CN110981880B - 一种比率型atp荧光探针及其合成方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种比率型ATP荧光探针及其合成方法与应用，其结构式如式Ⅰ所示：
Figure DDA0002289357560000011
本发明首次提供了基于结构式I的比率型ATP荧光探针及其合成方法，该探针的响应机理基于多位点结合的策略，利用探针与ATP分子间多重位点的相互作用力，特异性的对ATP进行响应。本发明的探针具有比率和双光子成像的性质，可以使其不受仪器等环境因素的干扰，并且具有较大的成像深度。本发明探针的发射波长达到了近红外区，使其免受生物体自身荧光信号的干扰，具有更高的信背比。

Description

一种比率型ATP荧光探针及其合成方法与应用
技术领域
本发明属于有机合成和荧光分析技术领域，具体涉及一种比率型ATP荧光探针及其合成方法与应用。
背景技术
三磷酸腺苷(ATP)是细胞中最丰富的核苷多磷酸(NPP)阴离子，是肌肉收缩、酶催化、细胞器运输和神经元膜电位的维持等生理活动的主要能源物质。在线粒体中，ATP是通过一系列称为氧化磷酸化的化学和生物过程将磷酸酯加到二磷酸腺苷(ADP)中产生的。在缺血，恶性肿瘤和帕金森氏病等许多疾病过程中，线粒体内ATP含量的改变通常会影响线粒体的生理功能。因此，为了阐明正常或患病状态下ATP的功能，迫切需要开发一种直接方法来实时监测线粒体中ATP的变化。
荧光探针因其高灵敏度，高时空分辨率已成为了解活细胞功能和分子识别的有力工具。相比于基因编码的荧光探针，有机小分子荧光探针操作简便并且成本低，可以与其互补用于活细胞成像。目前的ATP探针在选择性和反应浓度方面还有待改进，并且只有很少的探针能够真正地实现实时监测线粒体ATP水平。单信号输出使其易受到仪器等环境因素的干扰，比率型探针可以通过良好的多通道荧光信号输出消除实验条件引起的不利影响，因此合成一种选择性高、响应速度快、能定量监测ATP波动水平的比率型荧光探针是十分有必要的。
发明内容
本发明的目的是提供选择性高、响应速度快的比率型ATP荧光探针及其合成方法与应用。
本发明这种比率型ATP荧光探针，其结构式如式Ⅰ所示：
Figure BDA0002289357540000011
其中：R1、R2均为H、C1-8烃基、取代烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基中的一种；R3、R4均为H、C1-20烷基、取代烷基、环烷基、取代环烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基中的一种；R5为NH、含氮烷基链、含氮环烷基中的一种，R6为已知的罗丹明荧光染料。
优选的，本发明的比率型ATP荧光探针，其结构式为Ⅱ～Ⅳ中的一种，
Figure BDA0002289357540000021
本发明这种比率型ATP荧光探针的合成方法，包括以下步骤：
将R6溶解于乙腈中，加入活化试剂，将反应混合物在室温搅拌反应；然后将中间体e和碱性试剂添加到反应混合物中，并在室温继续搅拌反应；干燥混合物，通过硅胶柱色谱法纯化，得到红色产物ATP荧光探针(I)；
合成路线如下：
Figure BDA0002289357540000022
Figure BDA0002289357540000031
所述的活化试剂为HATU、DCC、NHS中的一种，R6与活化试剂的摩尔比为1:(1.5～3)，R6与乙腈的摩尔比为1:(15～25)，R6与碱性添加剂的摩尔比为1:(4～6)，R6与中间体e的摩尔比为1:(1.5～3)；所述的碱性添加剂为二乙胺、三乙胺中的一种；搅拌反应时间为0.5～1h，继续搅拌反应时间6～8h。
一种中间体e的合成方法，包括以下步骤：
将中间体c溶解在乙腈中，向溶液中加入活化试剂，然后将反应混合物在室温搅拌；然后将化合物d和碱加入到反应混合物中，并在室温下继续搅拌反应；反应完成后将混合物干燥并通过硅胶柱色谱纯化，得到中间产物e；
合成路线如下：
Figure BDA0002289357540000032
