CN115636853A - 一种基于荧光指示剂置换法核苷酸阴离子识别二茂铁受体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于荧光指示剂置换法核苷酸阴离子识别二茂铁受体及其制备方法和应用。该二茂铁受体含有猝灭基团(二茂铁)和核苷酸阴离子识别基团氨氢和吡啶盐正离子。受体分子与荧光指示剂在水溶液中能自组装成纳米组装体(Fc2Py‑16C/UD)，同时猝灭指示剂的荧光。在该体系中加入核苷酸阴离子后，指示剂从组装体中释放出来荧光恢复，其中对GTP检测限最低，达到1.06nM。
Description
技术领域
本发明涉及荧光检测技术领域，特别涉及一种基于荧光指示剂置换法核苷酸阴离子识别二茂铁受体及其制备方法和应用。
背景技术
核苷酸是核糖核酸及脱氧核糖核酸的基本组成单位，是体内合成核酸的前身物。核苷酸随着核酸分布于生物体内各器官、组织、细胞的核及胞质中，并作为核酸的组成成分参与生物的遗传、发育、生长等基本生命活动。生物体内还有相当数量以游离形式存在的核苷酸。三磷酸腺苷在细胞能量代谢中起着主要的作用。体内的能量释放及吸收主要是以产生及消耗三磷酸腺苷来体现的。此外，三磷酸尿苷、三磷酸胞苷及三磷酸鸟苷也是有些物质合成代谢中能量的来源。总之，核苷酸类化合物具有重要的生物学功能。
鉴于荧光技术的优点，如简单、灵敏度和实时检测，已经受到广泛的关注。目前传统的传感器主要是基于指标-间隔-受体(ISR)方法需要将受体与荧光染料共价连接起来，合成比较繁琐，耗费人力物力，成本较高。指示剂置换(IDA)方法受体合成简单、灵敏度高、成本低廉而受到广泛关注，但在针对众多的核苷酸传感方面的研究较少，因此，仍需要开发性能优异的荧光传感器来检测水介质中的核苷酸阴离子。
发明内容
针对现有技术中的不足与难题，本发明的目的在于提供一种基于荧光指示剂置换法核苷酸阴离子识别二茂铁受体及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
本发明提供了一种基于荧光指示剂置换法核苷酸阴离子识别二茂铁受体，具有式1所示结构：
本发明还提供了上述基于荧光指示剂置换法核苷酸阴离子识别二茂铁受体的制备方法，包括以下步骤：
将1，1-二茂铁甲酸和3-氨基吡啶与有机溶剂、脱水剂、催化剂Ⅰ混合，进行酰胺化反应，得到具有式a所示结构的化合物；
将所述具有式a所示结构的化合物与溴代十六烷，极性有机溶剂、催化剂Ⅱ混合，进行成盐反应，得到识别核苷酸阴离子的二茂铁受体。
优选的，所述1，1-二茂铁甲酸和3-氨基吡啶的摩尔比为1:2～3。
优选的，所述酰胺化反应的温度为20～35℃，时间为20～24h。
优选的，所述脱水剂为DCC，所述催化剂Ⅰ为DMAP。
优选的，所述具有式a所示结构的化合物与溴代十六烷的摩尔比为1:2～3。
优选的，所述成盐反应的催化剂Ⅱ为KI。
优选的，所述成盐反应的温度为82℃，时间为24～28h。
本发明还提供了一种识别核苷酸阴离子二茂铁受体组装纳米聚集体，是上述的二茂铁受体与荧光指示剂在水溶液中自组装成纳米聚集体，纳米聚集体不发光。
优选的，所述荧光指示剂包括荧光素钠(UD)、署红(EY)、溶剂绿7(HPTS)、玫瑰红和4,4',4”,4”'-(卟啉-5,10,15,20-四基)四苯磺酸中的一种或几种。
本发明还提供了上述二茂铁受体在检测核苷酸阴离子中的应用，核苷酸包括ATP、GTP、CTP、UTP、ADP、AMP等。
本发明还提供了一种核苷酸阴离子的检测方法，以GTP检测为例(其他核苷酸阴离子的检测方法基本一致)，包括以下步骤：
首先用二茂铁受体对荧光指示剂进行荧光滴定，获得受体的饱和当量。
对待测样品与二茂铁受体/荧光指示剂的混合液进行紫外吸收光谱测试，获得待测样品在490nm处的紫外吸收强度，根据所述紫外吸收强度和预定的第一标准曲线获得待测样品中GTP的浓度；所述第一标准曲线为GTP、二茂铁受体/荧光指示剂的摩尔比与紫外吸收强度的线性关系曲线；
