CN115651892B - 一种促进干细胞分化为功能成熟的胰岛β细胞的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种促进干细胞分化为功能成熟的胰岛β细胞的方法及其应用，所述方法包括：使得内分泌祖细胞与M3蕈毒碱型乙酰胆碱受体激动剂接触，以便使得内分泌祖细胞分化为胰岛β细胞；其中，所述内分泌祖细胞由原肠管细胞分化获得，由原肠管细胞向内分泌祖细胞分化过程中，细胞不与M3蕈毒碱型乙酰胆碱受体激动剂接触。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及一种促进干细胞分化为功能成熟的胰岛β细胞的方法及其应用。
背景技术
干细胞来源的胰岛β细胞可为糖尿病提供有用的药物发现平台，将来也有望成为治疗糖尿病的细胞替代疗法。因此，从人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞定向分化为胰岛β细胞的研究引起了人们的广泛关注，并且已经有很多报道。现有的干细胞诱导分化为胰岛β细胞的方法繁多，不过分化效率普遍较低，最终得到的胰岛β细胞数量较少或功能不成熟，这成为干细胞来源的胰岛β细胞研究中的瓶颈。
如何提高干细胞分化为功能成熟的胰岛β细胞的分化效率是现下迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为了解决干细胞分化为功能成熟的胰岛β细胞分化效率低的问题，本发明在Melton DA等开发的干细胞分化为胰岛β细胞的分化方法(Pagliuca,F.W.et al.Generation of functional humanpancreaticβcells in vitro.Cell 159,428–439(2014))基础上，开发了一种促进人多能干细胞或人诱导多能干细胞分化为功能成熟的胰岛β细胞的方法，包括在内分泌祖细胞向胰岛β细胞分化这一特定阶段加入M3蕈毒碱型乙酰胆碱受体激动剂如乙酰胆碱，从而提高表达NKX6.1和C肽的胰岛β细胞的比例，也就是说，M3蕈毒碱型乙酰胆碱受体激动剂在内分泌祖细胞向胰岛β细胞分化这一特定阶段加入，可显著促进促进干细胞分化为功能成熟的胰岛β细胞。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种获得胰岛β细胞的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：使得内分泌祖细胞与M3蕈毒碱型乙酰胆碱受体激动剂接触，以便使得内分泌祖细胞分化为胰岛β细胞，其中，所述接触不发生在由原肠管细胞向内分泌祖细胞分化过程中。发明人发现，在内分泌祖细胞向胰岛β细胞分化这一特定阶段加入M3蕈毒碱型乙酰胆碱受体激动剂，与现有技术-在原肠管细胞向胰岛β细胞分化过程中均加入M3蕈毒碱型乙酰胆碱受体激动剂不同，可以显著提高NKX6.1和C肽双阳的胰岛β细胞的比例，而NKX6.1和C肽双阳为功能成熟的胰岛β细胞的特征标签，也就是说，在内分泌祖细胞向胰岛β细胞分化这一特定阶段加入M3蕈毒碱型乙酰胆碱受体激动剂，可以显著提高功能成熟的胰岛β细胞的获得比例，提高干细胞向功能成熟的胰岛β细胞的分化比例。其中，所述的内分泌祖细胞表达C-peptide、NKX6.1等标记物。
根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述内分泌祖细胞由原肠管细胞分化获得，由原肠管细胞向内分泌祖细胞分化过程中，细胞不与M3蕈毒碱型乙酰胆碱受体激动剂接触。
根据本发明的实施例，所述M3蕈毒碱型乙酰胆碱受体激动剂为乙酰胆碱。
根据本发明的实施例，使得内分泌祖细胞与M3蕈毒碱型乙酰胆碱受体激动剂接触是通过如下方式实现的：将内分泌祖细胞在S6完全培养基中进行分化培养，所述S6完全培养基为含有25～200μM乙酰胆碱的MCDB131培养基。发明人发现，培养基中乙酰胆碱的浓度在25～200μM，可提高成熟胰岛β细胞的获得比例。
