CN115677573B - 一种基于荧光指示剂置换法gtp识别三足阴离子受体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于荧光指示剂置换法GTP识别三足阴离子受体及其制备方法和应用。该三足阴离子受体含有猝灭基团和阴离子作用位点氨氢和吡啶盐正离子。受体分子与一些阴离子荧光指示剂在水溶液中能自组装成纳米组装体，同时使指示剂荧光猝灭。在该体系中加入GTP，通过置换竞争关系使荧光指示剂从组装体中释放出来，同时使荧光恢复。该系对GTP荧光识别的检测限达到9.49nM。
Description
技术领域
本发明涉及荧光检测技术领域，特别涉及一种基于荧光指示剂置换法GTP识别三足阴离子受体及其制备方法和应用。
背景技术
核苷三磷酸在生物系统中起着重要的作用，因为它们参与了几乎所有的生理过程，如细胞增殖、代谢、凋亡、基因表达、抗原调节等。鸟苷-5‘-三磷酸(GTP)是核苷酸的重要家族成员，在RNA合成和蛋白质合成的能量来源中起着重要作用。GTP浓度的异常变化与某些病理状态密切相关，如肝炎、胆囊炎等疾病。因此，监测生物系统中的GTP水平至关重要。
鉴于荧光技术的优点，如简单、灵敏度和实时检测，具有分析诱导荧光响应的传感器已被优先识别ATP和其他重要的核苷聚磷酸盐。与众多的ATP传感器相比，对GTP检测的研究相对稀少，特别是在生理pH条件下的水溶液中。目前传统的传感器主要是基于指标-间隔-受体(ISR)方法需要将受体与荧光染料共价连接起来，合成比较繁琐，耗费人力物力，成本较高。指示剂置换(IDA)方法由于其受体合成简单、灵敏度高、成本低廉而受到广泛关注，但在GTP传感方面的研究较少，因此，仍需要开发性能优异的荧光传感器来检测水介质中的GTP。
发明内容
针对现有技术中的不足与难题，本发明的目的在于提供一种基于荧光指示剂置换法GTP识别三足阴离子受体及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
本发明提供了一种基于荧光指示剂置换法GTP识别三足阴离子受体，具有式1所示结构：
本发明还提供了上述基于荧光指示剂置换法GTP识别三足阴离子受体的制备方法，包括以下步骤：
将3-氨基吡啶和十四酸与有机溶剂、脱水剂、催化剂I混合，进行酰胺化反应，得到具有式a所示结构的化合物；
将所述具有式a所示结构的化合物与1,3,5-三(溴甲基)-2,4,6-三乙苯，极性有机溶剂、催化剂II混合，进行成盐反应，得到识别GTP的三足阴离子受体。
优选的，所述3-氨基吡啶和十四酸的摩尔比为1:1～1.5。
优选的，所述酰胺化反应的温度为20～30℃，时间为18～20h。
优选的，所述脱水剂为DCC，所述催化剂I为DMAP。
优选的，所述1,3,5-三(溴甲基)-2,4,6-三乙苯与具有式a所示结构的化合物的摩尔比为1:3～3.5。
优选的，所述成盐反应的催化剂II为KI。
优选的，所述成盐反应的温度为82℃，时间为24～26h。
本发明还提供了一种识别GTP三足阴离子受体荧光置换组装体，是上述的三足阴离子受体与荧光指示剂在水溶液中自组装成纳米组装体，纳米组装体不发光。
优选的，所述荧光指示剂包括荧光素钠(UD)、署红(EY)、溶剂绿7(HPTS)、玫瑰红和4,4',4”,4”'-(卟啉-5,10,15,20-四基)四苯磺酸中的一种或几种。
本发明还提供了上述三足阴离子受体在GTP检测中的应用。
本发明还提供了一种GTP的检测方法，包括以下步骤：
首先用三足阴离子受体对荧光指示剂进行荧光滴定，获得受体的饱和当量。
对待测样品与三足阴离子受体/荧光指示剂的混合液进行紫外吸收光谱测试，获得待测样品在490nm处的紫外吸收强度，根据所述紫外吸收强度和预定的第一标准曲线获得待测样品中GTP的浓度；所述第一标准曲线为GTP、三足阴离子受体/荧光指示剂的摩尔比与紫外吸收强度的线性关系曲线；
或者，在激发波长为490nm激光照射下，对待测样品与三足阴离子受体/荧光指示剂的混合液进行荧光发射光谱测试，获得待测样品在518nm处的荧光强度，根据所述荧光强度和预定的第二标准曲线获得待测样品中GTP的浓度；所述第二标准曲线为GTP、三足阴离子受体/荧光指示剂的摩尔比与荧光强度的线性关系曲线。
