CN115646549B - 一种多孔纳米材料水解型纳米酶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多孔纳米材料水解型纳米酶及其制备方法，以ZIF‑8为载体，掺杂钌，形成Ru‑ZIF‑8多孔纳米材料，其制备方法包括以下步骤：(1)将无机锌盐、2‑甲基咪唑和钌盐加入溶剂中混合，搅拌，取固体，洗涤，干燥；(2)将步骤(1)干燥后的固体，在含有氢气的惰性气体氛围中，升温进行热处理，进行碳化和钌还原反应；该多孔纳米材料Ru‑ZIF‑8水解型酯酶具有较高的酶催化活性和较好的抗乙酸根毒化效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种酶及其制备方法，特别涉及一种多孔纳米材料水解型纳米酶及其制备方法。
背景技术
纳米酶是一种具有类酶活性的纳米材料，在分子检测、癌症治疗、抗氧化等领域有广泛的应用。纳米酶具有高稳定性、可调活性和低成本等优点，因此对于天然酶具有巨大的替代潜力。到目前为止，大多数研究只关注氧化还原酶(过氧化物酶、过氧化氢酶、氧化酶和超氧化物歧化酶)，由于非氧化还原酶的催化反应高度依赖于天然酶的空间结构，所以只有少数研究延伸到水解酶，如磷酸酶、酯酶和脲酶。开发水解型纳米酶具有重要意义。乙酰胆碱是人体中比较重要的酯类，也是一种重要的神经递质，参与摄食、饮水、体温和血压调节、镇痛等活动；在维持行为和脑电激活、促进学习和记忆等方面也起着重要作用，乙酰胆碱含量水平与多种疾病比如帕金森、阿兹海默症、胃肠功能紊乱、肌肉抽搐等有关，而天然的乙酰胆碱酯酶活性在这些疾病中受到抑制，并且其活性受温度、酸碱度等因素影响大。
目前已经证明沸石咪唑酯骨架结构材料ZIF-8具有酯酶活性，可以作为一种结构清晰的仿生酶。ZIF-8具有优异的稳定性和丰富的碳氮含量是固定金属原子和制造原子纳米结构的理想宿主。但是单一的ZIF-8水解速率较慢，并且ZIF-8的酯酶活性抗乙酸根毒化效果较差。
发明内容
发明目的：本发明的第一目的为提供一种提高水解速率和抗乙酸根毒化效果的多孔纳米材料水解型纳米酶；本发明的第二目的为提供所述多孔纳米材料水解型纳米酶的制备方法。
技术方案：本发明所述的多孔纳米材料水解型纳米酶，以ZIF-8为载体，掺杂钌，形成Ru-ZIF-8多孔纳米材料水解型纳米酶。
所述ZIF-8以无机锌盐为锌源，2-甲基咪唑为配体；优选的，无机锌盐为Zn(NO3)2、(CH3COO)2Zn或ZnCl2。
优选的，所述ZIF-8中锌与掺杂钌的摩尔比为12∶1～5。
所述Ru-ZIF-8多孔纳米材料粒径为300～800nm。
优选的，所述掺杂钌采用乙酰丙酮钌或三氯化钌。
本发明所述的多孔纳米材料水解型纳米酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将无机锌盐、2-甲基咪唑和钌盐加入溶剂中混合，搅拌，取固体，洗涤，干燥；
(2)将步骤(1)干燥后的固体，在含有氢气的惰性气体氛围中，升温进行热处理，进行碳化和钌还原反应，得到最终产物Ru-ZIF-8多孔纳米材料水解型纳米酶。
优选的，步骤(2)中，热处理温度为300～500℃，时间为1～5小时。
优选的，所述含有氢气的惰性气体为含5～15vol％氢气的氩氢气。
热处理过程发生碳化以及钌元素的还原反应，可以在ZIF-8中固定钌元素。热处理的温度和时间会影响碳化的效果，温度低一些配体咪唑基团碳化的少一些，保留的会多一些，钌元素固定的相对不是很牢固。温度高一些配体咪唑基团碳化的多一些，保留的少一些，钌元素固定的相对牢固一点。
优选的，步骤(1)中所述溶剂为甲醇。
