CN115634289A - 一种防治禽病的IgY和溶菌酶复合制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及兽药技术领域，特别是涉及一种防治禽病的IgY和溶菌酶复合制剂及其制备方法。所述复合制剂包括卵黄中和抗体IgY和溶菌酶；以每g复合制剂计，所述卵黄中和抗体IgY的质量为400～600mg，所述溶菌酶的酶活为400000～600000U。本发明通过适宜含量的卵黄中和抗体IgY和溶菌酶复配，不仅可以预防禽病，而且在发病时可以治疗禽病；同时本发明提供的复合制剂没有耐药性，没有副作用，作用方式安全、不会产生免疫排斥反应，一般可保证肉鸡、肉鸭、肉鹅整个养殖周期不生病，是一种安全、有效、方便防治禽流感、新城疫、法氏囊病和腺病毒病的新途径。

Description

一种防治禽病的IgY和溶菌酶复合制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及兽药技术领域，特别是涉及一种防治禽病的IgY和溶菌酶复合制剂及其制备方法。

背景技术

新城疫病毒、禽流感病毒、法氏囊病毒和腺病毒是禽类的主要病毒。禽类感染病毒后病死率很高。目前禽类病毒感染的防治主要以预防为主，接种疫苗是预防禽类病毒感染的重要措施，它可以提高禽类的特异免疫力，减少病毒传播，降低病毒感染造成的损失。

但是，肉鸡、肉鸭、肉鹅等养殖周期很短，一般42天就上市了，一般接种疫苗一个月后才能产生足够的抗体，所以给肉鸡、肉鸭、肉鹅打疫苗既来不及也不经济，因而肉鸡、肉鸭、肉鹅一般是不打疫苗的，肉鸡、肉鸭、肉鹅这段免疫空白期没有保护力，特别容易感染病毒，且感染病毒后还会引起继发细菌性感染。

因此，亟需一种安全、有效、方便防治禽流感、新城疫、法氏囊病和腺病毒病的新途径。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种防治禽病的IgY和溶菌酶复合制剂及其制备方法。本发明提供的复合制剂没有耐药性，没有副作用，作用方式安全、不会产生免疫排斥反应，一般可保证肉鸡、肉鸭、肉鹅整个养殖周期不生病，是一种安全、有效、方便防治禽流感、新城疫、法氏囊病和腺病毒病的新途径。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种防治禽病的复合制剂，所述复合制剂包括卵黄中和抗体IgY和溶菌酶；以每g复合制剂计，所述卵黄中和抗体IgY的质量为400～600mg，所述溶菌酶的酶活为400000～600000U。

优选的，制备所述卵黄中和抗体IgY的抗原包括禽流感病毒、新城疫病毒、法氏囊病病毒和腺病毒制备的类病毒颗粒及灭活病毒疫苗。

优选的，所述禽流感病毒包括H9亚型H9N2、H5亚型Re-13株、H5亚型Re-14株和H7-Re4株；

所述新城疫病毒包括新城疫病毒A-VII株；

所述法氏囊病病毒包括法氏囊病病毒超强毒流行株Vp2；

所述腺病毒包括I群4型腺病毒。

优选的，所述卵黄中和抗体IgY的重链的分子量为67～70KD，轻链的分子量为22～30KD。

本发明还提供了上述复合制剂的制备方法，包括以下步骤：

利用抗原免疫产蛋母鸡，得到含有卵黄中和抗体IgY的蛋黄；

将所述蛋黄稀释后调节pH值至5.1～6.0，离心，得到上清液；

将所述上清液冻干，得到所述卵黄中和抗体IgY；

将所述卵黄中和抗体IgY和溶菌酶混合，得到所述复合制剂。

优选的，所述离心的转速为8000～12000rpm，离心的时间为20～30min。

优选的，所述离心前还包括：将调节pH值后的蛋黄稀释液在2～8℃下静置4～5h。

优选的，所述免疫的次数为≥3次，每次间隔的时间为7～42d。

优选的，所述抗原免疫产蛋母鸡前还包括将抗原和免疫佐剂混合；所述免疫佐剂包括ISA71佐剂。

优选的，所述冻干前还包括：将上清液超滤浓缩；所述超滤浓缩所使用的超滤膜包括5万分子截留量的超滤膜。

有益效果：

本发明提供了一种防治禽病的复合制剂，所述复合制剂包括卵黄中和抗体IgY和溶菌酶；以每g复合制剂计，所述卵黄中和抗体IgY的质量为400～600mg，所述溶菌酶的酶活为400000～600000U。本发明通过适宜含量的卵黄中和抗体IgY和溶菌酶复配，不仅可以预防禽病，而且在发病时可以治疗禽病；同时本发明提供的复合制剂没有耐药性，没有副作用，作用方式安全、不会产生免疫排斥反应，一般可保证肉鸡、肉鸭、肉鹅整个养殖周期不生病，是一种安全、有效、方便防治禽流感、新城疫、法氏囊病和腺病毒病的新途径。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例1中的禽流感病毒、新城疫病毒、法氏囊病毒和腺病毒病毒IgY抗体电泳图；