优选的，所述紫外吸收光谱测试和荧光发射光谱测试中，所述待测样品中GTP的线性检测范围独立为0～8μM。
与现有技术相比，本发明有益效果是：
本发明提供了一种基于荧光指示剂置换法GTP识别三足阴离子受体，具有式1所示结构。本发明所述三足阴离子受体的结构中含有吡啶盐、氨氢和疏水烷基链，其中吡啶盐能有效猝灭荧光指示剂(UD)的荧光，当加入GTP时，可以有效的置换出来指示剂，荧光恢复。在本发明中，GTP中的磷酸基团和三足阴离子受体中的吡啶盐和氨氢之间的静电引力、氢键作用、π-π作用比受体与指示剂之间的作用力更强，从而有效置换出荧光指示剂，发出强烈荧光，从而实现GTP的荧光响应。本发明提供的三足阴离子受体对GTP具有很强的灵敏性识别，可以对GTP进行有效的定性定量检测，且不受其他分析物诸如ADP，PPi，UTP，CTP，Cl-，Pi，Br-，SO4 2-，CO3 2-，AMP，F-，I-等离子的影响，具有优秀的选择性。实施例结果表明，本发明提供的三足阴离子受体对GTP的检测限为9.49×10-9mol，具有很强的应用价值。
本发明提供了上述基于荧光指示剂置换法GTP识别三足阴离子受体的制备方法，此法含有酰胺化反应和成盐反应两步反应，合成方法简单，原料成本低廉，且具有优异的选择性，有广泛的应用价值。
附图说明
图1为三足阴离子受体的合成路线；
图2为三足阴离子受体的核磁氢谱；
图3为受体对UD的荧光滴定；
图4为受体/UD对GTP的紫外荧光滴定曲线；
图5为受体/UD对GTP的选择性；
图6为受体/UD对GTP的检测限。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明提供了一种基于荧光指示剂置换法GTP识别三足阴离子受体，具有式1所示结构：
本发明所述三足阴离子受体的结构中含有吡啶盐、氨氢和疏水烷基链，其中吡啶盐能有效猝灭荧光指示剂(UD)的荧光，当加入GTP时，可以有效的置换出来指示剂，荧光恢复。在本发明中，GTP中的磷酸基团和三足阴离子受体中的吡啶盐和氨氢之间的静电引力、氢键作用、Л-Л作用比受体与指示剂之间的作用力更强，从而有效置换出荧光指示剂，发出强烈荧光，从而实现GTP的荧光响应。本发明提供的三足阴离子受体对GTP具有很强的灵敏性识别，可以对GTP进行有效的定性定量检测，且不受其他分析物诸如ADP，PPi，UTP，CTP，Cl-，Pi，Br-，SO4 2-，CO3 2-，AMP，F-，I-等离子的影响，具有优秀的选择性。
本发明还提供了上述基于荧光指示剂置换法GTP识别三足阴离子受体的制备方法，包括以下步骤：
将3-氨基吡啶和十四酸与有机溶剂、脱水剂、催化剂I混合，进行酰胺化反应，得到具有式a所示结构的化合物；
将所述具有式a所示结构的化合物与1,3,5-三(溴甲基)-2,4,6-三乙苯，极性有机溶剂、催化剂II混合，进行成盐反应，得到识别GTP的三足阴离子受体。
本发明中将3-氨基吡啶和十四酸与有机溶剂、脱水剂、催化剂I混合，进行酰胺化反应，得到具有式a所示结构的化合物。
在本发明中所述有机溶剂优选为二氯甲烷、甲醇、乙腈、四氢呋喃、二甲亚砜中的一种或几种，进一步优选为二氯甲烷。在本发明中，所述3-氨基吡啶和十四酸的摩尔比优选为1:1～2.5，更优选为1:1.2～1.5，进一步优选为1:1.5。
在本发明中，所述脱水剂优选为DCC(二环己基碳二亚胺)，所述催化剂I优选为DMAP(4-二甲氨基吡啶)。
在本发明中，所述3-氨基吡啶与DCC的摩尔比优选为1:1.2～1.5，更优选为1:1.2；所述3-氨基吡啶与DMAP的摩尔比优选为1:1.5～2，更优选为1:1.5。
在本发明中，所述酰胺化反应优选在室温条件下进行。在本发明中，所述酰胺化反应的温度优选为25℃，时间优选为18～20h，更优选为20h。本发明优选通过薄层色谱分析对酰胺化反应进行监测，直至原料基本反应完全。
在本发明中，所述酰胺化反应后，本发明优选对酰胺化反应液进行后处理，后处理优选包括以下步骤：