或者，在激发波长为490nm激光照射下，对待测样品与二茂铁受体/荧光指示剂的混合液进行荧光发射光谱测试，获得待测样品在516nm处的荧光强度，根据所述荧光强度和预定的第二标准曲线获得待测样品中GTP的浓度；所述第二标准曲线为GTP、二茂铁受体/荧光指示剂的摩尔比与荧光强度的线性关系曲线。
优选的，所述紫外吸收光谱测试和荧光发射光谱测试中，所述待测样品中GTP的线性检测范围独立为0～7.5μM。
与现有技术相比，本发明有益效果是：
本发明提供了一种基于荧光指示剂置换法核苷酸阴离子识别二茂铁受体，具有式1所示结构。该二茂铁受体含有猝灭基团(二茂铁)和核苷酸阴离子识别基团氨氢和吡啶盐正离子。受体分子与荧光指示剂在水溶液中能自组装成纳米组装体(Fc2Py-16C/UD)，同时猝灭指示剂的荧光。在该体系中加入核苷酸阴离子后，指示剂从组装体中释放出来荧光恢复，其中对GTP检测限最低，达到1.06nM。
本发明提供了上述基于荧光指示剂置换法核苷酸阴离子识别二茂铁受体的制备方法，此法含有酰胺化反应和成盐反应两步反应，合成方法简单，原料成本低廉，且具有优异的选择性，有广泛的应用价值。
附图说明
图1为二茂铁受体的合成路线；
图2为二茂铁受体的核磁氢谱；
图3为受体对UD的荧光滴定；
图4为受体/UD对GTP的紫外荧光滴定曲线；
图5为受体/UD对GTP的检测限；
图6为受体/UD对核苷酸阴离子的选择性。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明提供了一种基于荧光指示剂置换法核苷酸阴离子识别二茂铁受体，具有式1所示结构：
本发明所述二茂铁受体的结构中含有吡啶盐、氨氢和疏水烷基链，其中吡啶盐能有效猝灭荧光指示剂(UD)的荧光，当加入核苷酸阴离子时，可以有效的置换出来指示剂，荧光恢复。在本发明中，核苷酸阴离子中的磷酸基团和二茂铁受体中的吡啶盐和氨氢之间的静电引力、氢键作用、Л-Л作用比受体与指示剂之间的作用力更强，从而有效置换出荧光指示剂，发出强烈荧光，从而实现核苷酸阴离子的荧光响应。
本发明还提供了上述基于荧光指示剂置换法核苷酸阴离子识别二茂铁受体的制备方法，包括以下步骤：
将1，1-二茂铁甲酸和3-氨基吡啶与有机溶剂、脱水剂、催化剂I混合，进行酰胺化反应，得到具有式a所示结构的化合物；
将所述具有式a所示结构的化合物与溴代十六烷，极性有机溶剂、催化剂II混合，进行成盐反应，得到识别核苷酸阴离子的二茂铁受体。
本发明中将1，1-二茂铁甲酸和3-氨基吡啶与有机溶剂、脱水剂、催化剂I混合，进行酰胺化反应，得到具有式a所示结构的化合物。
在本发明中所述有机溶剂优选为二氯甲烷、甲醇、乙腈、四氢呋喃、二甲亚砜中的一种或几种，进一步优选为二氯甲烷和甲醇。在本发明中，所述1，1-二茂铁甲酸和3-氨基吡啶的摩尔比优选为1:2～3.5，更优选为1:2～3，进一步优选为1:2.5。
在本发明中，所述脱水剂优选为DCC(二环己基碳二亚胺)，所述催化剂I优选为DMAP(4-二甲氨基吡啶)。
在本发明中，所述1，1-二茂铁甲酸与DCC的摩尔比优选为1:2～2.5，更优选为1:2.2；所述1，1-二茂铁甲酸与DMAP的摩尔比优选为1:2～2.5，更优选为1:2.5。
在本发明中，所述酰胺化反应优选在室温条件下进行。在本发明中，所述酰胺化反应的温度优选为25℃，时间优选为20～24h，更优选为24h。本发明优选通过薄层色谱分析对酰胺化反应进行监测，直至原料基本反应完全。
在本发明中，所述酰胺化反应后，本发明优选对酰胺化反应液进行后处理，后处理优选包括以下步骤：
对酰胺化反应液依次进行洗涤、浓缩和提纯，得到具有式a所示结构的化合物纯品。在本发明中，洗涤优选为盐酸洗涤，洗涤的次数优选为3～4次。在本发明中，浓缩的方式优选为旋蒸。在本发明中，柱层析分离的固定相优选为硅胶，洗脱液优选为CH2Cl2和CH3OH，所述CH2Cl2和CH3OH的体积比优选为12:1。
