CN115645383A - 厚朴酚在制备抗ev71病毒药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种厚朴酚和/或其药用盐在制备抗EV71病毒药物中的应用。本发明还提供一种药物制剂，所述药物制剂包括厚朴酚和/或其药用盐。本发明还提供上述药物制剂在制备抗EV71病毒药物中的应用。本发明首次提出厚朴酚可应用于制备抗EV71病毒药物中。本发明通过试验结果表明，厚朴酚对于EV71具有较强的抗病毒活性，可以显著的抑制EV71病毒在宿主细胞RD上产生的细胞病变效应(CPE)，能抑制EV71病毒的复制；减少EV71感染小鼠的死亡率，在细胞和动物水平均表现出较强的抗病毒效果。

Description

厚朴酚在制备抗EV71病毒药物中的应用

技术领域

本发明专利涉及抗病毒药物技术领域，尤其是指厚朴酚在制备抗EV71病毒药物中的应用。

背景技术

肠道病毒71型(EV71)属于小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus)成员，是引起婴幼儿手足口病的最主要病原体之一，有时伴有严重的中枢神经系统并发症，包括无菌性脑膜炎、脑干脑炎、自主性神经紊乱、肺水肿等，甚至导致死亡。自1969年首次报道以来，EV71感染性疾病已在世界范围内多次爆发与流行，在亚太地区尤其是我国形势严峻。目前，对于病毒性疾病的预防和治疗主要依靠疫苗和药物，相关的疫苗于2015年才上市，目前还没有具体数据能够支持上市疫苗可以保护其他血清型的肠道病毒。针对EV71病毒感染的治疗方法也相当有限，主要治疗手段为对症支持治疗和广谱抗病毒疗法，其疗效有限，个体差异较大，且难以推广。

因此，相关抗病毒药物的研发将是攻克该病毒的关键着力方向，开发特异有效的抗EV71药物势在必行。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一，由此，在本发明的第一方面，本发明提供一种厚朴酚和/或其药用盐在制备抗EV71病毒药物中的应用。厚朴酚(Magnolol)化学结构式如下：

厚朴酚(Magnolol)是从厚朴的树皮或根皮中分离到的木脂素，中药厚朴皮中抗菌作用的有效成分。厚朴酚具有明显的、持久的中枢性肌肉松弛，中枢神经抑制作用，抗炎，抗菌，抗病原微生物，抗溃疡，抗氧化，抗肿瘤，抑制吗啡戒断反应，可抑制血小板聚集等药理作用，用于治疗急性肠炎，细菌性或阿米巴痢疾，慢性胃炎等。其中，在抗菌作用方面，厚朴酚对格兰氏阳性菌、耐酸性菌、丝状真菌有显著的抗菌活性，对变形链球菌有更加显著的抗菌作用，对葡萄球菌的抑制作用最强。临床上主要用作消除胸腹满闷、镇静中枢神经、运动员肌肉松弛、抗真菌、抗溃疡等药。

然而，目前厚朴酚的抗病毒活性报道较少，仅有报道指出厚朴酚具抗HIV-1活性、抗草鱼出血病毒活性，而对EV71病毒的抑制活性到目前未见报道。

在本发明的第二方面，本发明提供一种药物制剂，所述药物制剂包括厚朴酚和/或其药用盐。

在本发明的一个或多个实施例中，所述药物制剂还包括药剂学可接受的辅料和载体。

在本发明的一个或多个实施例中，所述药物制剂的浓度为3～30μg/mL。厚朴酚在浓度为10μg/mL时，对EV71病毒的抑制效果优于阳性药物ribavirin(RIB)。

在本发明的一个或多个实施例中，所述药物制剂的浓度为10μg/mL。厚朴酚在浓度为10μg/mL时，对EV71病毒的抑制率为98％。

在实施例中，所述药物制剂为颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂或注射剂。

在本发明的第三方面，本发明提供一种在本发明第二方面提供的药物制剂在制备抗EV71病毒药物中的应用。

本发明对厚朴酚对EV71病毒的抑制活性进行评估，通过标准的病毒活性测试方法对其进行活性测试。经过大量生物学实验，发现厚朴酚具有较好抑制EV71复制的活性，具体表现为可以抑制EV71病毒在细胞内的复制增殖。

本发明的有益效果在于：

现有技术中，厚朴酚在临床上一直作为用于抗菌或抗真菌药物，本发明首次发现厚朴酚可应用于治疗EV71引起的感染性疾病，首次发现它用于治疗EV71感染性疾病的新用途。试验结果表明，厚朴酚对于EV71具有较强的抗病毒活性，可以显著的抑制EV71病毒在宿主细胞RD上产生的细胞病变效应(CPE)，增强细胞存活率；能抑制EV71病毒的复制；减少EV71感染小鼠的死亡率，在细胞和动物水平均表现出较强的抗病毒效果，具有明显的技术效果。本发明实验结果表明化合物厚朴酚可以应用于制备抗EV71感染的特异治疗药物，具有较好的临床应用前景。厚朴酚的抗病毒活性未见报道，对其抗EV71病毒活性的开发具有一定的导向作用。