对酰胺化反应液依次进行洗涤、浓缩和提纯，得到具有式a所示结构的化合物纯品。在本发明中，洗涤优选为盐酸洗涤，洗涤的次数优选为3～4次。在本发明中，浓缩的方式优选为旋蒸。在本发明中，柱层析分离的固定相优选为硅胶，洗脱液优选为CH2Cl2和CH3OH，所述CH2Cl2和CH3OH的体积比优选为15:1。
得到所述具有式a所示结构的化合物后，本发明将所述具有式a所示结构的化合物与1,3,5-三(溴甲基)-2,4,6-三乙苯、极性有机溶剂、催化剂II混合，进行成盐反应，得到三足阴离子受体。
在本发明中所述极性有机溶剂优选为甲醇、甲苯、乙腈、四氢呋喃、二甲亚砜中的一种或几种，所述催化剂II优选为碘化钾。
在本发明中，所述1,3,5-三(溴甲基)-2,4,6-三乙苯与具有式a所示结构的化合物的摩尔比为1:3～3.5，更优选为1:3.5。
在本发明中，所述成盐反应的温度优选为80～90℃，进一步优选为82℃；所述成盐反应的时间优选为24～30h，更优选为24～26h。
在本发明中，所述成盐反应后，本发明优选对成盐反应液进行后处理，后处理优选包括以下步骤：
对成盐反应液依次进行过滤、洗涤和干燥，得到目标化合物三足阴离子受体纯品。在本发明中，洗涤优选为二氯甲烷洗涤，洗涤的次数优选为2～3次。本发明对干燥的方式没有特殊的要求，采用本领域熟知的干燥方式使固体恒重即可，具体的如烘干。
在本发明中，三足阴离子受体的合成路线如图1所示。三足阴离子受体的核磁氢谱如图2所示。
本发明还提供了上述三足阴离子受体在GTP检测中的应用。
在本发明中所述三足阴离子受体对GTP有响应，三足阴离子受体有效的猝灭了指示剂UD的荧光，加入GTP后，荧光显著恢复，且不受其他阴离子干扰。
本发明还提供了一种GTP的检测方法，包括以下步骤：
首先用三足阴离子受体对荧光指示剂进行荧光滴定，获得受体的饱和当量。
对待测样品与三足阴离子受体/荧光指示剂的混合液进行紫外吸收光谱测试，获得待测样品在490nm处的紫外吸收强度，根据所述紫外吸收强度和预定的第一标准曲线获得待测样品中GTP的浓度；所述第一标准曲线为GTP、三足阴离子受体/荧光指示剂的摩尔比与紫外吸收强度的线性关系曲线。
或者，在激发波长为490nm激光照射下，对待测样品与三足阴离子受体/荧光指示剂的混合液进行荧光发射光谱测试，获得待测样品在518nm处的荧光强度，根据所述荧光强度和预定的第二标准曲线获得待测样品中GTP的浓度；所述第二标准曲线为GTP、三足阴离子受体/荧光指示剂的摩尔比与荧光强度的线性关系曲线。
在本发明中，无特殊说明，测试均在HEPES缓冲溶液(10mM pH＝7.2)中进行。荧光指示剂UD的浓度为6μM。
在本发明中，三足阴离子受体对荧光指示剂进行荧光滴定，获得受体的饱和当量。优选包括以下步骤：
用二甲亚砜配制三足阴离子受体母液摩尔浓度2×10-4mol/L的溶液，将其分为20组，每组溶液的体积为2mL，各组的三足阴离子受体与指示剂摩尔浓度的比例为0:1、0.1:1、0.2:1、0.3:1、0.4:1、0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1、0.9:1、1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1；
对每组溶液进行荧光光谱测试，获得每组溶液在518nm处的发射强度，以三足阴离子受体的摩尔比为横坐标，以荧光发射强度为纵坐标，绘制滴定曲线。
受体对UD的荧光滴定如图3所示。
在本发明中，对待测样品与三足阴离子受体/荧光指示剂的混合液进行紫外吸收光谱测试，获得待测样品在490nm处的紫外吸收强度，根据所述紫外吸收强度和预定的第一标准曲线获得待测样品中GTP的浓度；在本发明中，所述第一标准曲线的绘制方法，优选包括以下步骤：
用纯水配制GTP摩尔浓度4×10-4mol/L的溶液，将其分为18组，每组溶液的体积为2mL，各组的GTP与受体(9μM)/指示剂(6μM)摩尔浓度的比例为0:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、13:1、16:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1；