图2为本发明所述复合制剂的成品图。

具体实施方式

本发明提供了一种防治禽病的复合制剂，所述复合制剂包括卵黄中和抗体IgY和溶菌酶。

以每g复合制剂计，本发明所述复合制剂中卵黄中和抗体IgY的质量为400～600mg，优选为450～500mg，更优选为500mg；所述溶菌酶的酶活为400000～600000U，优选为450000～500000U，更优选为500000U。本发明所述溶菌酶优选购自浙江艾格生物科技股份有限公司，货号为20200318/A。

鸡病情严重程度及进展程度不同，对IgY和溶菌酶的需求含量不同，因此配制复合制剂时，必须考虑轻症鸡能用，重症的鸡也能治好。二者的含量太小，轻症鸡能治好，重症鸡因药剂量不够则治不好，但是也不能添加太多，一方面二者添加太多有副作用，二是提高了制剂的成本，增加了养殖户用药的负担。另外，IgY比列高，溶菌酶比列低，抗病毒能力上去了，杀菌能力下来了；IgY比列低，溶菌酶比列高，抗病毒能力下来了，杀菌能力上去了，本发明通过适宜比例的IgY和溶菌酶复配，不仅可以预防禽病，而且在发病时可以治疗禽病，对轻症家禽和重症家禽都都良好的治疗效果，同时具有良好的抗病毒能力和杀菌能力。

病毒感染后会引起继发感染，而继发感染一般是细菌感染，感染初期，细菌量少，溶菌酶更容易杀灭细菌，但如细菌感染进展较大，细菌量太大，溶菌酶杀灭不了，失去了最佳的杀菌机会。本发明提供的复合制剂，IgY可以阻断病毒的感染，在细菌刚刚露头时，复合制剂中的溶菌酶可立即发挥杀菌作用，把细菌感染扑灭在萌芽中，可以减少溶菌酶的使用。如果两者单独成分混合给药，一方面会造成机体中局部两者药物的浓度和比列达不到最佳比列，达不到最佳效果，另一方面生产成本会上升，运输成本会加大，也增加了使用时的劳动力，增加了养鸡场的人工成本。本发明提供的IgY和溶菌酶制备成复合制剂使用比两者单独添加效益更好。

在本发明中，制备所述卵黄中和抗体IgY的抗原优选包括禽流感病毒、新城疫病毒、法氏囊病病毒和腺病毒制备的类病毒颗粒疫苗；所述禽流感病毒优选包括H9亚型H9N2、H5亚型Re-13株、H5亚型Re-14株和H7-Re4株；所述新城疫病毒优选包括新城疫病毒A-VII株；所述法氏囊病病毒优选包括法氏囊病病毒超强毒流行株Vp2；所述腺病毒优选包括I群4型腺病毒。

在本发明中，所述抗原的制备方法优选包括：在GenBank上查找禽流感、新城疫病毒、法氏囊病病毒和腺病毒上述毒株序列，通过序列比对，找出中和表位的保守序列，委托上海杰威生物医药有限公司设计类病毒颗粒(VLP)，并采用酵母表达系统表达。本发明提供的类病毒颗粒疫苗作为抗原，诱导出来的是具有立体表位的中和抗体，抗原免疫性强，效价高。

利用上述抗原制备得到的IgY，在功能上等价于哺乳动物血液中抗体IgG，无IgG的Fc片段，安全，且无血浆中可能残留的病原体，可以特异性免疫禽流感病毒、新城疫病毒、法氏囊病毒和腺病毒，主动抵御病原侵入，快速有效中和病毒，且免疫得到的IgY结构稳定，能抵抗胃蛋白酶和胰蛋白酶消化，抗原结合部位Fab不被破坏，更易吸收，同时还可以增强机体非特异性免疫力，防治病毒感染引起的病毒性呼吸道病、心包积液-肝炎综合征法氏囊病等疾病。

