具体为：普氏菌属Prevotella(HFCR，7.97％；LFCR，12.23％)，密螺旋体属Treponema(HFCR，10.74％；LFCR，4.88％)，瘤胃球菌属Ruminococcus(HFCR，3.03％；LFCR，2.67％)，乳酸杆菌属Lactobacillus(HFCR，3.52％；LFCR，2.01％)。其中，乳酸杆菌属，瘤胃球菌属，密螺旋体属的相对丰度越高，饲料利用率更高，而普氏菌属相对丰度越高，饲料利用率更低。此外，通过在属水平进行LEfSe判别分析后发现，普氏菌属Prevotella显著富集在低组，密螺旋体属Treponema、瘤胃球菌属Ruminococcus和乳酸杆菌属Lactobacillus显著富集到了高组。同样符合判断标准。
分析高组和低组的α-多样性指数(simpson)，结果见表2。通过对比，发现高组的α-多样性指数(simpson)显著低于低组，即高组的肠道微生物群落多样性显著更高，即饲料利用率更高。
表2不同饲料效率组别α-多样性指数
| 组别(group) | simpson指数 |
| HFCR | 0.979±0.015 |
| LFCR | 0.987±0.007 |
| P值 | 0.036 |
综上，表明依靠微生物信息辅助选择高饲料利用率猪具有良好的准确性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种利用16S rRNA基因测序技术检测里岔黑猪肠道菌群辅助育种的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取里岔黑猪粪便的总DNA，以所述总DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物，将所述扩增产物进行建库并测序，得到原始测序序列；
2)将所述步骤1)得到的原始测序序列使用fastp软件进行质控，并使用FLASH软件进行拼接，过滤得到优化序列；
3)使用UPARSE软件根据97％的相似性对步骤2)得到的优化序列进行OTU聚类，得到与OTU代表序列相似性在97％以上的序列；
4)采用RDP classifier贝叶斯算法对步骤3)所述的与OTU代表序列相似性在97％以上的序列进行分类学分析，得到与饲料效率相关的普氏菌属、密螺旋体属、瘤胃球菌属和乳酸杆菌属的相对丰度信息；
5)根据OTU数目和相似性在97％以上的序列信息，计算里岔黑猪肠道微生物的ɑ-多样性指数；
6)根据步骤4)得到的相对丰度信息和步骤5)得到的ɑ-多样性指数辅助里岔黑猪育种；
所述肠道微生物的ɑ-多样性指数越低，肠道微生物群落多样性越高，所述里岔黑猪的饲料利用率越高；
所述普氏菌属的相对丰度信息越高，所述里岔黑猪的饲料利用率越低；
所述密螺旋体属、瘤胃球菌属和乳酸杆菌属的相对丰度信息越高，所述里岔黑猪的饲料利用率越高。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)PCR扩增使用的引物包括上游引物338F和下游引物806R；
所述上游引物338F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述下游引物806R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)PCR扩增的反应体系包括：5×FastPfu Buffer 4μL、2.5mM dNTPs 2μL、浓度为5μM的上下游引物各0.8μL、FastPfuPolymerase 0.4μL、BSA 0.2μL、总DNA 10ng，ddH2O补至20μL。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序包括：95℃3min；95℃30s，55℃30s，72℃45s，循环30次；72℃10min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)原始测序序列质控和拼接包括：过滤reads尾部质量值20以下的碱基，设置50bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50bp以下的reads，去除含N碱基的reads；根据PEreads之间的overlap关系，将成对reads拼接成一条序列，最小overlap长度为10bp；拼接序列的overlap区允许的最大错配比率为0.2，筛选不符合序列并去除；根据序列首尾两端的barcode和引物区分样品，并调整序列方向，barcode允许的错配数为0，最大引物错配数为2。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)OTU聚类包括：对步骤2)获得的优化序列提取非重复序列，并去除没有重复的单序列；按照97％相似性对非重复序列进行OTU聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU代表序列；将所有优化序列map至OTU代表序列，得到与OTU代表序列相似性在97％以上的序列。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)分类学分析包括：比对Silva16S rRNA数据库，设置比对阈值为70％。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5)ɑ-多样性指数包括Simpson指数。
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| US20190390246A1 (en) * | 2015-06-25 | 2019-12-26 | Ascus Biosciences, Inc. | Methods, apparatuses and systems for analyzing microorganism strains from complex heterogeneous communities, predicting and identifying functional relationships and interactions thereof, selecting and synthesizing endomicrobial ensembles based thereon, and endomicrobial ensemble supplements and supplementation |
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2022
- 2022-10-13 CN CN202211256204.2A patent/CN115725709A/zh active Pending
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