附图说明

图1为本发明实施例1中厚朴酚(Magnolol)对于EV71病毒作用的RD细胞毒性检测结果分析图；

图2为本发明实施例2中厚朴酚(Magnolol)对于EV71病毒在宿主RD细胞产生的细胞病变效应(CPE)影响结果图；

图3为本发明实施例2中不同浓度厚朴酚(Magnolol)的抗病毒活性检测结果分析图；

图4为本发明实施例3中不同浓度(5μM、10μM、20μM、40μM)厚朴酚(Magnolol)对EV71病毒增殖的影响检测结果分析图；

图5为本发明实施例4中不同浓度(0μM、1μM、3μM、10μM、30μM)厚朴酚(Magnolol)对于EV71复制的影响检测结果分析图；

图6为本发明实施例5中厚朴酚(Magnolol)对于EV71感染小鼠的影响结果分析图。

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，但下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。

以下实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，使用的方法如无特别说明，均为本领域公知的常规方法，使用的耗材和试剂如无特别说明，均为市场购得。除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。

本发明在以下实施例中，结合病毒RNA水平分析，滴度测定和Alamar-blue测定细胞存活率检测方法，对厚朴酚(Magnolol)进行抗EV71活性研究实验，实施例中的数据分析采用Graphpad软件进行统计分析。可以理解的是，以厚朴酚(Magnolol)为先导化合物进行进一步结构优化，用于制备治疗肠道病毒感染性疾病药物也属于本发明想要保护的范围。

实施例1厚朴酚(Magnolol)的细胞毒性检测

在RD细胞中，对厚朴酚(Magnolol)的细胞毒性进行检测。将RD细胞接种于96孔板中，在37℃，5％ CO₂培养箱中培养12-16h后，弃去细胞培养液，分别加含不同浓度梯度测试厚朴酚(Magnolol)的细胞维持液继续培养，每组3个复孔，对照组加等量的PBS。作用48h后用Alamar-blue染色，检测OD 590nm，分析细胞存活率。

结果分析：检测结果如图1所示，Prism7软件计算药物对于细胞的半数中毒浓度(Median cyctoxic concentration，CC50)，厚朴酚(Magnolol)的CC50为70.25uM。后续实施案例中，厚朴酚(Magnolol)使用的最大浓度为40uM，处于安全无毒性范围内。

实施例2厚朴酚(Magnolol)对EV71的抗病毒活性检测

将RD细胞铺板96孔板细胞培养板，在37℃，5％ CO₂培养箱培养12-16h后，1000TCID50的EV71病毒液感染细胞1h，分别加含不同浓度梯度(40μM、20μM、10μM、5μM、2.5μM、0μM(阴性对照))测试厚朴酚(Magnolol)的细胞维持液继续培养约24h，空白对照加入同体积PBS。病毒对照孔出现90％左右的CPE病变时，显微镜下观察细胞病变效应(CPE)。

利用Alamar-blue法检测厚朴酚对EV71的抑制率。具体步骤为：去除培养基，每孔加入Alamar-blue 10μL(30ug·mL-1)和90ul 2％FBS DMEM，孵育2-3h后用酶标仪在590nm处读取所对应的吸光度(OD590值)。

结果分析：厚朴酚(Magnolol)抑制EV71引起的RD细胞CPE效应如图2所示，EV71感染的RD细胞变圆，从细胞板壁脱离，不同浓度的厚朴酚处理对于其病变效应均有显著的抑制作用。其中，浓度40uM时的厚朴酚处理对于EV71的抑制作用最强。

进一步地，Alamar-blue检测结果如图3所示，用Prism7软件计算药物的半数有效浓度(Concentration for 50％of maximal inhibit，IC50)，厚朴酚(Magnolol)的IC50为6.88uM。

实施例3厚朴酚(Magnolol)抑制EV71增殖活性的检测

RD细胞接种于24孔板细胞培养板中，于37℃，5％ CO₂培养箱中培养12-16h，用10000TCID50的EV71病毒液感染2h后，使用含有不同浓度梯度(5μM、10μM、20μM、40μM)的实验厚朴酚(Magnolol)的细胞维持液进行处理，空白对照(Vehicle)加入同体积PBS。处理24h后，通过病毒TCID50法检测病毒滴度判断抑制病毒增殖的效果。

