CN115725510A

CN115725510A - 一株针对PCV2b型Cap蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株2A5、单克隆抗体及应用

Info

Publication number: CN115725510A
Application number: CN202210953392.8A
Authority: CN
Inventors: 高崧; 杨磊; 杨梦诗; 郇长超; 高清清
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2022-08-10
Filing date: 2022-08-10
Publication date: 2023-03-03

Abstract

本发明提供了一株针对PCV2b型Cap蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株2A5、单克隆抗体及应用，涉及单克隆抗体技术领域。本发明提供了单克隆抗体杂交瘤细胞株2A5，还提供了产生的单克隆抗体。同时，鉴定了该单克隆抗体针对的抗原表位；还以FITC荧光素进行标记，获得FITC直接标记抗体，建立直接免疫荧光方法，并应用于PCV2b和PCV1‑2b病毒的定量。

Description

一株针对PCV2b型Cap蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株2A5、单克隆抗体及应用

技术领域

本发明属于单克隆抗体技术领域，具体涉及一株针对PCV2b型Cap蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株2A5、单克隆抗体及应用。

背景技术

猪圆环病毒病(porcine circovirus-associated disease，PCVAD)目前在世界多个国家和地区流行，已成为一种严重危害世界养猪业的疾病，给养猪业造成了严重的经济损失。猪圆环病毒病，是由猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)感染引起的，主要有断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)、猪皮炎和肾病综合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)、猪呼吸系统疾病复合症(porcine respiratory disease complex，PRDC)等。2001年我国首次发现并从猪群中分离出PCV2。

猪圆环病毒是已发现的最小病毒，属于圆环病毒科(Circoviridae)，圆环病毒属(Circovirus)。根据PCV的基因组组成及其抗原性可分为PCV1、PCV2、PCV3和PCV4四种基因型，其基因组大小在1700至2000bp之间。PCV的基因组含有11个开放阅读框(ORF)，位于DNA正链上的ORF1编码病毒复制相关的Rep蛋白，是最大的开放阅读框；而位于互补链上的ORF2编码病毒的主要结构蛋白Cap蛋白，该蛋白的氨基端是精氨酸富集区，序列高度保守，推测可能与病毒DNA结合有关，也是病毒的主要抗原表位聚集区。

Cap蛋白作为PCV的主要结构蛋白，是国内外学者研究的重点。已有若干机构研制出针对PCV2 Cap蛋白的单克隆抗体并应用于临床诊断，但未见应用单克隆抗体测定PCV2或嵌合型猪圆环病毒(PCV1-2)毒株TCID₅₀的报道。研制可测定PCV2或PCV1-2毒株TCID₅₀的单克隆抗体非常重要，因为在猪圆环病毒全病毒灭活疫苗的研制、生产中，(1)疫苗中病毒含量的定量离不开TCID50的测定；(2)进行免疫攻毒试验评价疫苗的免疫效力时，需要对攻毒用PCV2毒株进行定量；(3)嵌合型猪圆环病毒活疫苗、灭活疫苗的研制、生产中，同样需要对嵌合型猪圆环病毒(如C1-233株)进行定量。所有这些定量过程均离不开针对PCV2或嵌合型猪圆环病毒(PCV1-2)的特异性抗体，现有抗体多采用猪抗PCV2的多克隆抗体，后者至少存在2个固有缺陷，一是多克隆抗体来自免疫或感染猪，不同猪个体间的抗体水平、抗体均一性均无法保证；二是抗体来自免疫或感染猪，其来源有限。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一株针对PCV2b型Cap蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株2A5、单克隆抗体及应用，产生的单克隆抗体通过直接或间接免疫荧光试验与PCV2b、PCV1-2b毒株具有较强的反应性，可用于PCV2b、PCV1-2b病毒的TCID₅₀定量测定，为PCV2灭活疫苗、嵌合型猪圆环病毒灭活疫苗、活疫苗的研究提供敏感、特异、均一的检测制剂。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一株针对猪圆环病毒2b型Cap蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株2A5，所述单克隆抗体杂交瘤细胞株2A5已进行保藏，保藏编号为CGMCC N_O.45231。

优选的，所述单克隆抗体杂交瘤细胞株2A5针对的抗原表位为猪圆环病毒2b型Cap蛋白225-229位氨基酸。

本发明还提供了上述单克隆抗体杂交瘤细胞株2A5的构建方法，包括以下步骤：将去除PCV2d 0728株核定位信号肽的orf2片段克隆至原核表达载体上，构建原核表达质粒；