根据本发明的实施例，所述S6完全培养基为含有25～100μM乙酰胆碱的MCDB131培养基。发明人发现，S6完全培养基中乙酰胆碱的浓度在25～100μM，可进一步显著提高成熟胰岛β细胞的获得比例。
根据本发明的实施例，所述S6完全培养基进一步包括：8mMD-(+)-葡萄糖、1.23g/LNaHCO3、2％(质量体积分数，2g/100mL)BSA、稀释比例为1：200的ITS-X、2mM Glutamax、0.25mM维生素C以及1％(体积分数)青霉素和链霉素(Pen/Strep)。
根据本发明的实施例，所述内分泌组细胞在S6完全培养基中培养7天。发明人发现，当所述内分泌祖细胞在S6完全培养基中培养7天后，成熟胰岛β细胞的数量会进一步增加。
根据本发明的实施例，所述内分泌祖细胞是通过如下方式获得：将所述原肠管细胞在S3完全培养基中培养2天，以便获得PDX1阳性胰腺祖细胞；将所述PDX1阳性胰腺祖细胞在S4完全培养基中培养5天，以便获得PDX1/NKX6.1双阳胰腺祖细胞；将所述PDX1/NKX6.1双阳胰腺祖细胞在S5完全培养基中培养7天，以便获得所述内分泌祖细胞。
根据本发明的具体实施例，所述S3完全培养基中为包括8mMD-(+)-葡萄糖、1.23g/LNaHCO3、2％BSA、稀释比例为1：200的ITS-X、2mM Glutamax、0.25mM维生素C以及1％Pen/Strep的MCDB131。原肠管细胞在S3完全培养基中培养2天过程中，第一天添加200nM的LDN193189、50ng/mL的KGF，0.25μM的SANT1、500nM的PdBU、10μM的Y27632以及2μM的RA；第二天全换液，即去除第一天的培养基，更换为相同体积的添加50ng/mL的KGF，0.25μM的SANT1、500nM的PdBU、10μM的Y27632以及2μM的RA的S3完全培养基。所述PDX1阳性胰腺祖细胞在S4完全培养基中培养5天中，第一天到第五天均采用添加有50ng/mL KGF、0.25μM SANT1、10μM的Y27632、5ng/mL的ActivinA和0.1μM的RA的S4完全培养基，第一天全换液，第二天无需换液，第三天全换液，第四天无需换液，第五天全换液。所述S5完全培养基为包括20mM D-(+)-葡萄糖、1.754g/L NaHCO3、2％BSA、稀释比例为1：200的ITS-X、2mM Glutamax、0.25mM维生素C、1％Pen/Strep以及10μg/mL肝素的MCDB131，所述PDX1/NKX6.1双阳胰腺祖细胞在S5完全培养基中培养第一天全换液，将S4完全培养基更换为S5培养基，S5培养基中添加0.25μMSANT1、0.1μM RA、1μM XXI、10μM Alk5i、1μM T3以及20ng/mL Betacellulin，第二天不换液，第三天继续采用含有和第一天相同的添加因子的培养基进行培养，第四天不换液，第五天换液更换为添加25nM RA、1μM XXI、10μM Alk5i、1μM T3以及20ng/mL Betacellulin的S5完全培养基，第6天不换液，第7天全换液，依然更换为添加25nM RA、1μM XXI、10μM Alk5i、1μM T3以及20ng/mL Betacellulin的S5完全培养基。
根据本发明的实施例，所述原肠管细胞是通过如下方式获得的：将所述起始干细胞接种于mTeSR1培养基中，所述mTeSR1培养基含有10μM Y27632，其中，所述起始干细胞在六孔板中的接种密度为0.5*10^6cells/孔；将接种后的起始干细胞在37℃、5％CO2的环境中培养2天，优选地，所述培养过程中采用半换液方式；将采用半换液方式培养后的起始干细胞进行第一和第二分化培养，以便获得所述原肠管细胞，其中，所述第一分化培养是在S1完全培养基中进行3天，所述第二分化培养是在S2完全培养基中进行3天。发明人发现，起始干细胞在六孔板中的接种密度在0.5*10^6cells/孔，可进一步提高分化效率；在培养过程中采用半换液方式而非全换液方式，也会进一步提高后续细胞分化效率。