结果分析：检测结果如图4所示，由图可知，在不同浓度(5μM、10μM、20μM、40μM)厚朴酚处理条件下，厚朴酚(Magnolol)对EV71均有显著抑制作用。

实施例4厚朴酚(Magnolol)对EV71复制的影响

本实验检测到厚朴酚(Magnolol)对于EV71复制有较好的抑制活性：

将RD细胞接种于24孔板细胞培养板中，于37℃，5％ CO₂培养箱中培养12-16h，用10000TCID50的EV71病毒液感染2h后，使用含有不同浓度(0μM、1μM、3μM、10μM、30μM)的实验化合物厚朴酚(Magnolol)进行处理，空白对照(Mock)加入同体积PBS。同时，选取阳性药物利巴韦林ribavirin(RIB)(浓度为200uM)作为阳性对照，处理36h后，通过实时荧光定量PCR(qPCR)方法检测厚朴酚(Magnolol)抑制病毒复制的效果。

结果分析：检测结果如图5所示，在不同浓度条件下，厚朴酚(Magnolol)对EV71的复制有显著抑制作用。厚朴酚(Magnolol)浓度为10μg/mL时，EV71病毒的抑制率为98％，浓度为10μM、30μM时，对EV71病毒的抑制率均优于阳性药物利巴韦林ribavirin(RIB)。

实施例5厚朴酚(Magnolol)对EV71感染小鼠的影响

4日龄ICR乳鼠全程饲养于SPF环境，小鼠感染病毒采用腹腔注射法，接毒量为1x10^8TCID/只，体积40μl/只，EV71病毒液均以无血清培养基为病毒溶剂，药物溶液均以40％(V/V)ddH₂O+40％(V/V)PEG300+5％(V/V)吐温80+5％(V/V)DMSO的混合溶剂作为药物溶剂。整个实验中，小鼠被分为3组：(1)Mock组：40ul病毒溶剂(无血清培养基)+20ul药物溶剂(40％(V/V)ddH₂O+40％(V/V)PEG300+5％(V/V)吐温80+5％(V/V)DMSO)/只/天；(2)EV71组：40ul EV71病毒液+20ul药物溶剂(40％(V/V)ddH₂O+40％(V/V)PEG300+5％(V/V)吐温80+5％(V/V)DMSO)/只/天；(3)EV71+厚朴酚(Magnolol)组：40ul EV71病毒液+20ul药物溶液/只/天(treated组)。腹腔注射法给药，厚朴酚(Magnolol)的剂量为30mg/kg/d，共计10天。整个实验流程严格遵守动物保护和使用委员会操作指南所规定的美国国立卫生研究院的指导方针。小鼠每日监测指标包括：活动力、体重、四肢灵活度等。

结果分析：结果如图6所示，对照组小鼠的死亡率为100％，与对照组相比，给药组小鼠死亡率为50％。提示厚朴酚(Magnolol)可以在小鼠体内显著抑制EV71的复制，从而显著提高感染小鼠的存活率。

综上所述，厚朴酚(Magnolol)具有显著的抑制EV71复制的活性，可以强烈抑制EV71病毒引起的RD细胞病变效应，增强细胞存活率；抑制病毒RNA水平的复制；显著降低感染老鼠的死亡率，有潜力进一步开发制备一种临床上有效对抗EV71病毒感染的药物。

本发明通过上述实施例证实厚朴酚(Magnolol)在抗EV71病毒中的作用，厚朴酚(Magnolol)能够抑制EV71在宿主细胞RD产生的细胞病变效应(CPE)，增强细胞存活率；抑制EV71在细胞内的复制增殖；保护EV71病毒感染小鼠的致死，有潜力发展成为有效治疗EV71感染的药物。

本发明进一步提供厚朴酚(Magnolol)在制备抗EV71病毒药物中的应用，所述应用是厚朴酚(Magnolol)添加药剂学可接受的辅料和载体，用于制备抗EV71病毒的制剂，辅料包括填充剂、崩解剂、粘合剂、赋形剂、稀释剂、润滑剂、甜味剂或着色剂中的至少一种，根据药物剂型的需要选择不同的辅料。所述制剂是颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂或分散剂。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.厚朴酚和/或其药用盐在制备抗EV71病毒药物中的应用。

2.一种药物制剂，其特征在于，所述药物制剂包括厚朴酚和/或其药用盐。

3.根据权利要求2所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂还包括药剂学可接受的辅料和载体。

4.根据权利要求2所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂的浓度为3～30μg/mL。

5.根据权利要求2所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂的浓度为10μg/mL。

6.根据权利要求2所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂为颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂或注射剂。

7.一种权利要求2所述的药物制剂在制备抗EV71病毒药物中的应用。

Images