将所述原核表达质粒转化至大肠杆菌中进行诱导表达，获得可溶性表达的重组蛋白；纯化后免疫3次小鼠，测定免疫小鼠血清中针对PCV2 Cap蛋白的酶联免疫吸附试验抗体效价，加强免疫后取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合制备杂交瘤细胞，筛选阳性细胞后亚克隆，得所述单克隆抗体杂交瘤细胞株2A5。

优选的，将SEQ ID NO.1所示序列的124～702bp克隆至原核表达载体pET-28a上。

本发明还提供了一种上述单克隆抗体杂交瘤细胞株2A5产生的Cap单克隆抗体。

本发明还提供了上述单克隆抗体杂交瘤细胞株2A5或上述Cap单克隆抗体在制备定量PCV2b和PCV1-2b病毒的试剂中的应用。

优选的，所述试剂包括免疫荧光法检测或Western blotting检测所涉及的试剂。

优选的，所述试剂包括直接免疫荧光检测所涉及的试剂。

本发明还提供了一种用于直接免疫荧光检测的FITC标记单克隆抗体，所述单克隆抗体为上述单克隆抗体杂交瘤细胞株2A5产生的Cap单克隆抗体或上述Cap单克隆抗体。

本发明还提供了一种测定猪圆环病毒2b型PCV2b株和PCV1-2b株病毒的半数感染量的试剂盒，所述试剂盒中包括上述FITC标记单克隆抗体。

有益效果：本发明提供了一株针对猪圆环病毒2b型Cap蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株2A5及利用所述单克隆抗体杂交瘤细胞株2A5所产生的Cap单克隆抗体，所述单克隆抗体杂交瘤细胞株2A5针对的抗原表位²²⁵NLKDP²²⁹迄今尚未见报道，这一表位保证了单克隆抗体杂交瘤细胞株2A5与PCV2b或PCV1-2b病毒的结合，同时，该单克隆抗体适合FITC的直接标记。本发明还基于FITC直接标记抗体，建立了直接免疫荧光方法的试剂盒，可应用于PCV2b和PCV1-2b病毒的定量，尤其可用于PCV2b和PCV1-2b病毒半数感染量(TCID₅₀)的测定，为PCV2灭活疫苗、嵌合型猪圆环病毒灭活疫苗、活疫苗的研究提供敏感、特异、均一的检测制剂。

生物保藏信息

猪圆环病毒2b型荧光反应性单克隆抗体杂交瘤细胞株2A5，于2022年7月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，具体保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC N_O.45231。

附图说明

图1是本发明实施例1中PCV2d的orf2片段扩增电泳图；其中，M为DNA分子量标准DL5000，1：PCV2d去除核定位信号肽的orf2片段；

图2是本发明实施例2中重组Cap蛋白抗原表达形式鉴定的考马斯亮蓝染色图；其中，M为蛋白分子量标准；1：裂解全菌His-rCap；2：pET28a诱导裂解全菌；3：裂解沉淀His-rCap；4：pET28a诱导裂解沉淀；5：裂解上清His-rCap；6：pET28a诱导裂解上清；

图3是本发明实施例2中用PCV2感染猪阳性血清和His标签抗体检测重组蛋白His-rCap表达的Western blotting图；其中，M为蛋白分子量标准；1：猪PCV2阳性血清与His-rCap蛋白反应；2：猪PCV2阳性血清与pET-28a蛋白反应；3：His抗体与His-rCap蛋白反应；4：His抗体与pET-28a蛋白反应；

图4是本发明实施例2中重组Cap蛋白表达条件优化后的考马斯亮蓝染色图；其中，M为蛋白分子量标准；1：8h诱导裂解上清；2：10h诱导裂解上清；3:12h诱导裂解上清；4:14h诱导裂解上清；5:16h诱导裂解上清；

图5是本发明实施例2中不同浓度咪唑洗涤后，重组Cap蛋白的考马斯亮蓝染色图；其中，M为蛋白分子量标准；1：重组蛋白纯化前；2：100mM咪唑洗涤缓冲液洗涤；3：250mM咪唑洗脱缓冲液洗脱；

图6是本发明实施例5中10倍稀释的单克隆抗体2A5株细胞上清与重组蛋白His-rCap的Western blotting反应图；M为蛋白分子量标准；1：重组蛋白His-rCap；