得到所述具有式a所示结构的化合物后，本发明将所述具有式a所示结构的化合物与溴代十六烷、极性有机溶剂、催化剂II混合，进行成盐反应，得到二茂铁受体。
在本发明中所述极性有机溶剂优选为甲醇、甲苯、乙腈、四氢呋喃、二甲亚砜中的一种或几种，所述催化剂II优选为碘化钾。
在本发明中，所述具有式a所示结构的化合物与溴代十六烷的摩尔比为1:2～2.5，更优选为1:2.2。
在本发明中，所述成盐反应的温度优选为80～90℃，进一步优选为82℃；所述成盐反应的时间优选为24～30h，更优选为24h。
在本发明中，所述成盐反应后，本发明优选对成盐反应液进行后处理，后处理优选包括以下步骤：
对成盐反应液依次进行过滤、洗涤和干燥，得到目标化合物二茂铁受体纯品。在本发明中，洗涤优选为乙腈洗涤，洗涤的次数优选为2～3次。本发明对干燥的方式没有特殊的要求，采用本领域熟知的干燥方式使固体恒重即可，具体的如烘干。
在本发明中，所述识别核苷酸阴离子的二茂铁受体的合成路线如图1所示。二茂铁受体的核磁氢谱如图2所示。
本发明还提供了上述二茂铁受体在检测核苷酸阴离子中的应用，核苷酸包括ATP、GTP、CTP、UTP、ADP、AMP等。
在本发明中所述二茂铁受体对核苷酸阴离子有较好的响应，二茂铁受体有效的猝灭了指示剂UD的荧光，加入核苷酸阴离子后，荧光显著恢复，且不受其他阴离子干扰。
本发明还提供了一种核苷酸阴离子的检测方法,以GTP检测为例，包括以下步骤：
首先用二茂铁受体对荧光指示剂进行荧光滴定，获得受体的饱和当量。
对待测样品与二茂铁受体/荧光指示剂的混合液进行紫外吸收光谱测试，获得待测样品在490nm处的紫外吸收强度，根据所述紫外吸收强度和预定的第一标准曲线获得待测样品中GTP的浓度；所述第一标准曲线为GTP、二茂铁受体/荧光指示剂的摩尔比与紫外吸收强度的线性关系曲线。
或者，在激发波长为490nm激光照射下，对待测样品与二茂铁受体/荧光指示剂的混合液进行荧光发射光谱测试，获得待测样品在516nm处的荧光强度，根据所述荧光强度和预定的第二标准曲线获得待测样品中GTP的浓度；所述第二标准曲线为GTP、二茂铁受体/荧光指示剂的摩尔比与荧光强度的线性关系曲线。
在本发明中，无特殊说明，测试均在HEPES缓冲溶液(10mM pH＝7.2)中进行。荧光指示剂UD的浓度为6μM。
在本发明中，二茂铁受体对荧光指示剂进行荧光滴定，获得受体的饱和当量。优选包括以下步骤：
用二甲亚砜配制二茂铁受体母液摩尔浓度2×10-4mol/L的溶液，将其分为18组，每组溶液的体积为2mL，各组的二茂铁受体与指示剂摩尔浓度的比例为0:1、0.2:1、0.4:1、0.6:1、0.8:1、1:1、1.2:1、1.4:1、1.6:1、1.8:1、2:1、2.2:1、2.4:1、2.6:1、3:1、3.3:1、3.6:1、4:1；
对每组溶液进行荧光光谱测试，获得每组溶液在516nm处的发射强度，以二茂铁受体的摩尔比为横坐标，以荧光发射强度为纵坐标，绘制滴定曲线。
受体对UD的荧光滴定如图3所示。
在本发明中，对待测样品与二茂铁受体/荧光指示剂的混合液进行紫外吸收光谱测试，获得待测样品在490nm处的紫外吸收强度，根据所述紫外吸收强度和预定的第一标准曲线获得待测样品中GTP的浓度；在本发明中，所述第一标准曲线的绘制方法，优选包括以下步骤：
用纯水配制GTP摩尔浓度4×10-4mol/L的溶液，将其分为18组，每组溶液的体积为2mL，各组的GTP与受体(18μM)/指示剂(6μM)摩尔浓度的比例为0:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、20:1、30:1、40:1；
对每组溶液进行紫外吸收光谱测试，获得每组溶液在490nm处的吸收强度，以GTP的摩尔比为横坐标，以吸收强度为纵坐标，绘制第一标准曲线。