需要说明的是，本发明所述的“内分泌祖细胞”，其可与“胰腺内分泌祖细胞”可互换使用，是指能够变成胰腺激素表达细胞的胰腺内胚层细胞。内分泌祖细胞可以通过它们的NKX6.1和C-peptide表达来表征。
需要说明的是，本发明所述的“原肠管细胞”，是指从内胚层细胞分化并可以分化成β细胞(例如胰腺β细胞)的细胞。原肠管细胞表达至少一种以下标记物：FoxA2或HNF4-α。原肠管细胞能够分化成包括肺、肝、胰腺、胃和肠细胞在内的细胞。
需要说明的是，本发明所述的“PDX1阳性胰腺祖细胞”，是指作为胰腺内胚层(PE)细胞，能够分化成例如胰腺β细胞等SC-β细胞的细胞。PDX1阳性胰腺祖细胞表达标记物PDX1。
需要说明的是，本发明所述的“PDX1/NKX6.1双阳胰腺祖细胞”是指作为胰腺内胚层(PE)细胞，能够分化成例如胰腺β细胞等产生胰岛素的细胞的细胞。PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞表达标记物PDX1和NKX6.1。
需要说明的是，本发明所述的标记物可以通过本领域技术人员已知的任何方法，例如免疫化学，使用抗体或定量RT-PCR评估。
需要说明的是，本申请所述的“半换液方式”是指，每次给细胞换液，只换原培养液的一半，例如，细胞培养液为5mL，将其中的2.5mL的旧培养液去除，加入2.5mL新鲜的培养液。
需要说明的是，本申请所述的“全换液方式”是指，每次给细胞换液，将原培养液全部去除，例如，细胞培养液为5mL，将其中的所有的旧培养液去除，再加入5mL新鲜的培养液。
根据本发明的实施例，所述起始干细胞为商业化干细胞系。根据本发明的具体实施例，所述商业化干细胞系为H9细胞系。
根据本发明的实施例，所述起始干细胞预先经过扩增处理。
根据本发明的具体实施例，所述扩增处理是通过如下方式进行的：将H9细胞团在mTeSR1培养基中进行悬浮培养；将悬浮培养后的H9细胞团进行消化处理，以便获得H9单细胞；将H9单细胞接种于以6*10^5cells/mL的密度接种于mTeSR1培养基中并进行培养，优选地，培养过程中采用半换液方式；任选地，将培养后的细胞进行核型鉴定、流式细胞术检测和支原体污染检测；其中，核型鉴定结果正常(即染色体数目为46，且无染色体交叉、互换、易位等)，流式细胞术检测结果为OCT4和SSEA4阳性细胞比例不低于95％(证明干细胞的干性维持良好)，无支原体污染是培养后细胞为用于分化的起始干细胞的指示。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种胰岛β细胞。根据本发明的实施例，所述胰岛β细胞是通过前面所述的方法获得的。根据本发明实施例的胰岛β细胞，功能成熟的胰岛β细胞比例高。根据本发明实施例的胰岛β细胞可提供有用的治疗糖尿病的药物发现平台，将来也有望开发为治疗糖尿病的细胞治疗制剂。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种胰岛β细胞群体。根据本发明的实施例，所述群体中，NKX6.1/C肽双阳比例为20％～50％，优选地，NKX6.1/C肽双阳比例为20％～40％。根据本发明实施例的胰岛β细胞群体，NKX6.1/C肽双阳比例高，功能成熟的胰岛β细胞比例高。其中，所述NKX6.1/C肽双阳的胰岛β细胞的获得方法可以有多种，例如，利用本申请前面所述的获得胰岛β细胞的方法，根据本发明实施例的胰岛β细胞群体可提供有用的治疗糖尿病的药物发现平台，将来也有望开发为治疗糖尿病的细胞治疗制剂。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括前面所述的胰岛β细胞或胰岛β细胞群体。如前所述，所述胰岛β细胞或胰岛β细胞群体可提供有用的治疗糖尿病的药物发现平台，将来也有望开发为治疗糖尿病的细胞治疗制剂。
所述药物组合物包括在时间和/或空间上分开的组合，只要其能够共同作用以实现本发明的目的。例如，所述药物组合物中所含的成分可以以整体施用于受试者，或者分开施用于受试者。当所述药物组合物中所含的成分分开地施用于受试者时，各个成分可以同时或依次施用于受试者。