图7是本发明实施例5中单克隆抗体检测PCV2b 0233株、PCV2d 0728株、PCV1-2b(C1-233)株感染的PK15 B6细胞中Cap蛋白的Western blotting图；M为蛋白分子量标准；1：PCV2b 0233株感染的PK15 B6细胞；2：PCV1-2b C1-233株感染的PK15 B6细胞；3：PCV2d0728株感染的PK15 B6细胞；

图8是本发明实施例5中单克隆抗体检测PCV2b 0233株、PCV2d 0728株、PCV1-2bC1-233株、PCV1株感染的PK15 B6细胞中Cap蛋白的IFA图；A：PCV2b 0233株感染的PK15 B6细胞；B：PCV2d 0728株感染的PK15 B6细胞；C：PCV1-2b C1-233株感染的PK15 B6细胞；D：PCV1株感染的PK15 B6细胞；E：健康的PK15 B6细胞；

图9是本发明实施例5中检测单克隆抗体与其他蛋白交叉反应的ELISA OD₄₅₀值；

图10是本发明实施例6中单克隆抗体2A5株抗原表位的Western blotting鉴定图；其中，M为蛋白分子量标准；1：截短蛋白N1；2：截短蛋白N2；3：截短蛋白N3；4：截短蛋白N4；5：截短蛋白N5；6：截短蛋白N6；7：截短蛋白N7；8：截短蛋白N8；9：截短蛋白N9；10：截短蛋白N10；11：截短蛋白N11；12：截短蛋白N12；13：截短蛋白N13；14：截短蛋白N14；单克隆抗体2A5株识别225NLKDP229(只与N4-N14反应，不与N1-N3反应)；

图11是本发明实施例8中FITC直接标记抗体检测PCV2b 0233株感染的PK15 B6的直接免疫荧光试验(direct fluorescent assay,DFA)图；其中，A:直接标记抗体1:200稀释；B:直接标记抗体1:400稀释；C:直接标记抗体1:800稀释；D:直接标记抗体1:1600稀释；E:直接标记抗体1:3200稀释；F:直接标记抗体1:6400稀释；G:直接标记抗体1:1600稀释，孵育30min；H:直接标记抗体1:1600稀释，孵育60min；I:直接标记抗体1:1600稀释，孵育90min。对PCV2b 0233株的荧光检测，直接标记单克隆抗体2A5株的最适工作浓度为1:1600，最适孵育时间为60min；

图12是本发明实施例8中FITC直接标记抗体检测PCV1-2b C1-233株感染的PK15B6的DFA图；其中，A:直接标记抗体1:200稀释；B:直接标记抗体1:400稀释；C:直接标记抗体1:800稀释；D:直接标记抗体1:1600稀释；E:直接标记抗体1:3200稀释；F:直接标记抗体1:6400稀释；G:直接标记抗体1:1600稀释，孵育30min；H:直接标记抗体1:1600稀释，孵育60min；I:直接标记抗体1:1600稀释，孵育90min。对PCV1-2b C1-233株的荧光检测，直接标记单克隆抗体的最适工作浓度为1:1600，最适孵育时间为60min；

图13是本发明实施例9中猪的阳性血清与FITC直接标记的2A5株单克隆抗体用于测定PCV2b 0233株和PCV1-2b C1-233株的半数感染量的效果对比图；其中，A：直接标记的2A5单克隆抗体检测PCV2b 0233株，单克隆抗体稀释倍数1:1600，孵育时间60min；曝光时间500ms；B：猪阳性血清检测PCV2b 0233株，抗体稀释度1:1000，孵育时间60min；曝光时间300ms；C：直接标记的2A5单克隆抗体检测PCV1-2b C1-233株，单克隆抗体稀释倍数1:1600，孵育时间60min；曝光时间500ms；D：猪阳性血清检测PCV1-2b C1-233株，抗体稀释度1:1000，孵育时间60min；曝光时间300ms。