在本发明中，在所述紫外光谱测试中，所述待测样品中GTP的线性检测范围优选为0～7.5μM。
或者，在激发波长为490nm激光照射下，对待测样品与二茂铁受体/荧光指示剂的混合液进行荧光发射光谱测试，获得待测样品在516nm处的荧光强度，根据所述荧光强度和预定的第二标准曲线获得待测样品中GTP的浓度；在本发明中，所述第二标准曲线的绘制方法，优选包括以下步骤：
用纯水配制GTP摩尔浓度4×10-4mol/L的溶液，将其分为18组，每组溶液的体积为2mL，各组的GTP与受体(18μM)/指示剂(6μM)摩尔浓度的比例为0:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、20:1、30:1、40:1；
对每组溶液进行荧光光谱测试，获得每组溶液在516nm处的发射强度，以GTP的摩尔比为横坐标，以发射强度为纵坐标，绘制第二标准曲线。
在本发明中，在所述荧光光谱测试中，所述待测样品中GTP的线性检测范围优选为0～7.5μM。
下面结合实施例对本发明提供的基于荧光指示剂置换法识别核苷酸阴离子的二茂铁受体及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1二茂铁受体(Fc2Py-16C)的合成
(1)先称取0.274g的1，1-二茂铁甲酸(1mmol)和0.453g的DCC(2.2mmol)溶解在二氯甲烷中，室温搅拌30分钟，然后加入0.235g的3-氨基吡啶(2.5mmol)和0.305g的DMAP(2.5mmol)，室温反应24小时，通过薄层色谱分析对酰胺化反应进行监测，直至原料基本反应完全。用盐酸洗涤2-3次后，通过旋蒸浓缩。柱层析分离，洗脱液CH2Cl2和CH3OH的体积比为12:1，得到白色固体，记为化合物a，0.357g，84％。
(2)化合物Fc2Py-16C的合成：将化合物a(0.213g，0.5mmol)和溴代十六烷(0.336g，1.1mmol)溶解在乙腈中，随后加入0.015g的碘化钾，反应液在82℃下回流24小时，结束后过滤，用二氯甲烷洗涤2-3次，烘干得到黄棕色固体Fc2Py-16C(0.377g，86％产率)。
实施例2二茂铁受体(Fc2Py-16C)/UD对GTP的响应
在HEPES缓冲溶液中(10mM pH＝7.2)测定了二茂铁受体(Fc2Py-16C)/UD加入GTP后的荧光发射光谱和紫外吸收光谱去研究其对GTP的响应。具体步骤如下：
用纯水配制GTP摩尔浓度4×10-4mol/L的溶液，将其分为18组，每组溶液的体积为2mL，各组的GTP与受体(18μM)/指示剂(6μM)摩尔浓度的比例为0:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、20:1、30:1、40:1，测试了其紫外吸收光谱和在激发波长为490nm激光照射下的处荧光发射光谱。
其紫外吸收和荧光发射图谱如图4所示。
由图4(a)所示，受体(18μM)/指示剂(6μM)在516nm的荧光强度为0，在逐渐加入GTP后，在516nm的发射强度逐渐增强，在GTP含量达到0.12mM时达到饱和。由图4(b)所示，在逐渐滴加GTP后，490nm的吸光度逐渐下降，同时在515nm处形成一个新的吸收峰，并随着GTP的加入，在515nm处的吸光度逐渐增加，在GTP含量达到0.12mM时达到饱和。
在荧光发射光谱测试中，受体(18μM)/指示剂(6μM)和0～7.5μM的GTP与荧光强度的线性关系曲线如图5所示。
由图5可以看出，荧光强度与GTP含量有较好的线性关系，其线性方程为Y＝3.16×108X+12.6，R2＝0.9944；根据3σ/K规则，计算GTP的检测限为1.06nM(σ＝0.11，K＝3.16×108)。
二茂铁受体(Fc2Py-16C)/UD对核苷酸阴离子的检测限见表1：