本发明提供的复合制剂使用后6小时即能被机体吸收进入血液，能够快速发挥疗效，中和病毒，缓解症状，恢复健康。

在本发明中，所述卵黄中和抗体IgY的重链的分子量为67～70KD，轻链的分子量优22～30KD。

本发明提供的复合制剂含有高浓度特异性lgY免疫球蛋白分子，通过与病毒结合阻断病毒侵入宿主细胞；增强机体免疫力，促进辅助性T细胞、杀伤性T细胞、自然杀伤(NK)细胞活性，提高机体抗病能力，改善家禽生产性能。溶菌酶又称胞壁质酶，能水解细菌细胞壁中粘多糖的β1-4糖苷键，对革兰氏阳性细菌具有直接的溶解作用，在分泌型免疫球蛋白A和补体的参与下，对革兰氏阴性细菌具有间接的溶解作用，且没有耐药性。溶菌酶还能与带负电荷的病毒蛋白直接作用，并能与DNA、RNA和脱辅基蛋白形成复盐而使病毒失活。

本发明提供的复合制剂平时可以加在水中给禽类饮水以预防毒性呼吸道病、心包积液-肝炎综合征法氏囊病等疾病，疾病发生时又可给禽类紧急注射以治疗毒性呼吸道病、心包积液-肝炎综合征法氏囊病等疾病，非常方便。预防时可在鸡龄两周和四周左右各使用一次，可有效预防病毒感染，避免后期细菌继发感染。开创一种简便、安全、有效、卫生、经济的治疗禽流感病毒、新城疫病毒、法氏囊病毒和腺病毒病方式。

本发明还提供了上述复合制剂的制备方法，包括以下步骤：

利用抗原免疫产蛋母鸡，得到含有卵黄中和抗体IgY的蛋黄；

将所述蛋黄稀释后调节pH值至5.1～6.0，离心，得到上清液；

将所述上清液冻干，得到所述卵黄中和抗体IgY；

将所述卵黄中和抗体IgY和溶菌酶混合，得到所述复合制剂。

本发明利用抗原免疫产蛋母鸡，得到含有卵黄中和抗体IgY的蛋黄。

本发明所述抗原免疫产蛋母鸡前优选还包括将抗原和免疫佐剂混合；所述免疫佐剂优选包括ISA71佐剂；所述抗原和佐剂的体积比优选为3：7。本发明所述ISA71佐剂优选购自SEPPIC公司。本发明用蛋鸡制备抗体可大规模生产，成本很低，且IgY没有耐药性，没有副作用，作用方式安全、不会产生免疫排斥反应。

在本发明中，所述免疫的次数优选为≥3次，更优选为3次；每次免疫间隔的时间优选为7～42d，进一步优选为20～35d，更优选为28d。

在本发明中，优选每只母鸡免疫一种抗原，免疫结束后，优选将不同抗原免疫母鸡所产鸡蛋中的蛋黄混合，得到所述含有卵黄中和抗体IgY的蛋黄。本发明通过单独免疫，相比于多种抗原免疫获得的IgY效价更高。

在本发明中，以每只产蛋母鸡计，所述抗原每次免疫用量分别优选为：禽流感病毒H9亚型H9N210⁸个灭活病毒，H5亚型Re-13株、H5亚型Re-14株和H7-Re4株表达VLP均为20μg；新城疫病毒A-VII株10⁸个灭活病毒，法氏囊病毒超强毒流行株Vp2、腺病毒I群4型表达VLP均为50μg。

本发明通过适宜量的抗原对产蛋母鸡进行免疫，获得的抗体效价较高，IgY中和抗原的能力强，又能避免免疫抑制现象的产生。

得到含有卵黄中和抗体IgY的蛋黄后，本发明将所述蛋黄稀释，得到蛋黄稀释液。在本发明中，所述稀释时所用的溶剂包括蒸馏水；所述蒸馏水和所述蛋黄的体积比为9：1。

得到蛋黄稀释液后，本发明调节所述蛋黄稀释液pH值，离心，得到上清液。

在本发明中，所述pH值为5.1～6.0，优选为5.2～5.5，更优选为5.2。

调节pH值后本发明优选将蛋黄稀释液在2～8℃下静置4～5h，更优选为在4℃下静置5h。

在本发明中，所述离心的转速优选为8000～12000rpm，更优选为8000rpm；离心的时间优选为20～30min，更优选为20min。

得到上清液后，本发明优选将上清液超滤浓缩，得到浓缩IgY。在本发明中，所述超滤浓缩所使用的超滤膜包括5万分子截留量的超滤膜。

本发明选择合适的制备条件，获得的卵黄抗体IgY浓度在每羽份3mg和溶菌酶25000活力单位，能够完全消除禽流感病毒、新城疫病毒、法氏囊病毒和腺病毒流行株感染引起的病毒性呼吸道病、心包积液-肝炎综合征法氏囊病等疾病。