具体实施方式

本发明所述单克隆抗体杂交瘤细胞株2A5针对的抗原表位为猪圆环病毒2b型Cap蛋白225-229位氨基酸，具体序列为²²⁵NLKDP²²⁹。

本发明在构建所述单克隆抗体杂交瘤细胞株2A5时，首先需要构建重组蛋白原核表达载体，ORF2作为PCV2的主要阅读框，编码核衣壳Cap蛋白，Cap蛋白氨基端区域的前41个氨基酸起核定位作用，称为核定位信号肽，其中的疏水性氨基酸序列难以原核表达。因此，本发明优选对所述Cap蛋白进行截短表达，仅表达第42至233位氨基酸，即将SEQ ID NO.1所示序列的124～702bp克隆至原核表达载体pET-28a上，构建原核表达质粒pET28a-orf2-His。本发明所述克隆优选包括将所述基因插入所述pET-28a的BamHI和HindIII酶切位点之间。本发明对所述克隆的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规克隆方法即可。本发明所述SEQ ID NO.1的序列如下所示，且下划线部分为表达序列：ATGACGTATCCAAGGAGGCGTTTCCGCAGACGAAGACACCGCCCCCGCAGCCATCTTGGCCAGATCCTCCGCCGCCGCCCCTGGCTAGTCCACCCCCGCCACCGTTACCGCTGGAGAAGGAAAAATGGCATCTTCAACACCCGCCTCTCCCGCACCATCGGTTATACTGTCAAGAAA ACCACAGTCAGAACGCCCTCCTGGAATGTGGACATGATGAGATTTAATATTAATGATTTTCTTCCCCCAGGAGGGG GCTCAAACCCCCTCACTGTGCCCTTTGAATACTACAGAATAAGGAAGGTTAAGGTTGAATTCTGGCCCTGCTCCCC AATCACCCAGGGTGACAGGGGAGTGGGCTCCACTGCTGTTATTCTAGATGATAACTTTGTAACAAAGGCCAATGCC CTAACCTATGACCCCTATGTAAACTACTCCTCCCGCCATACCATAACCCAGCCCTTCTCCTACCACTCCCGGTACT TTACCCCGAAACCTGTCCTTGATAGGACACTCGATTACTTCCAACCCAATAACAAAAGAAATCAACTCTGGCTGAG ACTACAAACTACTGGAAATGTAGACCATGTAGGCCTCGGCACTGCGTTCGAAAACAGTATATACGACCAGGACTAC AATATCCGTATAACCATGTATGTACAATTCAGAGAATTTAATCTTAAAGACCCCCCACTTAACCCTTAA。

本发明在得到所述原核表达质粒pET28a-orf2-His后，优选进行所述原核表达质粒pET28a-orf2-His的诱导表达与纯化。在本发明实施例中，优选将所述原核表达质粒pET28a-orf2-His转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达，获得可溶性表达的重组蛋白。本发明所述纯化优选包括利用Ni-NTA亲和柱纯化。

本发明优选利用纯化的重组蛋白免疫7周龄BALB/c小鼠，3次免疫后优选测定免疫小鼠血清中针对PCV2 Cap蛋白的酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immune sorbentassay，ELISA)抗体效价，加强免疫后取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合制备杂交瘤细胞，优选以间接免疫荧光试验(indirect fluorescent assay，IFA)方法筛选阳性孔并进行亚克隆，获得所述单克隆抗体杂交瘤细胞株2A5。

本发明所述Cap单克隆抗体可用于IFA、Western blotting检测；所述单克隆抗体重链为IgG2a，轻链为Kappa链；所针对的抗原表位为²²⁵NLKDP²²⁹。

本发明所述试剂优选包括免疫荧光法检测或Western blotting检测所涉及的试剂，更优选包括直接免疫荧光检测所涉及的试剂。

本发明优选对经纯化的单克隆抗体进行FITC标记，所述标记的方法并没有特殊限定，优选用辛酸硫酸铵法纯化后以FITC荧光素进行标记，获得了FITC直接标记抗体。

本发明基于所述FITC标记单克隆抗体建立了直接免疫荧光方法，优选包括设置不同FITC直接标记单克隆抗体的稀释度以及孵育时间，以确定荧光抗体最适工作条件。在本发明实施例中，确认FITC直接标记抗体的最适工作条件为标记抗体1:1600稀释，37℃孵育60min。在该条件下：感染PCV2b0233毒株和PCV1-2b C1-233株的PK15 B6细胞出现特异性荧光，阴性对照无荧光。在本发明实施例中，FITC直接标记单克隆抗体用于PCV2b 0233株和PCV1-2b C1-233株病毒的半数感染量(TCID₅₀)的测定。

下面结合实施例对本发明提供的一株针对PCV2b型Cap蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株2A5、单克隆抗体及应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

重组蛋白原核表达载体pET28a-orf2-His的构建

猪圆环病毒2d型(PCV2d/Changzhou/JS/20150728CZ，简称0728株，已公开于：杨梦师.猪圆环病毒2d型Cap蛋白单克隆抗体的研制和表位鉴定2020.扬州大学硕士学位论文)orf2序列如SEQ ID NO.1所示，插入第42至233位氨基酸至pET-28a中。