表1
实施例3二茂铁受体(Fc2Py-16C)/UD对核苷酸阴离子的选择性测试
在含有受体(18μM)/指示剂(6μM)的溶液中分别加入4×10-4mol/L的干扰离子，所得结果如图6所示，测试了受体(18μM)/指示剂(6μM)对GTP，ADP，PPi，UTP，CTP，Cl-，Pi，Br-，SO4 2-，CO3 2-，AMP，F-，I-的荧光响应，结果发现加入核苷酸阴离子后，其中GTP和ATP的荧光强度最强，其他核苷酸阴离子的荧光强度也较高，说明二茂铁受体(Fc2Py-16C)对核苷酸阴离子具有极其优秀的选择性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种基于荧光指示剂置换法核苷酸阴离子识别二茂铁受体，其特征在于，具有式1所示结构：
2.权利要求1所述的基于荧光指示剂置换法核苷酸阴离子识别二茂铁受体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将1，1-二茂铁甲酸和3-氨基吡啶与有机溶剂、脱水剂、催化剂Ⅰ混合，进行酰胺化反应，得到具有式a所示结构的化合物；
将所述具有式a所示结构的化合物与溴代十六烷，极性有机溶剂、催化剂Ⅱ混合，进行成盐反应，得到识别核苷酸阴离子的二茂铁受体。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述1，1-二茂铁甲酸和3-氨基吡啶的摩尔比为1:2～3.5；所述脱水剂为DCC，所述催化剂Ⅰ为DMAP；所述酰胺化反应的温度为20～40℃，时间为20～30h。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述具有式a所示结构的化合物与溴代十六烷的摩尔比为1:2～3。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述成盐反应的催化剂Ⅱ为KI，所述成盐反应的温度为80～90℃，时间为24～30h。
6.一种识别核苷酸阴离子二茂铁受体组装纳米聚集体，其特征在于，所述纳米聚集体是权利要求1所述的二茂铁受体与荧光指示剂在水溶液中自组装成纳米聚集体。
7.根据权利要求6所述的识别核苷酸阴离子二茂铁受体组装纳米聚集体，其特征在于，所述荧光指示剂包括荧光素钠、署红、溶剂绿7、玫瑰红和4,4',4”,4”'-(卟啉-5,10,15,20-四基)四苯磺酸中的一种或几种。
8.权利要求1所述基于荧光指示剂置换法核苷酸阴离子识别二茂铁受体或权利要求2～5任意一项所述制备方法制备得到的二茂铁受体在核苷酸阴离子检测中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，核苷酸包括ATP、GTP、CTP、UTP、ADP、AMP，以GTP检测为例，GTP检测包括以下步骤：
对待测样品与二茂铁受体/荧光指示剂的混合液进行紫外吸收光谱测试，获得待测样品在490nm处的紫外吸收强度，根据所述紫外吸收强度和预定的第一标准曲线获得待测样品中GTP的浓度；所述第一标准曲线为GTP、二茂铁受体/荧光指示剂的摩尔比与紫外吸收强度的线性关系曲线；
或者，在激发波长为490nm激光照射下，对待测样品与二茂铁受体/荧光指示剂的混合液进行荧光发射光谱测试，获得待测样品在516nm处的荧光强度，根据所述荧光强度和预定的第二标准曲线获得待测样品中GTP的浓度；所述第二标准曲线为GTP、二茂铁受体/荧光指示剂的摩尔比与荧光强度的线性关系曲线。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述紫外吸收光谱测试和荧光发射光谱测试中，所述待测样品中GTP的线性检测范围独立为0～7.5μM。
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