本发明中涉及的“受试者”一般指哺乳动物，如灵长类动物和/或啮齿类动物，特别是人、猴或鼠。
在本发明的第五方面，本发明提出了前面所述的胰岛β细胞、胰岛β细胞群体或前面所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防糖尿病。
附图说明
图1是根据本发明实施例1的步骤1)的核型检测结果图；
图2是根据本发明实施例1的步骤1)的OCT4和SSEA4阳性细胞比例图；
图3是根据本发明实施例1的步骤1)的支原体检测结果图；
图4是根据本发明实施例1的无乙酰胆碱组三个重复流式检测NKX6.1/C-peptide双阳比例图；
图5是根据本发明实施例1的乙酰胆碱添加组三个重复流式检测NKX6.1/C-peptide双阳比例图；
图6是根据本发明实施例1的添加与不添加乙酰胆碱组NKX6.1/C-peptide双阳比例比较；
图7是根据本发明实施例2的无乙酰胆碱组流式检测NKX6.1/C-peptide双阳比例图；
图8是根据本发明实施例2的50μM乙酰胆碱添加组流式检测NKX6.1/C-peptide双阳比例图；
图9是根据本发明实施例2的100μM乙酰胆碱添加组流式检测NKX6.1/C-peptide双阳比例图；
图10是根据本发明实施例3的10μM乙酰胆碱添加组流式检测NKX6.1/C-peptide双阳比例图；
图11是根据本发明实施例4的25μM乙酰胆碱添加组流式检测NKX6.1/C-peptide双阳比例图；
图12是根据本发明实施例5的10μM乙酰胆碱添加组流式检测NKX6.1/C-peptide双阳比例图；以及
图13是根据本发明实施例6的250μM乙酰胆碱添加组流式检测NKX6.1/C-peptide双阳比例图。
附图中的expression为表达，unstained表示未染色系列，Isotype表示同型对照系列，Stained表示染色系列。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
为了解决干细胞分化为功能成熟的胰岛β细胞分化效率低的问题，本发明在Melton DA等开发的干细胞分化为胰岛β细胞的分化方法基础上，开发了一种促进人多能干细胞或人诱导多能干细胞分化为功能成熟的胰岛β细胞的方法，即在内分泌祖细胞向胰岛β细胞分化这一特定阶段加入M3蕈毒碱型乙酰胆碱受体激动剂如乙酰胆碱，从而提高表达NKX6.1和C肽的胰岛β细胞的比例。
本发明公布了M3蕈毒碱型乙酰胆碱受体激动剂作用于胰岛β细胞的G蛋白偶联受体信号通路从而提高干细胞分化为功能成熟的胰岛β细胞的方法。在内分泌祖细胞向胰岛β细胞分化这一特定阶段，M3蕈毒碱型乙酰胆碱受体激动剂作用于胰岛β细胞的G蛋白偶联受体，信号转导到PLCβ，进一步激活PKC、Erk1/2，使得IRS2活性增强，最终胰岛β细胞的关键功能基因表达增加。
通过特定阶段加入M3蕈毒碱型乙酰胆碱受体激动剂，可显著提高干细胞分化为功能成熟的胰岛β细胞的效率；且成本低，操作简单。
以下将结合具体实施例详细描述本发明的技术方案，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
以下实施例中所采用的胰岛β细胞的分化方法如下所述：
起始干细胞为H9细胞系，分化体系为轨道摇床低吸附六孔板。
1)细胞培养：使用mTeSR1培养基悬浮培养H9细胞团，悬浮培养在125-mL spinnerflasks，转速70rpm，培养体积75mL，培养条件：37℃，5％CO2。每4天传一代，使用Accutase将H9细胞团消化为单细胞，计数，以6*10^5cells/mL接种于mTeSR1培养基+10μMY27632，培养过程中每天去除一半旧培养基，然后加入37.5mL新鲜的mTeSR1培养基。细胞经过核型鉴定，流式细胞术检测和支原体污染检测，各项指标正常后(核型鉴定结果为46、XX(女性)，OCT4和SSEA4阳性细胞比例不低于95％，无支原体污染)，进行下面步骤；