所述的中间体c与反应物d的摩尔比为1:(4～8)；活化试剂为HATU，DCC，NHS中的一种或两种，中间体c与活化试剂的摩尔比为1:(1.5～3)；中间体c与乙腈的摩尔体积比为1:(15～25)mol/L；碱性添加剂为二乙胺、三乙胺中的一种，中间体c与碱的摩尔比为1:(4～6)；搅拌反应时间为0.5～1h，继续搅拌反应时间6～8h。
一种中间体c的合成方法，包括以下步骤：
将化合物a和化合物b加入到甲磺酸中，在设定温度下进行反应，反应完毕后冷却，将反应液倒入冰水中，加入无机酸后搅拌；滤出所得沉淀物，并用大量水洗涤，产物干燥后，通过硅胶柱色谱法纯化，得到黑色产物中间体c；
合成路线如下：
Figure BDA0002289357540000041
所述的反应物a与反应物b的摩尔比为1:(1～1.2)；反应物a与甲基磺酸的摩尔体积比为1:(1～5)mol/L；设定温度为70～90℃，反应时间为3～5h。
本发明的有益效果：1)本发明首次提供了基于结构式I的比率型ATP荧光探针及其合成方法，该探针的响应机理基于多位点结合的策略，利用探针与ATP分子间多重位点的相互作用力，特异性的对ATP进行响应。2)本发明的探针具有比率和双光子成像的性质，可以使其不受仪器等环境因素的干扰，并且具有较大的成像深度。3)本发明探针的发射波长达到了近红外区，使其免受生物体自身荧光信号的干扰，具有更高的信背比。4)尤其是本发明实施例制备的Rh6G-ACFPN系列可以高选择性可逆地对ATP响应，并且具有合适的解离常数(Kd)，使我们在高时间分辨率下直接监测细胞中线粒体ATP的动态变化。5)更进一步而言，本发明中Rh6G-ACFPN系列首次成功地定量和区分了正常细胞和癌细胞系中的线粒体ATP水平，证明了探针的高灵敏性和实用性。
附图说明
图1为实施例3制备的比率型荧光探针Rh6G-ACFPN-3的核磁共振氢谱图；
图2为实施案3制备的比率型荧光探针Rh6G-ACFPN-3的核磁共振碳谱图；
图3为实施例4的比率型荧光探针Rh6G-ACFPN(实施例3制备)对ATP响应情况的荧光光谱图；
图4为实施例5的比率型荧光探针Rh6G-ACFPN(实施例3制备)对不同分析物的选择性1-16分析物依次为:探针,ATP,ADP,AMP,CTP,TTP,GTP,P2O7 4-,H2PO4 -,PO4 3-,SO4 2-,CH3CO2 -,CO3 2-,K+,Ca2+,Na+)；
图5(a)为实施例6的比率型荧光探针Rh6G-ACFPN对细胞中ATP含量变化的时间监测荧光成像；(b)图(a)中荧光读值的平均强度比(长波长通道/短波长通道)
具体实施方式
实施例1：比率型ATP荧光探针Rh6G-ACFDN-1的合成(R1,R2为乙基，R3，R4为H，R5为氨基，R6为罗丹明6G)
合成路线如下：
Figure BDA0002289357540000051
具体包括以下步骤：
(1)中间体ACF的合成：
将4-二乙氨基酮酸(1.00g,3.19mmol)和氨基-3,4-二氢萘(0.50g,3.10mmol)加入到甲磺酸5mL中，在80℃温度下反应4h；冷却后，将混合物倒入冰水中，加入高氯酸(5mL)后搅拌；滤出所得沉淀物，并用大量水洗涤，产物干燥后，通过硅胶柱色谱法纯化，使用CH2Cl2/EtOH混合物作为洗脱剂，得到黑色中间体ACF化合物。
(2)罗丹明6G的合成：
将乙氨基-4-甲基苯酚(0.50g，3.30mmol)，对甲苯磺酰胺(0.10g，0.58mmol)和4-羧苯甲醛(0.25g，1.67mmol)溶解在CH3CH2COOH(5mL)中，然后将反应混合物在95℃下搅拌5小时。冷却后，将混合物倒入冰水中，然后加入高氯酸(1mL)。滤出所得沉淀物，并用大量水洗涤。样品干燥后，通过硅胶色谱法纯化，使用CH2Cl2/EtOH混合物作为洗脱剂，得到Rh6G黑色固体化合物。
(3)探针ACF-ATP-1的合成
将DCC(0.095g，0.8mmol)和NHS(0.113g，0.5mmol)加入到化合物ACF(0.22g，0.5mmol)在CH3CN(10mL)中的溶液中，然后将反应混合物在室温搅拌30min后，得到极性较小的紫色化合物；然后将乙二胺(3mmol)和三乙胺(415μL)加入到反应体系中，并在室温下搅拌8h，将混合物干燥并通过硅胶色谱法纯化，使用CH2Cl2/EtOH混合物作为洗脱剂，得到ACF-ATP-1的化合物。