以PCV2d 0728株基因组为模板进行PCR扩增，获得orf2基因的截短片段，克隆至原核表达载体pET-28a的BamHI、HindIII中，获得pET-orf2-His原核表达质粒。

克隆引物：

PCV2d-F(SEQ ID NO.2)：ACGAGGATCCAATGGCATCTTCAACACCC；

PCV2d-R(SEQ ID NO.3)：ACGTAAGCTTTTAAGGGTTAAGTGGGG。

反应体系(50μL)：2×Phanta Max Buffer 25μL、dNTP Mix(10mM)1μL、上游引物(10mM)2μL、下游引物(10mM)2μL、基因组DNA 2μL、Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase 1μL和ddH₂O 17μL。

PCR反应条件：94℃预变性4min；94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min，12℃保存。

以设计的引物对重组质粒进行PCR鉴定，结果如图1所示，扩增出579bp片段，与预期大小一致。

实施例2

重组表达质粒pET28a-orf2-His的诱导表达与纯化

将重组表达质粒pET28a-orf2-His转化大肠杆菌BL21(DE)3，挑取菌落37℃培养，当菌液的OD₆₀₀值达到0.4～0.6，加入1Mm IPTG，在16℃、120rpm的条件下诱导表达14小时。

将上述诱导表达并离心后的菌液沉淀以0.01M PBS重悬后进行超声破碎，10000r/min离心10分钟，获得上清及沉淀，分别进行SDS-PAGE，结果如图2所示，重组蛋白可在上清中表达，采用NI-NTA亲和介质对重组Cap蛋白进行纯化。主要过程为：收集经上述条件诱导后的菌液，以0.01M的PBS洗涤两遍，超声破碎后10000r/min离心，收集上清，将预处理的镍柱组装好，调整流速为1Ml/min，加入收获的上清，以含100Mm咪唑的洗涤缓冲液洗去杂蛋白，以含250Mm咪唑的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白。取15Μl洗脱液与5Μl 4×loadingbuffer混匀后96℃金属浴作用10min，取5Μl样品进行SDS-PAGE电泳，并进行Westernblotting分析。

用PCV2感染猪阳性血清和His标签抗体检测重组蛋白His-rCap表达的Westernblotting图如图3所示；重组蛋白与猪阳性血清和His抗体都能反应，且条带大小正确，而空载与阳性血清和his抗体均不反应，说明获得的重组蛋白的特异性高。

经诱导表达后的考马斯亮蓝染色图如图4所示；诱导14h后的蛋白表达量最高。

不同浓度咪唑洗涤后，重组Cap蛋白的考马斯亮蓝染色图如图5所示；洗脱的蛋白条带单一，证明纯化效果好。

实施例3

小鼠免疫

将实施例2纯化的蛋白与等体积弗氏完全佐剂充分混匀乳化，皮下注射免疫6周龄BALB/c小鼠，免疫剂量为100μg/只，两周后取纯化的蛋白与等体积弗氏不完全佐剂充分混匀乳化，皮下免疫，剂量同第一次。二次免疫后两周再次免疫，免疫剂量与方法同第二次。三次免疫后一周眼球采血，分离血清，用间接ELISA测定血清中抗体效价，取效价较高的小鼠进行细胞融合。在细胞融合3天前，取100μg蛋白以0.01M PBS稀释至100μL后腹腔注射加强免疫。

间接ELISA方法具体步骤如下：

(1)以纯化的重组Cap蛋白包被酶标条，通过方阵试验确定最适包被浓度为0.29μg/mL，每孔100μL，4℃过夜，第2天用PBST洗涤3次，每次5min，拍干。

(2)加入5％的脱脂乳进行封闭，每孔100μL，37℃封闭90min，以PBST洗涤3次，每次5min，拍干。

(3)加入稀释的小鼠血清，37℃孵育1h，以PBST洗涤3次，每次5min，拍干。

(4)加入1:5000稀释的HRP酶标二抗，37℃孵育1h，用PBST洗涤3次，每次5min，拍干。

(5)加入TMB显色液，100μL/孔，37℃避光孵育15min。

(6)加入终止液，50μL/孔。

(7)酶标仪读取OD₄₅₀值。

实施例4

单克隆抗体杂交瘤细胞系2A5株的制备

(1)SP2/0细胞的准备

将长势良好并处于对数生长期的SP2/0细胞用无抗培养基轻轻吹下并进行计数。

(2)饲养细胞的制备

在细胞融合的前1天，健康ICR小鼠眼球采血制备阴性血清后，小鼠用来制备饲养细胞。具体步骤为：取健康6周龄ICR小鼠，眼球采血后脱颈处死，放入75％酒精中浸泡10min。将小鼠四肢固定于泡沫板上，用无菌剪刀、镊子剪开腹部皮肤，暴露腹膜。用20mL注射器吸取10mL提前冰浴的HAT培养基，腹腔注射至小鼠体内，用酒精棉球按摩腹部两侧，反复抽吸直至液体变黄，将吸出的液体与50mL HAT培养基混匀，滴入96孔板中，每孔2滴，边缘孔补加一滴，置37℃、CO₂培养箱中培养。