得到浓缩IgY后，本发明将所述上清液冻干，得到所述卵黄中和抗体IgY。

得到所述卵黄中和抗体IgY后，本发明将所述卵黄中和抗体IgY和溶菌酶混合，得到所述复合制剂。

本发明的防治禽流感病毒、新城疫病毒、法氏囊病毒和腺病毒病卵黄中和抗体IgY从抗原蛋白表达到免疫鸡生产抗体只需2个多月时间，可以快速制备突变禽流感病毒、新城疫病毒、法氏囊病毒和腺病毒卵黄抗体；同时，容易大规模生产满足养禽业预防和治疗新发流行株疾病的需求，由于IgY抗体是禽源性抗体，禽类口服和外用时不具免疫原性，不会产生免疫排斥反应。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种防治禽病的IgY和溶菌酶复合制剂及其制备方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

准备例

在GenBank上查找禽流感病毒H9亚型，H9N2；H5亚型，Re-13株；H5亚型，Re-14株；H7-Re4株；新城疫病毒A-VII株；法氏囊病毒超强毒流行株Vp2和腺病毒I群4型毒株的序列如下所示：

H5N6 H5-Re13株H5亚型2.3.4.4h分支，Accession：MW110072.1；

H5N8 H5-Re142.3.4.4b分支，ACCESSION：OM373310.1；

H7N9 H7-Re4株，ACCESSION：MN700030.1；

禽流感H9N2 H9 A/Chicken/Guangdong/SS/94(H9N2)，ACCESSION：AF384557.1；

传染性法氏囊病超强毒vvIBDV Gx VP2(Infectious bursal disease virusstrain GX VP2 gene)，ACCESSION：AY321954.1；

新城疫病毒ZJ1 A-VIId(Newcastle Disease virus strain ZJ1 VIId)，ACCESSION：AF431744.3；

禽腺病毒I群4型Fowl aviadenovirus C isolate SD1511，ACCESSION：MF496037.1；

通过序列比对，找出相应毒株中能够设计VLP表达的特异抗原序列，设计VLP序列，表达的VLP为类病毒颗粒，是立体表位，是中和表位，能够诱导中和抗体。

本发明委托上海杰威生物医药有限公司设计类病毒颗粒(VLP)，并采用酵母表达系统表达，得到H9亚型，H9N2；H5亚型，Re-13株；H5亚型，Re-14株；H7-Re4株；新城疫病毒A-VII株；法氏囊病毒超强毒流行株Vp2和腺病毒I群4型毒株VLP抗原。

实施例1

防治禽流感病毒、新城疫病毒、法氏囊病毒和腺病毒病卵黄中和抗体IgY的制备

1.免疫

以禽流感病毒H9亚型，H9N2；H5亚型，Re-13株，H5亚型，Re-14株，H7-Re4株；新城疫病毒A-VII株；法氏囊病毒超强毒流行株Vp2和腺病毒I群4型抗原分别免疫产蛋母鸡，其中H5亚型，Re-13株，H5亚型，Re-14株，H7-Re4株的抗原按质量比为1:1:1混合为一种三价疫苗后免疫产蛋母鸡。以每次禽流感病毒H9亚型，H9N210⁸个灭活病毒，H5亚型，Re-13株；H5亚型，Re-14株；H7-Re4株各表达VLP20μg；新城疫病毒A-VII株10⁸个灭活病毒；法氏囊病毒超强毒流行株Vp2、腺病毒I群4型表达VLP50μg抗原，加入适合免疫鸡用的佐剂，抗原：佐剂ISA71的体积比为30：70，乳化，对产蛋母鸡进行肌肉注1ml，免疫3次，3点免疫，每次间隔时间为28天。

2.提取纯化IgY抗体

将禽流感病毒：H9亚型，H9N2；上述三价疫苗(H5亚型，Re-13株，H5亚型，Re-14株，H7-Re4株)；新城疫病毒AVII株；法氏囊病毒超强毒流行株Vp2和腺病毒I群4种鸡蛋按1:1:1:1：1个数比例混合，用蛋黄筛分离免疫母鸡产蛋的蛋黄，加入9体积倍数的蒸馏水搅拌混匀制备蛋黄液，用1MolHCl调pH5.2，4℃静置沉淀5小时，8000rpm离心20分钟，弃沉淀，收集上清，采用0.45μm混合纤维素酯膜进行真空抽滤(0.09MPa)，得抽滤液；选择5万分子截留量超滤膜，室温下进料，单段间歇操作模式对抽滤液进行超滤浓缩，得浓缩IgY，巴斯德消毒，0.22μm膜过滤除菌，冻干：采用了蔗糖2wt.％、甘氨酸3wt.％、Tween800.5wt.％和明胶0.2wt.％作为保护剂。