对每组溶液进行紫外吸收光谱测试，获得每组溶液在490nm处的吸收强度，以GTP的摩尔比为横坐标，以吸收强度为纵坐标，绘制第一标准曲线。
在本发明中，在所述紫外光谱测试中，所述待测样品中GTP的线性检测范围优选为0～8μM。
或者，在激发波长为490nm激光照射下，对待测样品与三足阴离子受体/荧光指示剂的混合液进行荧光发射光谱测试，获得待测样品在518nm处的荧光强度，根据所述荧光强度和预定的第二标准曲线获得待测样品中GTP的浓度；在本发明中，所述第二标准曲线的绘制方法，优选包括以下步骤：
用纯水配制GTP摩尔浓度4×10-4mol/L的溶液，将其分为18组，每组溶液的体积为2mL，各组的GTP与受体(9μM)/指示剂(6μM)摩尔浓度的比例为0:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、13:1、16:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1；
对每组溶液进行荧光光谱测试，获得每组溶液在518nm处的发射强度，以GTP的摩尔比为横坐标，以发射强度为纵坐标，绘制第二标准曲线。
在本发明中，在所述荧光光谱测试中，所述待测样品中GTP的线性检测范围优选为0～8μM。
下面结合实施例对本发明提供的基于荧光指示剂置换法识别GTP的三足阴离子受体及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1三足阴离子受体(Ph-3Py)的合成
(1)先称取0.342g的十四酸(2mmol)和0.247g的DCC(1.2mmol)溶解在二氯甲烷中，室温搅拌30分钟，然后加入0.094g的3-氨基吡啶(1mmol)和0.183g的DMAP(1.5mmol)，室温反应20小时，通过薄层色谱分析对酰胺化反应进行监测，直至原料基本反应完全。用盐酸洗涤2-3次后，通过旋蒸浓缩。柱层析分离，洗脱液CH2Cl2和CH3OH的体积比为15:1，得到白色固体，记为化合物a，0.264g，87％。
(2)化合物Ph-3Py的合成：将化合物a(0.106g，0.35mmol)和1,3,5-三(溴甲基)-2,4,6-三乙苯(0.54g，1.23mmol)溶解在乙腈中，随后加入0.010g的碘化钾，反应液在82℃下回流24小时，结束后过滤，用二氯甲烷洗涤2-3次，烘干得到黄棕色固体(0.99g，89％产率)。
实施例2三足阴离子受体(Ph-3Py)/UD对GTP的响应
在HEPES缓冲溶液中(10mM pH＝7.2)测定了三足阴离子受体(Ph-3Py)/UD加入GTP后的荧光发射光谱和紫外吸收光谱去研究其对GTP的响应。具体步骤如下：
用纯水配制GTP摩尔浓度4×10-4mol/L的溶液，将其分为18组，每组溶液的体积为2mL，各组的GTP与受体(9μM)/指示剂(6μM)摩尔浓度的比例为0:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、13:1、16:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1，测试了其紫外吸收光谱和在激发波长为490nm激光照射下的处荧光发射光谱。
其紫外吸收和荧光发射图谱如图4所示。
由图4(a)所示，受体(9μM)/指示剂(6μM)在518nm的荧光强度为0，在逐渐加入GTP后，在518nm的发射强度逐渐增强，在GTP含量达到0.15mM时达到饱和。由图4(b)所示，在逐渐滴加GTP后，490nm的吸光度逐渐下降，同时在515nm处形成一个新的吸收峰，并随着GTP的加入，在515nm处的吸光度逐渐增加，在GTP含量达到0.15mM时达到饱和。
在荧光发射光谱测试中，受体(9μM)/指示剂(6μM)和0～0.15mmol的GTP与荧光强度的线性关系曲线如图6所示。
由图6可以看出，荧光强度与GTP含量有较好的线性关系，其线性方程为Y＝1.58×108X+7.23，R2＝0.9944；根据3σ/K规则，计算GTP的检测限为9.49nM(σ＝0.50，K＝1.58×108)。
实施例3三足阴离子受体(Ph-3Py)/UD对GTP的选择性测试