(3)脾细胞的制备

取效价较高的小鼠加强免疫后3天眼球采血致死，收集眼球血分离血清作为阳性对照血清。将小鼠置于75％酒精中浸泡10min后固定于泡沫板上，用无菌手术取出脾脏，将脾脏在装有DMEM培养基的平皿中洗涤干净，小心去除结缔组织。将脾脏转移至新的含有DMEM培养基的平皿中，用研磨棒在滤网上轻轻挤压研磨，研磨充分后将研磨液转移至50mL离心管中，1000rpm离心10min，用10mL DMEM培养基重悬，计数备用。

(4)细胞融合

将无抗无血清的100mL DMEM培养基、50mL HAT培养基、1mL PEG-1500(Sigma公司，货号10783641001)预热至37℃，将6瓶75mL方瓶中状态良好的SP2/0细胞以DMEM培养基吹下来，移至一个新的细胞瓶中，计数。将脾细胞与SP2/0细胞按5:1混匀至50mL离心管中，1000rpm离心10min，弃去上清，以手掌心轻击管底，使细胞沉淀分散均匀成糊状，将离心管置于盛有40℃水的烧杯中。边摇晃边逐滴加入1mL PEG-1500，1min内加完；继续边摇晃离心管边滴加提前预热的无抗无血清的DMEM，于90s内加入30mL培养基以终止融合。于37℃静置10min后1000rpm离心10min，弃上清，沉淀用HAT重悬后按每孔两滴加入到提前铺好饲养细胞的96孔板中，放入37℃、CO₂培养箱中继续观察培养。5d后半换液，10d后全换液，继续培养至细胞上清变黄后吸出检测。

(5)阳性细胞的筛选

当杂交瘤细胞长至视野的二分之一，或细胞上清变黄时，采用间接免疫荧光试验进行检测、筛选阳性孔。以杂交瘤细胞上清为一抗，FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗，融合小鼠血清为阳性对照，SP2/0细胞上清为阴性对照。具体操作步骤如下：

将分离、构建并保存的PCV 2b 0233株和PCV1-2b C1-233株(均公开于doi：10.3389/fmicb.2018.00455)分别接种PK15 B6细胞(MOI＝0.2)，传代2至3次，待细胞长至80％时，将细胞消化、吹散后铺96孔板，每孔100μL，放入细胞培养箱中培养。长满后取出，弃去培养基以0.01M PBS洗涤3遍，-20℃预冷的甲醇4℃固定15min。弃去固定液，0.01M PBS洗涤3遍，每孔加入100μL细胞上清，37℃孵育1h；弃去细胞上清，0.01M PBS洗涤3遍后每孔加入1:200稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG 30μL，37℃孵育45min；弃去二抗，0.01M PBS洗涤3遍后在荧光显微镜下观察。选取特异性荧光强的孔进行亚克隆，经过3次亚克隆，以同样方法筛选，获得了能稳定分泌针对Cap蛋白抗体的杂交瘤细胞株2A5，进行扩大培养后制备腹水。

(6)腹水的制备

选取经产10～12周龄雌性BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射500μL石蜡油进行致敏，1周后，将处于对数生长期的1×10⁵～1×10⁶个杂交瘤细胞注射于小鼠腹腔。每只小鼠200μL。4天后观察小鼠腹部，待小鼠腹部凸起时收集腹水，3000rpm离心10min，收集上清测定效价，-70℃保存。

实施例5

单克隆抗体的亚类、特异性鉴定

根据博奥龙公司单克隆抗体亚类鉴定试剂盒说明书，以ELISA方法进行单克隆抗体2A5株亚类的鉴定，轻链为Kappa，重链为IgG2a。

为验证单克隆抗体的特异性，以PCV2b 0233株、PCV2d 0728株和嵌合型猪圆环病毒PCV1-2b C1-233株感染PK15 B6细胞，进行间接免疫荧光检测和Western blotting分析。结果如图6和图7所示，2A5株单克隆抗体能特异性识别PCV2 0233株和嵌合病毒PCV1-2bC1-233株，而与PCV2d 0728株无反应。