2)分化前Stage0，使用Accutase将H9细胞团消化为单细胞，计数，以0.5*10^6cells/孔接种于低吸附板六孔板，培养基为mTeSR1培养基+10μM Y27632，转速100rpm，培养体积5.5mL，培养条件：37℃，5％CO2。Stage0共两天，每天换液，采用半换液方式，去除3mL旧培养基，加入3mL新鲜mTeSR1培养基；
3)为了将干细胞分化为胰岛素生成细胞，后续使用分化培养基，均采用全换液方式即去除5.5mL旧培养基，加入5.5mL相应的分化培养基，具体分化阶段(第一阶段～第五阶段)的培养基配制，因子添加，如下和表1所示：
第一阶段(S1)培养基：MCDB131+8mM D-(+)-葡萄糖+2.46g/L NaHCO3+2％BSA+ITS-X1:50000+2mM Glutamax+0.25mM维生素C+1％Pen/Strep；
第二阶段(S2)培养基：MCDB131+8mMD-(+)-葡萄糖+1.23g/L NaHCO3+2％BSA+ITS-X1：50000+2mM Glutamax+0.25mM维生素C+1％Pen/Strep；
第三阶段(S3)培养基：MCDB131+8mM D-(+)-葡萄糖+1.23g/LNaHCO3+2％BSA+ITS-X1：200+2mM Glutamax+0.25mM维生素C+1％Pen/Strep；
第四阶段(S4)培养基：MCDB131+8mM D-(+)-葡萄糖+1.23g/L NaHCO3+2％BSA+ITS-X1：200+2mM Glutamax+0.25mM维生素C+1％Pen/Strep；
第五阶段(S5)培养基：MCDB131+20mM D-(+)-葡萄糖+1.754g/L NaHCO3+2％BSA+ITS-X1：200+2mM Glutamax+0.25mM维生素C+1％Pen/Strep+肝素(10μg/mL)。
表1：
注：NoFeed即无需换液。PdBu：12,13-二丁酸佛波醇；RA:视黄酸；XXI：γ-分泌酶抑制剂XXI；AlK5i：AlK5抑制剂(RepSox)；T3：L-3,3′,5-三碘代甲状腺素钠盐。
4)分化至第五阶段结束，使用TrypLETMExpress消化液将细胞团消化为单细胞，重新接种至低吸附六孔板，5.5mL培养体积，细胞接种密度为1*10^6cells/mL，使用第六阶段(S6)培养基：MCDB131+8mMD-(+)-葡萄糖+1.23g/L NaHCO3+2％BSA+ITS-X1：200+2mMGlutamax+0.25mM维生素C+1％Pen/Strep，额外添加10～200μM乙酰胆碱为S6完全培养基，培养条件不变，每隔一天更换一次S6完全培养基，采用全换液方式，共培养7天(D1～D7)，将分化的细胞团消化为单细胞，使用流式细胞术检测NKX6.1和C-peptide双阳细胞群比例即最终分化的成熟的胰岛素生成细胞的比例。
5)收取步骤4)获得的消化的单细胞样品2*10^6cells，经70μm筛网过滤细胞。1mLPBS洗2遍，200g离心4min；固定：加1mL BD Cytofix fixation buffer，室温固定20min；透化：800g离心4min去固定液，然后用1mL Perm Wash Buffer(0.22μm滤器过滤的水稀释10倍)洗2遍，800g离心4min，加300μL Perm Wash Buffer透化30min，平均分为三组：Unstained cells、Isotype control、和Stain cells；染色(此步之后注意避光！)：Unstained cells组不做处理，Isotype control组加入0.625μL PE Mouse IgG1、κIsotypeControl和5μLAlexa Fluor 647 Mouse IgG1κIsotype Control，Stain cells组加入5μLAlexa Fluor 647 Mouse Anti-C-Peptide和5μL PE Mouse Anti-Nkx6.1混匀后室温避光孵育30min，期间每隔5min吹打混匀1次样品；Wash并重悬细胞：800g离心4min，去上清，1mLPerm Wash Buffer洗2遍细胞，800g离心4min。200μL BD Pharmingen stain buffer(FBS)重悬细胞，上机检测：2h内上流式细胞仪(BD FASVerse)检测样品NKX6.1和C-peptide的表达情况。