冻干工艺：a)预冻：先将装有IgY抗体溶液的容器瓶置于冻干机隔板上，设定温度5℃预冻，设定时间30min达到预设温度，维持1h，再降温至-60℃，设定时间10min达到预设温度，维持6h进行冷冻；

b)升华干燥：将隔板体系设定温度升温至-25℃，设定时间10h达到预设温度，维持25h，同时维持真空度0.2mBar，完成升华干燥；

c)再干燥：将隔板体系温度升温至30℃，设定时间100min达到预设温度，维持10h进行干燥，同时维持真空度0.2mBar，冻干结束。即为分离纯化的禽流感病毒、新城疫病毒、法氏囊病毒和腺病毒病卵黄中和抗体IgY冻干粉，含量为450～500mgIgY/g冻干粉，纯度45～50％。

3.SDS-PAGE电泳分析

对分离纯化的IgY进行SDS-PAGE电泳分析，样品制备：3％浓缩胶，8％分离胶，点样8μl，电压为80V，电泳60分钟，当指示剂到达分离胶前沿1～2cm停止电泳，考马斯亮蓝染色，脱色，拍照(如图1)。

由图1可见，所述卵黄中和抗体IgY的重链为67～70KD，轻链为22～30KD。

4.法氏囊和腺病毒IgY抗体效价分析

用琼脂双向免疫扩散实验(AGP)测定法氏囊和腺病毒IgY抗体的效价，分别各做一组：

打孔：制备1.5％缓冲琼脂板，在中间打一孔，孔径4mm，在该孔周围距离3mm处打6个孔径3mm的小孔。

稀释抗体：采用二倍稀释法对上述纯化后的新冠病毒卵黄中和抗体IgY样品进行2⁰、2^-1、2^-2、2^-3、2^-4、2^-5、2^-6、2^-7、2^-8连续稀释。

加样：中心孔分别加入法氏囊和腺病毒抗原，以不溢出孔为准，周围小孔加入纯化的IgY，按IgY的稀释倍数由小到大加入，加样后置于带盖饭盒(内铺湿纱布)，在37℃下扩散24小时。

结果观察：抗原孔与抗体孔出现沉淀线为阳性，以分离纯化的IgY能出现沉淀线的最大稀释倍数为其AGP效价。

实验结果：法氏囊和腺病毒IgY抗体在分别稀释32、64倍时仍能产生明显的白色抗原-抗体沉淀线，即法氏囊和腺病毒卵黄IgY抗体的效价分别为为1:32、1：64。

5.禽流感病毒和新城疫病毒IgY抗体血凝抑制效价测定

5.1禽流感病毒和新城疫病毒HI抗原血凝价测定

禽流感病毒H5、H7、H9和新城疫病毒抗原分别各做一组。

5.1.1在微量反应板的1孔-12孔均加入25μLPBS。

5.1.2用2mLPBS溶液分别溶解H5、H7、H9和新城疫病毒抗原，从中分别再取25μL，加入第1孔，混匀(反复吸取6-8次，后同)。

5.1.3从第1孔吸取25μL病毒抗原加入第2孔，混匀后吸取25μL加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取25μL弃之，第12孔为对照。

5.1.4每孔再加入25μLPBS。

5.1.5每孔均加入25μL体积分数为1％的鸡红细胞悬液(将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入)。

5.1.6振荡混匀，37℃恒温箱静置10min后观察结果(如果实验结果不明显，可适当延长孵育时间)，在对照孔红细胞显著呈纽扣状时判定结果。

5.1.7结果判定：将板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流淌。完全血凝(不流淌)的抗原或病毒最高稀释倍数代表1个血凝单位(HAU)。

5.2禽流感病毒和新城疫病毒IgY抗体血凝抑制效价测定：血凝抑制试验(HI)

禽流感病毒H5、H7、H9和新城疫病毒抗原分别各做一组。

5.2.1根据5.1试验结果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含4HAU的抗原的稀释倍数。例如：如果血凝的终点滴度为1:256，则4HAU抗原的稀释倍数应是1:64(256除以4)。

5.2.2在微量反应板的1孔-11孔加入25μLPBS，第12孔加入50μLPBS。

5.2.3吸取25μL待检IgY抗体加入第1孔，充分混匀后吸取25μL于第2孔，依次对倍稀释至第10孔，从第10孔吸取25μL弃之。第11孔为阳性对照，第12孔为阴性对照。

5.2.4 1孔-11孔分别加入含4HAU混匀的禽流感H5、H7、H9和新城疫抗原液25μL，37℃恒温箱孵育10分钟。5.2.5每孔加入25μL体积分数为1％的鸡红细胞悬液混匀，轻轻混匀，37℃恒温箱孵育10分钟(若实验结果不明显，可在室温下延长孵育时间)，对照红细胞将呈现纽扣状沉于孔底。