用健康PK15 B6细胞和感染PCV1的PK15细胞进行IFA检测，结果如图8所示，无特异性荧光。用表达的PCV3-Rep蛋白，ASFV-P30蛋白，pET-28a空载体蛋白包被酶标板，结果如图9所示，与单克隆抗体2A5株均不反应。

实施例6

抗原表位鉴定

将Cap蛋白(42-233aa，SEQ ID NO.4：MTYPRRRFRRRRHRPRSHLGQILRRRPWLVHPRHRYRWRRKNGIFNTRLSRTIGYTVKKTTVRTPSWNVDMMRFNINDFLPPGGGSNPLTVPFEYYRIRKVKVEFWPCSPITQGDRGVGSTAVILDDNFVTKANALTYDPYVNYSSRHTITQPFSYHSRYFTPKPVLDRTLDYFQPNNKRNQLWLRLQTTGNVDHVGLGTAFENSIYDQDYNIRITMYVQFREFNLKDPPLNP)截短为14个肽段(N1：42-116aa；N2：42-130aa；N3：42-224aa；N4：42-229aa；N5：50-233aa；N6：56-233aa；N7：64-233aa；N8：69-233aa；N9：75-233aa；N10：79-233aa；N11：90-233aa；N12：96-233aa；N13:109-233aaN14：137-233aa)；

PCR方法见实施例1。重组质粒转化以及重组蛋白表达的具体方法见实施例2，根据Western blotting结果(图10)，单克隆抗体2A5株针对的Cap蛋白抗原表位序列为²²⁵NLKDP²²⁹。

表1 PCR方法所用引物信息

实施例7

单克隆抗体腹水纯化及FITC荧光素标记

用辛酸硫酸铵法进行腹水的初步纯化，具体操作步骤如下：

(1)取5mL腹水，加入10mL的醋酸缓冲液(59mL的0.06M的NaAc与41mL的0.06M的HAc混匀，调节pH至4.8)稀释，室温下边搅拌边加入正辛酸(每mL腹水加33μL)，4℃静置2h使充分沉淀。

(2)13000rpm离心30min，弃去沉淀，上清用细菌滤器过滤后，加入10％体积的0.1MPBS重悬，以氢氧化钠调节pH至7.4。边搅拌边加入等体积4℃预冷的饱和硫酸铵，4℃过夜。

(3)10000rpm离心10min，弃上清，沉淀用1mL 0.01M PBS重悬，透析过夜后即为纯化的抗体。

将纯化的腹水进行FITC荧光素标记，具体操作步骤如下：

(1)首先用BCA试剂盒测定纯化腹水的蛋白浓度为1.7mg/mL。

(2)将纯化腹水装入预先处理过的透析袋中，用碳酸盐缓冲液(无水碳酸钠8.6g，碳酸氢钠17.2g，1L蒸馏水，pH调至9.5)透析12h，期间多次换液。

(3)将抗体转移至10mL棕色小青瓶中，加入转子，置于磁力搅拌器上，低速搅拌，避免产生泡沫。避光称取FITC，用5％抗体体积的DMSO溶解，按每50μg FITC对应1mL腹水的比例逐滴加入FITC-DMSO溶液，于10min内加完，4℃避光搅拌过夜。

(4)以0.01M PBS透析24h，期间多次换液，至透析液清澈透亮即为标记抗体。

实施例8

直接免疫荧光方法的建立

设置不同FITC直接标记单克隆抗体的稀释度以及孵育时间，以确定荧光抗体最适工作条件。具体操作步骤如下：

(1)按实施例4(5)中的方法固定接种病毒的细胞板，加入以0.01MPBS梯度稀释的FITC直接标记抗体，第一孔为1:200稀释，第二孔为1:400稀释，以此类推，每孔100μL。抗体的孵育时间设置3个时间点，分别为30min，60min，90min。

(2)0.01M PBS洗涤3次，每次200μL，30s/次，拍干后于荧光显微镜下观察。

结果如图11～12所示，确认FITC直接标记抗体的最适工作条件为标记抗体1:1600稀释，37℃孵育60min。在该条件下：感染PCV2b 0233毒株和PCV1-2b C1-233株的PK15 B6细胞出现特异性荧光，阴性对照无荧光。