实施例1
将起始干细胞H9进行步骤1)～3)的处理，并在进行步骤1)时对获得细胞的核型、OCT4和SSEA4阳性细胞比例以及支原体进行检测，检测结果如图1～3所示，结果显示，核型鉴定正常，OCT4和SSEA4阳性细胞比例不低于95％，无支原体污染。然后在第六阶段(即步骤4))将细胞分两组：1)不添加乙酰胆碱组；2)添加25μM乙酰胆碱组；每组三个复孔，使用流式细胞术检测胰岛素生成细胞的比例(NKX6.1和C-peptide双阳比例)：不添加乙酰胆碱组三个复孔分别为16.12％、13.55％和18.80％；添加乙酰胆碱组三个复孔分别为22.30％、25.97％和26.60％。具体流式结果见图4～6，经T-test分析，添加乙酰胆碱组较不添加乙酰胆碱组NKX6.1/C-peptide双阳比例有显著性提高，说明在第六阶段添加25μM乙酰胆碱可以提高干细胞分化为成熟的胰岛素生成细胞的比例。
实施例2
将起始干细胞H9细胞进行步骤1)～3)的处理，在第六阶段(即步骤4))分三组：1)不添加乙酰胆碱组；2)添加50μM乙酰胆碱组；3)添加100μM乙酰胆碱组，使用流式细胞术检测胰岛素生成细胞的比例(NKX6.1和C-peptide双阳比例)：不添加乙酰胆碱组为21.79％；添加50μM乙酰胆碱组为30.02％；添加100μM乙酰胆碱组为39.86％。具体流式结果见图7～9，添加乙酰胆碱组较不添加乙酰胆碱组NKX6.1/C-peptide双阳比例明显提高，随着浓度增加，双阳比例随之增加，说明在第六阶段添加50μM或100μM乙酰胆碱可以提高干细胞分化为胰岛素生成细胞的比例。
实施例3
本实施例的实验分为两组：1)不添加乙酰胆碱组；2)添加10μM乙酰胆碱组；
不添加乙酰胆碱组与实施例1不添加乙酰胆碱组的实验操作相同；
添加乙酰胆碱组实验操作与实施例1添加乙酰胆碱组的不同之处为在第四阶段(PDX1阳性胰腺祖细胞分化为PDX1/NKX6.1双阳胰腺祖细胞)和第五阶段(PDX1/NKX6.1双阳胰腺祖细胞分化为内分泌祖细胞)细胞培养基中分别额外再加入10μM乙酰胆碱。
每组三个复孔，使用流式细胞术检测胰岛素生成细胞的比例(NKX6.1和C-peptide双阳比例)：不添加乙酰胆碱组三个复孔分别为16.12％、13.55％和18.80％(见图4)；添加10μM乙酰胆碱组三个复孔分别为12.99％、13.46％和18.86％(见图10)；经T-test分析，添加乙酰胆碱组较不添加乙酰胆碱组NKX6.1/C-peptide双阳比例无显著性提高，说明该在分化的第四和第五阶段添加乙酰胆碱对干细胞分化为成熟的胰岛素生成细胞无作用。
实施例4
本实施例的实验分为两组：1)不添加乙酰胆碱组；2)添加25μM乙酰胆碱组；
不添加乙酰胆碱组与实施例1不添加乙酰胆碱组的实验操作相同；
添加乙酰胆碱组实验操作与实施例1添加乙酰胆碱组的不同之处为在第四阶段(PDX1阳性胰腺祖细胞分化为PDX1/NKX6.1双阳胰腺祖细胞)和第五阶段(PDX1/NKX6.1双阳胰腺祖细胞分化为内分泌祖细胞)细胞培养基中分别额外再加入25μM乙酰胆碱。
每组三个复孔，使用流式细胞术检测胰岛素生成细胞的比例(NKX6.1和C-peptide双阳比例)：不添加乙酰胆碱组三个复孔分别为16.12％、13.55％和18.80％(见图4)；添加25μM乙酰胆碱组三个复孔分别为21.21％、19.41％和16.14％(见图11)；经T-test分析，添加乙酰胆碱组较不添加乙酰胆碱组NKX6.1/C-peptide双阳比例无显著性提高，说明在分化的第四和第五阶段添加乙酰胆碱对干细胞分化为成熟的胰岛素生成细胞无作用。
实施例5