5.3结果判定

将反应板倾斜，从背侧观察加样孔底部的红细胞有无呈泪滴状流淌，以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。

只有阴性对照孔血清滴度≤2log2，阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，红细胞对照无自凝现象时，试验结果有效。

HI滴度≤3log2判定HI试验阴性；HI滴度≥4log2判定HI试验阳性。

结果：1‰IgY禽流感病毒血凝抗体滴度H5 2⁵、H7 2⁵、H9 2¹⁰，新城疫病毒2⁶；原液IgY禽流感病毒血凝抗体滴度H5 2⁷、H7 2⁷、H9 2¹²，新城疫病毒2⁸。

实施例2

防治禽流感病毒、新城疫病毒、法氏囊病毒和腺病毒病卵黄中和抗体IgY和溶菌酶复合制剂的制备及最佳比例的确定：

复合制剂制备：溶菌酶与实施例1中步骤2制备的IgY冻干粉按表1各组含量，混匀。

每组试验鸡100000只，分别按照表1在饮水中添加上述复合制剂，对照组100000只鸡，正常饮水，不添加任何溶菌酶和禽流感病毒、新城疫病毒、法氏囊病毒和腺病毒病卵黄中和抗体IgY。

统计各组死淘率和发病率。结果见表1。

从表1可以看出，第2组、第3组死淘率和发病率最低，其它各组死淘率和发病率均比第2组、第3组高很多(P<0.05)，但各试验组均比对照组显著低(P<0.01)。禽流感病毒、新城疫病毒、法氏囊病毒和腺病毒病卵黄中和抗体IgY和溶菌酶的最佳比列为第2组和第3组。

表1复合制剂中溶菌酶：禽流感、新城疫、法氏囊病和腺病毒IgY最佳比例实验

第2组、第3组死淘率、发病率一致，但第3组禽流感、新城疫、法氏囊病和腺病毒卵黄中和抗体IgY冻干粉：溶菌酶含量比第2组高很多。因此在不影响防治鸡病效果同时又降低成本的情况下，第2组禽流感、新城疫、法氏囊病和腺病毒卵黄中和抗体IgY冻干粉：溶菌酶含量最佳。因此，选用第2组禽流感、新城疫、法氏囊病和腺病毒卵黄中和抗体IgY冻干粉：溶菌酶含量来制备禽流感、新城疫、法氏囊病和腺病毒卵黄中和抗体IgY冻干粉：溶菌酶复合制剂。

所述冻干粉中包括：禽流感、新城疫、法氏囊病和腺病毒卵黄中和抗体IgY冻干粉：溶菌酶：5:1，混匀。混匀后的禽流感、新城疫、法氏囊病和腺病毒卵黄中和抗体IgY溶菌酶复合制剂，IgY 500mg/g冻干粉，溶菌酶500000U/g冻干粉(图2)。

由图2可见，所述卵黄中和抗体IgY与溶菌酶复合制剂为冻干粉末，乳白色。

实施例3

鸡病情严重程度不同对IgY和溶菌酶含量需求试验

复合制剂制备：溶菌酶：禽流感、新城疫、法氏囊病和腺病毒卵黄中和抗体IgY冻干粉按表2各组含量，混匀。

每组试验鸡100000只，分别按照表2注射不同含量的禽流感病毒、新城疫病毒、法氏囊病毒和腺病毒病卵黄中和抗体IgY和溶菌酶复合制剂，对照组100000只鸡，正常饮水，不注射任何溶菌酶和禽流感病毒、新城疫病毒、法氏囊病毒和腺病毒病卵黄中和抗体IgY。

鸡病情严重程度分为轻度、中度和重度，统计各组死淘率。结果见表2。从表2可以看出，第2组、第3组死淘率最低，第1组组死淘率均比第2组、第3组高很多(P<0.05)，但各试验组均比对照组显著低(P<0.01)。鸡病情严重程度不同对禽流感病毒、新城疫病毒、法氏囊病毒和腺病毒病卵黄中和抗体IgY和溶菌酶含量以第2组和第3组为好。

第2组、第3组死淘率一致，但第3组禽流感、新城疫、法氏囊病和腺病毒卵黄中和抗体IgY冻干粉：溶菌酶含量比第2组高很多。因此在不影响防治鸡病效果同时又降低成本的情况下，第2组禽流感、新城疫、法氏囊病和腺病毒卵黄中和抗体IgY冻干粉：溶菌酶含量最佳。因此，选用第2组禽流感、新城疫、法氏囊病和腺病毒卵黄中和抗体IgY冻干粉：溶菌酶含量来制备禽流感、新城疫、法氏囊病和腺病毒卵黄中和抗体IgY冻干粉：溶菌酶复合制剂。