在含有受体(9μM)/指示剂(6μM)的溶液中分别加入4×10-4mol/L的干扰离子，所得结果如图5所示，测试了受体(9μM)/指示剂(6μM)对GTP，ADP，PPi，UTP，CTP，Cl-，Pi，Br-，SO4 2-，CO3 2-，AMP，F-，I-的荧光响应，结果发现加入GTP后荧光强度比ATP的高2.5倍左右，而其他分析物没有太大的变化，说明三足阴离子受体(Ph-3Py)对GTP具有极其优秀的选择性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种基于荧光指示剂置换法GTP识别三足阴离子受体，其特征在于，具有式1所示结构：
式1。
2.权利要求1所述的基于荧光指示剂置换法GTP识别三足阴离子受体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将3-氨基吡啶和十四酸与有机溶剂、脱水剂、催化剂I混合，进行酰胺化反应，得到具有式a所示结构的化合物；
式a；
将所述具有式a所示结构的化合物与1,3,5-三(溴甲基)-2,4,6-三乙苯，极性有机溶剂、催化剂II混合，进行成盐反应，得到识别GTP的三足阴离子受体；
所述3-氨基吡啶和十四酸的摩尔比为1:1~2.5；所述脱水剂为DCC，所述催化剂I为DMAP；所述酰胺化反应的温度为20~35 ℃，时间为18~24 h；
所述成盐反应的催化剂II为KI，所述成盐反应的温度为80~90 ℃，时间为24~30 h。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述1,3,5-三(溴甲基)-2,4,6-三乙苯与具有式a所示结构的化合物的摩尔比为1:3~4。
4.一种识别GTP三足阴离子受体荧光置换组装体，其特征在于，所述组装体是权利要求1所述的三足阴离子受体与荧光指示剂在水溶液中自组装成纳米组装体，所述荧光指示剂为荧光素钠。
5.权利要求1所述基于荧光指示剂置换法GTP识别三足阴离子受体或权利要求2~3任意一项所述制备方法制备得到的三足阴离子受体在非疾病诊断或治疗目的的GTP检测中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，GTP检测包括以下步骤：
对待测样品与三足阴离子受体/荧光指示剂的混合液进行紫外吸收光谱测试，获得待测样品在490 nm处的紫外吸收强度，根据所述紫外吸收强度和预定的第一标准曲线获得待测样品中GTP的浓度；所述第一标准曲线为GTP、三足阴离子受体/荧光指示剂的摩尔比与紫外吸收强度的线性关系曲线；
或者，在激发波长为490 nm激光照射下，对待测样品与三足阴离子受体/荧光指示剂的混合液进行荧光发射光谱测试，获得待测样品在518 nm处的荧光强度，根据所述荧光强度和预定的第二标准曲线获得待测样品中GTP的浓度；所述第二标准曲线为GTP、三足阴离子受体/荧光指示剂的摩尔比与荧光强度的线性关系曲线。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述紫外吸收光谱测试和荧光发射光谱测试中，所述待测样品中GTP的线性检测范围独立为0~8 μM。
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| "Self-assemble nanostructured ensembles for detection of guanosine triphosphate based on receptor structure modulated sensitivity and selectivity";Qian-Yong Cao et al;《Sensors and Actuators: B. Chemical》;20220521;第1-8页 * |
| 指示剂置换法识别阴离子的研究进展;汤立军;李叶;刘明辉;李芳芳;;化学通报;20100718(07);第600-607页 * |
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