将起始干细胞H9进行步骤1)～3)的处理，在第六阶段(即步骤4))分两组：1)不添加乙酰胆碱组；2)添加10μM乙酰胆碱组；每组三个复孔，使用流式细胞术检测胰岛素生成细胞的比例(NKX6.1和C-peptide双阳比例)：不添加乙酰胆碱组三个复孔分别为16.12％、13.55％和18.80％(见图4)；添加10μM乙酰胆碱组三个复孔分别为15.06％、17.52％和22.95％(见图12)；经T-test分析，添加乙酰胆碱组较不添加乙酰胆碱组NKX6.1/C-peptide双阳比例无显著性提高，说明在第六阶段添加10μM乙酰胆碱对干细胞分化为成熟的胰岛素生成细胞无作用。
实施例6
将起始干细胞H9进行步骤1)～3)的处理，在第六阶段(即步骤4))分两组：1)不添加乙酰胆碱组；2)添加250μM乙酰胆碱组；使用流式细胞术检测胰岛素生成细胞的比例(NKX6.1和C-peptide双阳比例)：不添加乙酰胆碱组为21.79％(见图7)；添加250μM乙酰胆碱组平均为21.46％(见图13)，经分析，添加乙酰胆碱组较不添加乙酰胆碱组NKX6.1/C-peptide双阳比例无提高，说明在第6阶段添加250μM乙酰胆碱对干细胞分化为成熟的胰岛素生成细胞无作用。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (7)
1.一种获得胰岛β细胞的方法，其特征在于，包括：使得内分泌祖细胞与M3蕈毒碱型乙酰胆碱受体激动剂接触，以便使得内分泌祖细胞分化为胰岛β细胞，其中，所述接触不发生在由原肠管细胞向内分泌祖细胞分化过程中；所述原肠管细胞是由起始干细胞分化获得的，所述起始干细胞为商业化干细胞系；
其中，使得内分泌祖细胞与M3蕈毒碱型乙酰胆碱受体激动剂接触是通过如下方式实现的：
将内分泌祖细胞在S6完全培养基中进行分化培养，所述S6完全培养基为含有25～100μM乙酰胆碱的MCDB131培养基，所述S6完全培养基进一步包括：8mM D-(+)-葡萄糖、1.23g/LNaHCO3、2％BSA、稀释比例为1:200的ITS-X、2mM Glutamax、0.25mM维生素C以及1％青霉素和链霉素；
所述内分泌祖细胞是通过如下方式获得：
将所述原肠管细胞在S3完全培养基中培养2天，以便获得PDX1阳性胰腺祖细胞；
将所述PDX1阳性胰腺祖细胞在S4完全培养基中培养5天，以便获得PDX1/NKX6.1双阳胰腺祖细胞；
将所述PDX1/NKX6.1双阳胰腺祖细胞在S5完全培养基中培养7天，以便获得所述内分泌祖细胞；
所述S3完全培养基中为包括8mM D-(+)-葡萄糖、1.23g/L NaHCO3、2％BSA、稀释比例为1:200的ITS-X、2mM Glutamax、0.25mM维生素C以及1％青霉素和链霉素的MCDB131；原肠管细胞在S3完全培养基中培养2天过程中，第一天添加200nM的LDN193189、50ng/mL的KGF，0.25μM的SANT1、500nM的12,13-二丁酸佛波醇、10μM的Y27632以及2μM的视黄酸；第二天全换液，去除第一天的培养基，更换为相同体积的添加50ng/mL的KGF，0.25μM的SANT1、500nM的12,13-二丁酸佛波醇、10μM的Y27632以及2μM的视黄酸的S3完全培养基；
所述PDX1阳性胰腺祖细胞在S4完全培养基中培养5天中，第一天到第五天均采用添加有50ng/mL KGF、0.25μM SANT1、10μM的Y27632、5ng/mL的Activin A和0.1μM的视黄酸的S4完全培养基，第一天全换液，第二天无需换液，第三天全换液，第四天无需换液，第五天全换液，所述S4完全培养基为包括8mM D-(+)-葡萄糖、1.23g/L NaHCO3、2％BSA、稀释比例为1：200的ITS-X、2mM Glutamax、0.25mM维生素C以及1％青霉素和链霉素的MCDB131；