(4)探针Rh6G-ACFDN-1的合成
将DCC(95mg，0.8mmol)和NHS(113mg，0.5mmol)添加至化合物Rh6G(207mg，0.5mmol)的CH3CN(10mL)溶液中，然后将反应混合物在室温搅拌30min后，获得较小极性的紫色化合物，然后将ACF-ATP-1(400mg mmol)和三乙胺(415μL)添加到反应混合物中，并在室温搅拌6h。干燥混合物，通过硅胶色谱法纯化，使用CH2Cl2/EtOH混合物作为洗脱剂，得到Rh6G-ACFDN-1的红色化合物(产率：13％，65mg)。
对产物进行核磁氢谱表征，结果如下：
1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.23(d,J＝7.5Hz,2H),8.15(d,J＝7.4Hz,1H),7.74(s,1H),7.56(dd,J＝15.0,8.0Hz,2H),7.48(dd,J＝12.1,6.4Hz,2H),7.43(d,J＝7.9Hz,3H),7.06(s,2H),7.02(s,1H),6.86(d,J＝4.0Hz,3H),6.45(dd,J＝13.9,10.2Hz,2H),3.56–3.47(m,7H),3.39–3.27(m,9H),2.13(s,4H),1.37(t,J＝7.0Hz,11H),1.14(dd,J＝14.9,8.0Hz,7H).
MS(ESI):calcd for[C56H57N6O4]+877.4,found 877.5.
氢谱的谱图与合成路线中Rh6G-ACFDN-1完全一致。
实施例2：比率型ATP荧光探针Rh6G-ACFDN-2的合成(R1,R2为乙基，R3，R4为H，R5为二乙烯三胺，R6为罗丹明6G)
Figure BDA0002289357540000071
(1)探针ACF-ATP-2的合成
将DCC(0.095g，0.8mmol)和NHS(0.113g，0.5mmol)加入到实施例1中制备的ACF(0.22g，0.5mmol)在CH3CN(10mL)中的溶液中，然后将反应混合物在室温搅拌30min后，得到极性较小的紫色化合物；然后将二乙烯三胺(3mmol)和三乙胺(415μL)加入到反应混合物中，并在室温下搅拌过夜。将混合物干燥并通过硅胶色谱法纯化，使用CH2Cl2/EtOH混合物作为洗脱剂，得到ACF-ATP-2的化合物。
(2)探针Rh6G-ACFTN-2的合成
将DCC(95mg，0.8mmol)和NHS(113mg，0.5mmol)添加至化合物Rh6G(207mg，0.5mmol)的CH3CN(10mL)溶液中，然后将反应混合物在室温搅拌30min，获得较小极性的紫色化合物，然后将ACF-ATP-2(400mg)和三乙胺(415μL)添加到反应混合物中，并在室温搅拌7h，干燥混合物，通过硅胶色谱法纯化，使用CH2Cl2/EtOH混合物作为洗脱剂，得到红色化合物Rh6G-ACFDN-2(产率：13％，65mg)。
对本实施例制备的Rh6G-ACFDN-2进行核磁分析，结果如下：
1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.23(d,J＝7.5Hz,2H),8.15(d,J＝7.4Hz,1H),7.74(s,1H),7.56(dd,J＝15.0,8.0Hz,2H),7.49(d,J＝7.7Hz,2H),7.43(d,J＝7.9Hz,3H),7.06(s,2H),7.02(s,1H),6.86(d,J＝4.0Hz,3H),6.46(d,J＝13.1Hz,2H),3.52(d,J＝6.9Hz,7H),3.39–3.27(m,9H),2.14(d,J＝7.5Hz,4H),1.37(t,J＝7.0Hz,11H),1.18–1.10(m,7H).MS(ESI):calcd for[C58H62N7O4]+920.5,found 920.5.