表2鸡病情严重程度不同对IgY和溶菌酶含量需求试验

实施例4

以禽流感、新城疫、法氏囊病和腺病毒卵黄中和抗体IgY冻干粉：溶菌酶复合制剂给药和禽流感、新城疫、法氏囊病和腺病毒卵黄中和抗体IgY冻干粉、溶菌酶分别给药防治鸡病的效果试验。

表3溶菌酶、IgY分别给药和溶菌酶、IgY复合制剂给药防治鸡病效果试验

复合制剂制备：溶菌酶：禽流感、新城疫、法氏囊病和腺病毒卵黄中和抗体IgY冻干粉按表3第3组含量，混匀。混匀后的溶菌酶：禽流感、新城疫、法氏囊病和腺病毒卵黄中和抗体IgY溶菌酶复合制剂中溶菌酶、IgY含量见表3第3组。溶菌酶和禽流感、新城疫、法氏囊病和腺病毒卵黄中和抗体IgY冻干粉按表3第1、2组含量制备。每组试验鸡100000只，分别按照表3在饮水中添加溶菌酶、禽流感病毒、新城疫病毒、法氏囊病毒和腺病毒病卵黄中和抗体IgY、禽流感病毒、新城疫病毒、法氏囊病毒和腺病毒病卵黄中和抗体IgY和溶菌酶复合制剂，对照组100000只鸡，正常饮水，不添加任何溶菌酶和禽流感病毒、新城疫病毒、法氏囊病毒和腺病毒病卵黄中和抗体IgY。

结果见表3。从表3可以看出，第3组死淘率和发病率最低，其它2组死淘率和发病率均比第3组高很多(P<0.05)，但各试验组均比对照组显著低(P<0.01)。结果表明禽流感病毒、新城疫病毒、法氏囊病毒和腺病毒病卵黄中和抗体IgY和溶菌酶复合制剂比单独溶菌酶和单独禽流感病毒、新城疫病毒、法氏囊病毒和腺病毒病卵黄中和抗体IgY防治禽流感病毒、新城疫病毒、法氏囊病毒和腺病毒病效果更好。

实施例5

预防或鸡大面积发病时，防治禽流感病毒、新城疫病毒、法氏囊病毒和腺病毒病卵黄中和抗体IgY和溶菌酶复合制剂使用方法推荐：本品(实施例2确定的最优复合制剂)一个包装(30克)用于10000只鸡饮水。将本品一个包装添加到10000只鸡1小时的饮水量的水中，先加入1000ml水中溶解混匀，再加入大一些体积的水中逐级充分混匀，最后加入到终体积水中充分混匀。饮用本品前，鸡群断水1小时，饮完后再断水1小时，再恢复供水。预防时可在肉鸡龄两周和四周左右各使用一次。

实施例6

治疗禽流感病毒、新城疫病毒、法氏囊病毒和腺病毒病

鸡生病时，取5000ml(5公斤)冷却到室温的开水或纯净水，加入10克头孢噻呋，充分混匀，然后加入本品实施例2确定的最优复合制剂)一个包装(30克)溶解，充分混匀。鸡生上述四种病时，1Kg以内小鸡，肌肉注射溶解液1ml，鸡1Kg以上，注射溶解液1ml/Kg鸡治疗，打一针基本上就好了(见表3：第2组、第4组)。在肉鸡、蛋鸡、种鸡养殖过程中，发生禽流感病毒、新城疫病毒、法氏囊病毒和腺病毒病时使用。

实施例7

防治禽流感病毒、新城疫病毒、法氏囊病毒和腺病毒病卵黄中和抗体IgY和溶菌酶复合制剂大规模临床试验

在浙江省长兴县10个养鸡场进行防治禽流感病毒、新城疫病毒、法氏囊病毒和腺病毒病卵黄中和抗体IgY和溶菌酶复合制剂临床试验，试验组共计100万只肉鸡，对照组100万只肉鸡。在肉鸡鸡龄两周和四周左右各使用一次防治禽流感病毒、新城疫病毒、法氏囊病毒和腺病毒病卵黄中和抗体IgY和溶菌酶复合制剂，每次每10000只肉鸡饮水使用30克防治禽流感病毒、新城疫病毒、法氏囊病毒和腺病毒病卵黄中和抗体IgY和溶菌酶复合制剂冻干粉，对照肉鸡饮水中不加防治禽流感病毒、新城疫病毒、法氏囊病毒和腺病毒病卵黄中和抗体IgY和溶菌酶复合制剂冻干粉。肉鸡养殖6周。统计鸡死淘率和神沉郁、体温下降、肿头肿脸、冠髯发紫、采食下降，呼吸困难，打呼噜、咳嗽、眼鼻有分泌物，心包积液、产蛋下降，拉黄白或石灰样粪便、黄绿色稀便、生长缓慢、贫血消瘦、饮水增多疾病症状。