发明机理：本发明的多孔纳米材料Ru-ZIF-8，在ZIF-8中引入了Ru元素，钌元素和ZIF-8协同调控酯酶水解的反应，钌元素调控水解离步骤使水解离出更多的氢氧根进而亲核攻击含氧阴离子进行断键水解，ZIF-8调控水解底物解离，从而提高水解酯类物质的速率。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：(1)该多孔纳米材料Ru-ZIF-8水解型酯酶具有较高的酶催化活性和较好的抗乙酸根毒化效果；(2)该制备方法简单，原料易得。
附图说明
图1为实施例1制备的Ru掺杂的多孔纳米材料Ru-ZIF-8的SEM图谱；
图2为实施例1制备的Ru掺杂的多孔纳米材料Ru-ZIF-8的mapping图谱；
图3为实施例1制备的Ru掺杂的多孔纳米材料Ru-ZIF-8与ZIF对比的XRD图谱；
图4为实施例1制备的Ru掺杂的多孔纳米材料Ru-ZIF-8与ZIF-8对比的紫外吸收光谱；
图5为实施例1制备的Ru掺杂的多孔纳米材料Ru-ZIF-8在不同pH下相对活性图；
图6为实施例1制备的Ru掺杂的多孔纳米材料Ru-ZIF-8与ZIF-8在不同pH下相对活性对比图；
图7为实施例1制备的Ru掺杂的多孔纳米材料Ru-ZIF-8与ZIF-8随KOAc浓度升高的相对活性图。
图8为实施例1制备的Ru掺杂的多孔纳米材料Ru-ZIF-8与ZIF-8水解乙酰胆碱能力的对比图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
本发明的多孔纳米材料水解型纳米酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)前躯体的制备：前躯体的制备：将1.2mmol的Zn(NO3)2·6H2O与0.1mmol Ru(acac)3在13mL甲醇溶液混合均匀，再加入4mL浓度为1.6mol/L的2-甲基咪唑，搅拌过夜，离心洗涤，40℃下真空干燥得到前驱体备用；
(2)Ru-ZIF-8的制备:将步骤(1)烘干后的前躯体在含有10vol％氢气的氩氢气氛围下，程序升温至400℃进行热处理，并在该温度下保持2h，最终得到最终产物Ru-ZIF-8多孔纳米材料水解型纳米酶。
实施例2
本发明的多孔纳米材料水解型纳米酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)前躯体的制备：前躯体的制备：将1.2mmol的ZnCl2与0.3mmol Ru(acac)3在13mL甲醇溶液混合均匀，再加入4mL浓度为1.6mol/L的2-甲基咪唑，搅拌过夜，离心洗涤，40℃下真空干燥得到前驱体备用；
(2)Ru-ZIF-8的制备:将步骤1)烘干后的前躯体在含有10vol％氢气的氩氢气氛围下，程序升温至500℃进行热处理，并在该温度下保持1h，最终得到最终产物Ru-ZIF-8多孔纳米材料水解型纳米酶。
实施例3
本发明的多孔纳米材料水解型纳米酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)前躯体的制备：前躯体的制备：将1.2mmol的(CH3COO)2Zn与0.5mmol Ru(acac)3在13mL甲醇溶液混合均匀，再加入4mL浓度为1.6mol/L的2-甲基咪唑，搅拌过夜，离心洗涤，40℃下真空干燥得到前驱体备用；
(2)Ru-ZIF-8的制备:将步骤(1)烘干后的前躯体在含有10vol％氢气的氩氢气氛围下，程序升温至300℃进行热处理，并在该温度下保持5h，最终得到最终产物Ru-ZIF-8多孔纳米材料水解型纳米酶。
实施例4