氢谱数据与Rh6G-ACFDN-2结构式完全一致。
实施例3：比率型ATP荧光探针Rh6G-ACFPN-3的合成(R1,R2,为乙基，R3，R4为H，R5为4-(2-氨基乙基)哌嗪，R6为罗丹明6G)
Figure BDA0002289357540000081
(1)探针ACF-ATP-3的合成
将DCC(0.095g，0.8mmol)和NHS(0.113g，0.5mmol)加入到化合物ACF(0.22g，0.5mmol)在CH3CN(10mL)中的溶液中，然后将反应混合物在室温搅拌30min后，得到极性较小的紫色化合物。然后将4-(2-氨基乙基)哌嗪(3mmol)和三乙胺(415μL)加入到反应混合物中，并在室温下搅拌过夜，将混合物干燥并通过硅胶色谱法纯化，使用CH2Cl2/EtOH混合物作为洗脱剂，得到ACF-ATP-3的化合物。
(2)探针Rh6G-ACFPN-3的合成
将DCC(95mg，0.8mmol)和NHS(113mg，0.5mmol)添加至化合物Rh6G(207mg，0.5mmol)的CH3CN(10mL)溶液中，然后将反应混合物在室温搅拌30分钟，获得较小极性的紫色化合物。然后将ACF-ATP-3(400mg)和三乙胺(415μL)添加到反应混合物中，并在室温搅拌8h。干燥混合物，通过硅胶色谱法纯化，使用CH2Cl2/EtOH混合物作为洗脱剂，得到Rh6G-ACFPN-3的红色化合物(产率：13％，65mg)。
对Rh6G-ACFPN-3进行核磁表征，其氢谱如图1所示，碳谱如图2所示，具体如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.78(d,J＝6.5Hz,1H),7.56(t,J＝6.3Hz,3H),7.38(t,J＝5.8Hz,2H),7.32(d,J＝7.0Hz,2H),7.11(d,J＝6.6Hz,1H),6.93(s,2H),6.65(s,2H),6.56(d,J＝8.2Hz,1H),6.41(d,J＝17.3Hz,3H),6.36–6.28(m,2H),6.20(d,J＝8.7Hz,1H),3.66(s,2H),3.53–3.42(m,6H),3.39(s,2H),3.27(d,J＝6.8Hz,8H),2.60–2.41(m,4H),2.18(s,6H),1.35(t,J＝6.6Hz,6H),1.09(t,J＝6.3Hz,6H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ167.98,167.41,156.40,155.14,153.99,151.92,150.48,147.47,146.29,137.10,136.61,132.49,130.70,128.47,128.07,127.84,126.70,124.97,122.51,121.64,119.12,112.94,112.23,111.38,107.53,104.02,99.66,96.78,93.06,65.42,54.88,51.79,43.35,37.79,35.89,28.68,27.21,20.14,16.47,13.10,12.81.HRMS(ESI):for[C60H64O4N7]+946.5014,found 946.5015.
氢谱和碳谱的与Rh6G-ACFPN-3的结构式完全一致。
实施例4：比率型ATP荧光探针Rh6G-ACFPN对ATP的荧光响应
将探针溶解在DMSO中制成储备溶液(500μM)，将其用HEPES(pH 7.4)/EtOH(9/1，v/v)稀释为10μM作为测试的溶液，激发波长为500nm,测试结果显示：两个发射峰分别为624nm及560nm左右。560nm处的荧光强度迅速增强，624nm处的荧光强度缓慢增强，两峰的荧光比值随时间或ATP浓度增加而增大，并且在2～9mM的浓度范围具有良好的线性关系，说明该比率型荧光探针有望于对生物样品中的MGO进行定量检测。
实施例5：比率型ATP荧光探针Rh6G-ACFPN对不同分析物的选择性
将探针溶解在DMSO中制成储备溶液(500μM)，将其用HEPES(pH 7.4)/EtOH(9/1，v/v)稀释为10μM作为测试的溶液，分别向探针中加入ATP,ADP,AMP,CTP,TTP,GTP,P2O7 4-,H2PO4 -,PO4 3-,SO4 2-,CH3CO2 -,CO3 2-,K+,Ca2+,Na+等溶液，分析物浓度为5mM。激发波长为500nm，测试结果显示，在加入其他分析物时探针的荧光强度不发生改变，而加入ATP后有显著的荧光增强，证明了探针的高选择性。