实施例9

FITC直接标记单克隆抗体用于PCV2b 0233株和PCV1-2b C1-233株病毒的半数感染量(TCID₅₀)的测定

比较猪PCV2b阳性血清与FITC直接标记的单克隆抗体测定PCV2b 0233株和PCV1-2b C1-233株的半数感染量，验证FITC标记的单克隆抗体2A5株代替猪抗PCV2阳性血清用于PCV2b 0233株和PCV1-2b C1-233株病毒定量的可行性。

结果如图13所示，直接标记的单克隆抗体测得PCV2b 0233株的TCID₅₀＝10^-6.25/0.1mL，PCV1-2b C1-233株的TCID₅₀＝10^-3.5/0.1mL；以猪抗PCV2阳性血清测得的PCV2b 0233株的TCID₅₀＝10^-6.375/0.1mL，PCV1-2b C1-233株的TCID₅₀＝10^-3.7/0.1mL。在曝光时间为500ms时两种方法的荧光强度相当，表明FITC标记的单克隆抗体2A5株可以代替猪抗PCV2阳性血清用于PCV2b 0233株和PCV1-2b C1-233株的病毒定量。

具体操作步骤如下：

(1)铺96孔板将75mL方瓶中生长至90％汇合度的PK15 B6细胞以胰酶消化，以5mLDMEM培养基重悬，取2mL细胞悬液加入含4％胎牛血清的DMEM培养基至10mL。轻轻吹打混匀后铺96孔板，每孔滴加两滴。将96孔板置37℃、5％CO₂培养箱中培养24h。

(2)96孔板接毒取出96孔板，弃去培养基，以0.01M PBS缓冲液洗3遍，加入10倍倍比稀释的病毒液，每个稀释度加8孔，并分别留4孔作为病毒阳性对照和DMEM培养基阴性对照。随后将接种有病毒液的96孔板置37℃、5％CO₂培养箱中孵育1.5h。

(3)换维持液孵育1.5h结束后，将96孔板从37℃、5％CO₂培养箱中取出，弃去病毒液，每孔加入100μL含2％胎牛血清的DMEM培养基。将96孔板置37℃、5％CO₂培养箱中培养72h，随后进行免疫荧光试验并计算病毒的毒价(TCID₅₀)。

(4)细胞固定具体步骤同实施例4(5)。

(5)抗体孵育按实施例8建立的方法进行直接免疫荧光试验，同时，以猪抗PCV2阳性血清为一抗，FITC标记的兔抗猪IgG为二抗进行间接免疫荧光试验，具体操作如下。每孔加入100μL 1:1000稀释的PCV2阳性血清，37℃孵育1h。弃去一抗，0.01M PBS洗涤3遍后每孔加入1:200稀释的FITC标记的兔抗猪IgG 30μL，37℃孵育45min。弃去二抗，0.01M PBS洗涤3遍后镜检观察。

(6)镜检观察与TCID₅₀计算按常规方法在荧光显微镜下观察，利用Reed-Muench氏法计算TCID₅₀。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一株针对猪圆环病毒2b型Cap蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株2A5，其特征在于，所述单克隆抗体杂交瘤细胞株2A5已进行保藏，保藏编号为CGMCC N_O.45231。

2.根据权利要求1所述单克隆抗体杂交瘤细胞株2A5，其特征在于，所述单克隆抗体杂交瘤细胞株2A5针对的抗原表位为猪圆环病毒2b型Cap蛋白225-229位氨基酸。

3.权利要求1或2所述单克隆抗体杂交瘤细胞株2A5的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将去除PCV2d 0728株核定位信号肽的orf2片段克隆至原核表达载体上，构建原核表达质粒；

4.根据权利要求3所述构建方法，其特征在于，将SEQ ID NO.1所示序列的124～702bp克隆至原核表达载体pET-28a上。

5.一种由权利要求1或2所述单克隆抗体杂交瘤细胞株2A5产生的Cap单克隆抗体。

6.权利要求1或2所述单克隆抗体杂交瘤细胞株2A5或权利要求5所述Cap单克隆抗体在制备定量PCV2b和PCV1-2b病毒的试剂中的应用。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述试剂包括免疫荧光法检测或Westernblotting检测所涉及的试剂。

8.根据权利要求6或7所述应用，其特征在于，所述试剂包括直接免疫荧光检测所涉及的试剂。

9.一种用于直接免疫荧光检测的FITC标记单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为权利要求1或2所述单克隆抗体杂交瘤细胞株2A5产生的Cap单克隆抗体或权利要求5所述Cap单克隆抗体。

10.一种测定猪圆环病毒2b型PCV2b株和PCV1-2b株病毒的半数感染量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求9所述FITC标记单克隆抗体。