结果显示试验组肉鸡死淘率0.01％，对照组死淘率15％；试验组神沉郁、体温下降、肿头肿脸、冠髯发紫、采食下降，呼吸困难，打呼噜、咳嗽、眼鼻有分泌物，心包积液、产蛋下降，拉黄白或石灰样粪便、黄绿色稀便、生长缓慢、贫血消瘦、饮水增多疾病症状发病率0.1％，对照组发病率23％。因此，防治禽流感病毒、新城疫病毒、法氏囊病毒和腺病毒病卵黄中和抗体IgY和溶菌酶复合制剂能使肉鸡死淘率显著降低，肿头肿脸、冠髯发紫、采食下降，呼吸困难，打呼噜、咳嗽、眼鼻有分泌物，心包积液、产蛋下降，拉黄白或石灰样粪便、黄绿色稀便、生长缓慢、贫血消瘦、饮水增多疾病症状发病率显著降低。

在肉鸡、蛋鸡、种鸡养殖过程中，发生大面积禽流感病毒、新城疫病毒、法氏囊病毒和腺病毒病时，或肉鸡接种流感病毒、新城疫病毒、法氏囊病毒和腺病毒疫苗30天后，用禽流感病毒、新城疫病毒、法氏囊病毒和腺病毒病卵黄中和抗体IgY和溶菌酶复合制剂给鸡饮水2次，连续2天。

本发明的禽流感病毒、新城疫病毒、法氏囊病毒和腺病毒病卵黄中和抗体IgY浓度在每羽份3mg(6mg冻干粉)时和溶菌酶在3000活力单位能够完全防治禽流感病毒、新城疫病毒、法氏囊病毒和腺病毒病引起的疫病，对照组无明显中和活性(见表1)。

每次每只鸡或鸭或鹅饮水中加入1.5mg抗体IgY、1500活力单位溶菌酶复合制剂，在鸡或鸭或鹅龄2、4周饮水2次，一般可保证肉鸡、肉鸭、肉鹅整个养殖周期不生病(见表1)。

综上所述，本发明提供的复合制剂没有耐药性，没有副作用，作用方式安全、不会产生免疫排斥反应，一般可保证肉鸡、肉鸭、肉鹅整个养殖周期不生病，是一种安全、有效、方便防治禽流感、新城疫、法氏囊病和腺病毒病的新途径。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种防治禽病的复合制剂，其特征在于，所述复合制剂包括卵黄中和抗体IgY和溶菌酶；以每g复合制剂计，所述卵黄中和抗体IgY的质量为400～600mg，所述溶菌酶的酶活为400000～600000U。

2.根据权利要求1所述的复合制剂，其特征在于，制备所述卵黄中和抗体IgY的抗原包括禽流感病毒、新城疫病毒、法氏囊病病毒和腺病毒制备的类病毒颗粒及灭活病毒疫苗。

3.根据权利要求2所述的复合制剂，其特征在于，所述禽流感病毒包括H9亚型H9N2、H5亚型Re-13株、H5亚型Re-14株和H7-Re4株；

所述新城疫病毒包括新城疫病毒A-VII株；

所述法氏囊病病毒包括法氏囊病病毒超强毒流行株Vp2；

所述腺病毒包括I群4型腺病毒。

4.根据权利要求1所述的复合制剂，其特征在于，所述卵黄中和抗体IgY的重链的分子量为67～70KD，轻链的分子量为22～30KD。

5.权利要求1～4任一项所述复合制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

利用抗原免疫产蛋母鸡，得到含有卵黄中和抗体IgY的蛋黄；

将所述蛋黄稀释后调节pH值至5.1～6.0，离心，得到上清液；

将所述上清液冻干，得到所述卵黄中和抗体IgY；

将所述卵黄中和抗体IgY和溶菌酶混合，得到所述复合制剂。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述离心的转速为8000～12000rpm，离心的时间为20～30min。

7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，所述离心前还包括：将调节pH值后的蛋黄稀释液在2～8℃下静置4～5h。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述免疫的次数为≥3次，每次间隔的时间为7～42d。

9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述抗原免疫产蛋母鸡前还包括将抗原和免疫佐剂混合；所述免疫佐剂包括ISA 71佐剂。

10.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述冻干前还包括：将上清液超滤浓缩；所述超滤浓缩所使用的超滤膜包括5万分子截留量的超滤膜。

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