实施例6：比率型ATP荧光探针Rh6G-ACFPN对ATP含量变化的荧光可逆细胞成像
实验条件为：0～30min，25mM葡萄糖处理；30～80min，无葡萄糖；80～120min，25mM葡萄糖；120～150min，无葡萄糖。
将探针Rh6G-ACFPN加入到HeLa细胞中孵育20min，随后通过通过连续添加葡萄糖或用无葡萄糖培养基洗涤的方式来控制线粒体ATP水平，通过荧光比率来实时对细胞内ATP含量来进行监测。实验结果显示，无葡萄糖引起ATP浓度降低，荧光强度比值降低，通过添加葡萄糖来升高ATP水平后，荧光强度比值恢复，证明了探针具有实时可逆监测细胞内ATP水平的能力。

Claims (8)

1.一种比率型ATP荧光探针，其特征在于，其结构式如式Ⅰ所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
其中：R 1、R2均为乙基；R3、R4均为H；R5为亚氨基、乙二胺基、哌嗪基中的一种，R6为
Figure DEST_PATH_IMAGE004
，
Figure DEST_PATH_IMAGE005
的位置与主结构式相连。
2.根据权利要求1所述比率型ATP荧光探针，其特征在于，其结构式为Ⅱ~Ⅳ中的一种，
Figure DEST_PATH_IMAGE007
。
3.一种根据权利要求1或2比率型ATP荧光探针的合成方法，包括以下步骤：
将罗丹明6G溶解于乙腈中，加入活化试剂，将反应混合物在室温搅拌反应；然后将中间体e和碱性试剂添加到反应混合物中，并在室温继续搅拌反应；干燥混合物，通过硅胶柱色谱法纯化，得到红色产物ATP荧光探针I；R5’为氨基、乙二胺基、哌嗪基中的一种；
合成路线如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE009
。
4.根据权利要求3所述的比率型ATP荧光探针的合成方法，其特征在于，所述的活化试剂为HATU，DCC，NHS中的一种，罗丹明6G与活化试剂的摩尔比为1:(1.5~3)，罗丹明6G与乙腈的摩尔体积比为1:(15~25)mol/mL，罗丹明6G与碱性添加剂的摩尔比为1:(4~6)，罗丹明6G与中间体e的摩尔比为1:(1.5~2)；所述的碱性添加剂为二乙胺、三乙胺中的一种；搅拌反应时间为0.5~1h，继续搅拌反应时间6~8h。
5.根据权利要求3或4所述的比率型ATP荧光探针的合成方法，其特征在于，中间体e的合成方法，包括以下步骤：
将中间体c溶解在乙腈中，向溶液中加入活化试剂，然后将反应混合物在室温搅拌；然后将化合物d和碱加入到反应混合物中，并在室温下继续搅拌反应；反应完成后将混合物干燥并通过硅胶柱色谱纯化，得到中间产物e；
合成路线如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE011
。
6.根据权利要求5所述的比率型ATP荧光探针的合成方法，其特征在于，所述的中间体c与化合物d的摩尔比为1:(4~8)；活化试剂为HATU，DCC，NHS中的一种或两种，中间体c与活化试剂的摩尔比为1:(1.5~3)；中间体c与乙腈的摩尔体积比为1:(15~25)mol/mL；碱性添加剂为二乙胺、三乙胺中的一种，中间体c与碱的摩尔比为1:(4~6)；搅拌反应时间为0.5~1h，继续搅拌反应时间6~8h。
7.根据权利要求6所述的比率型ATP荧光探针的合成方法，其特征在于，所述的中间体c的合成方法，包括以下步骤：
将化合物a和化合物b加入到甲磺酸中，在设定温度下进行反应，反应完毕后冷却，将反应液倒入冰水中，加入无机酸后搅拌；滤出所得沉淀物，并用大量水洗涤，产物干燥后，通过硅胶柱色谱法纯化，得到黑色产物中间体c；
合成路线如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE013
。
8.根据权利要求7所述的比率型ATP荧光探针的合成方法，其特征在于，所述的化合物a与化合物b的摩尔比为1:(1~3)；化合物a与甲基磺酸的摩尔体积比为1:(1~5)mol/L；设定温度为70~90℃，反应时间为3~5h。
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