所述S5完全培养基为包括20mM D-(+)-葡萄糖、1.754g/L NaHCO3、2％BSA、稀释比例为1：200的ITS-X、2mM Glutamax、0.25mM维生素C、1％青霉素和链霉素以及10μg/mL肝素的MCDB131，所述PDX1/NKX6.1双阳胰腺祖细胞在S5完全培养基中培养第一天全换液，将S4完全培养基更换为S5完全培养基，S5完全培养基中添加0.25μM SANT1、0.1μM视黄酸、1μMγ-分泌酶抑制剂XXI、10μM AlK5抑制剂、1μM L-3,3′,5-三碘代甲状腺素钠盐以及20ng/mLBetacellulin，第二天不换液，第三天继续采用含有和第一天相同的添加因子的培养基进行培养，第四天不换液，第五天换液更换为添加25nM视黄酸、1μMγ-分泌酶抑制剂XXI、10μMAlK5抑制剂、1μM L-3,3′,5-三碘代甲状腺素钠盐以及20ng/mL Betacellulin的S5完全培养基，第6天不换液，第7天全换液，依然更换为添加25nM视黄酸、1μMγ-分泌酶抑制剂XXI、10μM AlK5抑制剂、1μM L-3,3′,5-三碘代甲状腺素钠盐以及20ng/mL Betacellulin的S5完全培养基。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述原肠管细胞是通过如下方式获得的：
将所述起始干细胞接种于mTeSR1培养基中，所述mTeSR1培养基含有10μM Y27632，其中，所述起始干细胞在六孔板中的接种密度为0.5*10^6个细胞/孔；
将接种后的起始干细胞在37℃、5％CO2的环境中培养2天，所述培养过程中采用半换液方式；
将采用半换液方式培养后的起始干细胞进行第一和第二分化培养，以便获得所述原肠管细胞，其中，所述第一分化培养是在S1完全培养基中进行3天，所述第二分化培养是在S2完全培养基中进行3天；
其中，所述S1完全培养基为包括8mM D-(+)-葡萄糖、2.46g/L NaHCO3、2％BSA、稀释比例为1:50000的ITS-X、2mM Glutamax、0.25mM维生素C以及1％青霉素和链霉素的MCDB131培养基；
所述S2完全培养基为包括8mM D-(+)-葡萄糖、1.23g/L NaHCO3、2％BSA、稀释比例为1:50000的ITS-X、2mM Glutamax、0.25mM维生素C以及1％青霉素和链霉素的MCDB131培养基。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述商业化干细胞系为H9细胞系。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述起始干细胞预先经过扩增处理。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述扩增处理是通过如下方式进行的：
将H9细胞团在mTeSR1培养基中进行悬浮培养；
将悬浮培养后的H9细胞团进行消化处理，以便获得H9单细胞；
将H9单细胞以6*10^5cells/mL的密度接种于mTeSR1培养基中并进行培养。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，培养过程中采用半换液方式。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将培养后的细胞进行核型鉴定、流式细胞术检测和支原体污染检测；
其中，核型鉴定结果正常，流式细胞术检测结果为OCT4和SSEA4阳性细胞比例不低于95％，无支原体污染是培养后细胞为用于分化的起始干细胞的指示。
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| Generation of functional human pancreatic β cells in vitro;Felicia W. Pagliuca等;《Cell》;第159卷(第2期);第428-439页，参见摘要、第429页左栏第3段-第430页右栏第1段、第431页左栏第2段、第433页左栏第1段、第437页左栏第2-4段、图1、"Extended Experimental Procedures"部分 * |
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