本发明的多孔纳米材料水解型纳米酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)前躯体的制备：前躯体的制备：将1.2mmol的Zn(NO3)2·6H2O与0.1mmol Ru(acac)3在13mL甲醇溶液混合均匀，再加入4mL浓度为1.6mol/L的2-甲基咪唑，搅拌过夜，离心洗涤，40℃下真空干燥得到前驱体备用；
(2)Ru-ZIF-8的制备:将步骤(1)烘干后的前躯体在含有5.99vol％氢气的氩氢气氛围下，程序升温至300℃进行热处理，并在该温度下保持4h，最终得到最终产物Ru-ZIF-8多孔纳米材料水解型纳米酶。
实施例5
本发明的多孔纳米材料水解型纳米酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)前躯体的制备：将1.2mmol的ZnCl2与0.1mmol Ru(acac)3在13mL甲醇溶液混合均匀，再加入4mL浓度为1.6mol/L的2-甲基咪唑，搅拌过夜，离心洗涤，40℃下真空干燥得到前驱体备用；
(2)Ru-ZIF-8的制备:将步骤(1)烘干后的前躯体在含有10vol％氢气的氩氢气氛围下，程序升温至500℃进行热处理，并在该温度下保持2h，最终得到最终产物Ru-ZIF-8多孔纳米材料水解型纳米酶。
对比例1
在实施例1的基础上，不加Ru(acac)3，其余条件不变，制备得到ZIF-8。
结构表征
对实施例1制备的催化剂采用SEM、XRD进行物理表征。
由SEM图1可以看出所制备催化剂具有典型的菱形十二面体形貌，尺寸均一；由mapping图2可以看到Ru，N，Zn分散在主题材料中，证明了Ru的成功掺杂。
由XRD图谱图3可得，掺杂钌之后图中峰没有明显改变，说明掺杂钌之后ZIF-8的结构不变。
性能表征
(1)酯酶模拟酶的活性测试
溶液配置：分别称取实施例1制备的Ru-ZIF-8材料和对比例1制备的ZIF-8材料10mg，分别加入到10mL去离子水中，超声溶解。
测试酯酶模拟酶活性的可行性：取10μL上述Ru-ZIF-8溶液和ZIF-8溶液，分别加入180μL 20mM pH＝8.0的磷酸缓冲溶液(以下简称:PB)和10μL浓度为5mM乙酸对硝基苯酯(以下简称:PNPA)，形成体系a和体系b，空白对照组以PB代替Ru-ZIF-8溶液形成体系c，用以对照。待上述三个体系反应3min，测紫外可见吸收谱。
PNPA水解产生黄色的对硝基苯酚，并且在400nm处有特征吸收峰，由峰的强弱和颜色的深浅可以对比观察PNPA水解的速率快慢。如图4所示，PNPA在没有催化剂的情况下水解缓慢，在添加Ru-ZIF-8或可ZIF-8之后催化速率加快，其中加入Ru-ZIF-8的体系水解速率提高的最多，上述结果表明Ru-ZIF-8具有酯酶模拟酶的活性。
(2)对pH对Ru-ZIF-8多孔纳米材料水解型纳米酶活性的影响
溶液配置：称量实施例1制备的Ru-ZIF-8材料10mg，加入到10mL去离子水中，超声溶解。
测试酯酶模拟酶活性影响条件pH：取10μL上述Ru-ZIF-8溶液，分别加入180μL20mMpH为7，7.5，8，8.5，9，9.5，10，10.5的磷酸缓冲溶液中，再分别加入10μL 5mM乙酸对硝基苯酯，反应3min后，测紫外可见吸收谱图。
通过测不同pH下反应后溶液的紫外可见吸收谱图，比较在400nm处吸收值大小，计算出比活度进行比较，结果如图5所示，Ru-ZIF-8作为酯酶模拟酶在pH＝8～9条件下，反应后溶液的吸收值变化不大，即作为酯酶模拟酶的活性受pH变化的影响较小，克服了天然酶的不稳定性。
(3)Ru-ZIF-8和ZIF-8在不同pH下催化活性比较
溶液配置：分别称取实施例1制备的Ru-ZIF-8材料和对比例1制备的ZIF-8材料10mg，分别加入到10mL去离子水中，超声溶解。
不同pH下催化活性测试：分别取10μL上述Ru-ZIF-8溶液和ZIF-8溶液，分别加入180μL 20mM pH为7，7.5，8，8.5，9，9.5，10，10.5的磷酸缓冲溶液，再分别加入10μL 5mM乙酸对硝基苯酯，反应3min后，测紫外可见吸收谱图。
由图6所示，由比活度对比图可以看出，在多个不同pH下Ru-ZIF-8的水解速率高于ZIF-8，即Ru-ZIF-8作为酯酶，利用Ru的高效水解离能力提供更多OH-有利于酯水解。
(4)Ru-ZIF-8和ZIF-8受到乙酸根抑制的程度比较
溶液配置：分别称取实施例1制备的Ru-ZIF-8材料和对比例1制备的ZIF-8材料10mg，分别加入到10mL去离子水中，超声溶解。
酯酶活性受到乙酸根抑制程度测试：分别取50μL摩尔浓度为0mM，60mM，120mM，240mM，500mM的KOAc溶液，向其中分别加入10μL的Ru-ZIF-8溶液、ZIF-8溶液，再分别加入180μL 20mM pH＝8的磷酸缓冲溶液，反应3min，测紫外可见吸收光谱。
通过分析上述两组溶液在400nm处的紫外吸收强度，绘制了随KOAc浓度升高的相对活性图，结果如图7所示，由图可得加入Ru-ZIF-8的溶液受抑制的程度低。
(5)Ru-ZIF-8和ZIF-8水解乙酰胆碱的能力比较
溶液配置：溶液配置：分别称取实施例1制备的Ru-ZIF-8材料和对比例1制备的ZIF-8材料10mg，分别加入到10mL去离子水中，超声溶解。
Ellman方法测定乙酰胆碱酯酶活性：使用乙酰胆碱类似物乙酰硫胆碱(ATCh)作为底物，ATCh水解产物硫胆碱与5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)反应生成黄色的5-硫代-2-硝基苯甲酸盐，通过监测405nm处5-硫代-2-硝基苯甲酸盐的吸光度值来测定酶活性。取40μL Ru-ZIF-8溶液、ZIF-8溶液，分别加入100μL磷酸缓冲溶液中，再分别加入40μL 1mM的DTNB和40μL 5mM的ATCh，60℃下反应1h。将上述反应后的溶液进行紫外光谱测试，得到结果如图8所示。
由图8可以看出Ru-ZIF-8具有水解乙酰胆碱的能力，且Ru-ZIF-8水解乙酰胆碱的能力优于ZIF-8。
Claims (6)
1.一种多孔纳米材料用作水解型酯酶的应用，所述多孔纳米材料以ZIF-8为载体，掺杂钌，形成Ru-ZIF-8多孔纳米材料水解型纳米酶；所述ZIF-8中锌与掺杂钌的摩尔比为12∶1~5；
所述多孔纳米材料的制备方法包括以下步骤：
（1）将无机锌盐、2-甲基咪唑和钌盐加入溶剂中混合，搅拌，取固体，洗涤，干燥；
（2）将步骤（1）干燥后的固体，在含有氢气的惰性气体氛围中，升温进行热处理，进行碳化和钌还原反应，得到最终产物Ru-ZIF-8多孔纳米材料水解型纳米酶；
步骤（2）中，所述热处理温度为300～500oC，时间为1~5小时。
2.根据权利要求1所述的多孔纳米材料用作水解型酯酶的应用，其特征在于，所述无机锌盐为Zn(NO3)2或ZnCl2。
3.根据权利要求1所述的多孔纳米材料用作水解型酯酶的应用，其特征在于，所述Ru-ZIF-8多孔纳米材料粒径为300~800 nm。
4.根据权利要求1所述的多孔纳米材料用作水解型酯酶的应用，其特征在于，所述钌盐为乙酰丙酮钌或三氯化钌。
5.根据权利要求1所述的多孔纳米材料用作水解型酯酶的应用，所述含有氢气的惰性气体为含5~15vol％氢气的氩氢气。
6.根据权利要求1所述的多孔纳米材料用作水解型酯酶的应用，步骤（1）中，所述溶剂为甲醇。
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