CN111778217A - Ⅰ群4型禽腺病毒sd-f株、灭活疫苗及制备方法 - Google Patents

Ⅰ群4型禽腺病毒sd-f株、灭活疫苗及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供Ⅰ群4型禽腺病毒SD‑F株、灭活疫苗及制备方法，属于生物工程领域。Ⅰ群4型禽腺病毒SD‑F株，保藏编号：CCTCC NO：V201964。该禽腺病毒灭活疫苗的制备方法如下：将Ⅰ群4型禽腺病毒SD‑F株病毒液灭活，然后与吐温‑80混合，搅拌混匀，得到水相；将白油与司本‑80混合，搅拌均匀，灭菌后得到油相；将水相与油相按体积比为1:2‑4混合，乳化，即得灭活疫苗。本发明SD‑F株能够适应无致瘤性的DF‑1细胞，制备工艺简单，成本低，无致瘤风险，安全性较高；其灭活疫苗免疫保护率高，免疫后9天抗体阳性率达90%以上，免疫持续期达到6个月，且子代攻毒保护率为90%以上，攻毒保护率为100%。

Description

Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株、灭活疫苗及制备方法
技术领域
本发明涉及一种禽腺病毒蚀斑克隆纯化毒株，灭活疫苗及制备方法，属于生物工程领域。
背景技术
禽腺病毒为新近流行的急性接触性传染病，感染在鸡群中较为普遍，甚至呈全国性流行，且呈逐年上升趋势。该病主要垂直传播，也可水平传播，鸡感染后，可成为终身携带者，并可间歇性排毒。发病的宿主范围越来越广，白羽肉鸡、蛋鸡、黄羽鸡均可感染发病。此病死亡率为20％～80％，给养殖业带来巨大的经济损失。由于本病为新发病，商品化疫苗极少，而控制本病，最有效的方法就是免疫预防。目前禽腺病毒4型主要是通过SPF鸡胚进行病毒增殖，或用致瘤性的LMH细胞增殖。用鸡胚增殖在大规模生产中，工艺繁琐、成本昂贵，用致瘤性的LMH虽然可以增殖，但LMH细胞有致瘤性，给疫苗生产造成潜在的致瘤风险，从而严重阻碍禽腺病毒疫苗的研究进程。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株，该毒株能够适应无致瘤性的DF-1细胞，制备工艺简单，成本低，无致瘤风险，安全性较高。
本发明的再一目的是提供采用上述Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株制备的禽腺病毒灭活疫苗，安全性、免疫保护率高，免疫后9天抗体阳性率达90％以上，免疫持续期达到6个月，且子代攻毒保护率为90％以上。
本发明的另一目的是提供上述灭活疫苗的制备方法，由于Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株采用无致瘤性的DF-1细胞进行增殖，因此安全性高，操作简单，成本低。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株，保藏编号：CCTCC NO：V201964。
本发明提供一种禽腺病毒灭活疫苗，抗原为灭活的Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株，该SD-F株的保藏编号为CCTCC NO：V201964。
本发明还提供所述禽腺病毒灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：
(1)将Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株病毒液灭活，然后与吐温-80混合，搅拌混匀，得到水相；
(2)将白油与司本-80混合，搅拌均匀，灭菌后得到油相；
(3)将水相与油相按体积比为1:2-4混合，乳化，即得Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株灭活疫苗。
在本发明中，步骤(1)中所述病毒液采用DF-1细胞测定病毒含量不低于105.5TCID50/ml。
在本发明中，步骤(1)中所述病毒液是将Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株采用DF-1细胞增殖后获得。
在本发明中，步骤(1)中灭活后的病毒液中甲醛的体积百分含量为0.15％-0.2％。
在本发明中，步骤(1)中灭活后的病毒液与吐温-80的体积比为94:6。
在本发明中，步骤(2)中白油与司本-80的体积比为94:6。
有益效果：(1)本发明Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株能够适应无致瘤性的DF-1细胞，制备工艺简单，成本低，无致瘤风险，安全性较高。(2)本发明禽腺病毒灭活疫苗，安全性、免疫保护率高，免疫后9天抗体阳性率达90％以上，免疫持续期达到6个月，且子代攻毒保护率为90％以上，攻毒保护率为100％。疫苗免疫后6个月，鸡群血清抗体水平仍然较高，子代攻毒保护率达到90％以上，说明母鸡免疫后1～6个月产生的抗体可以对子代提供有效保护。(3)本发明灭活疫苗的制备方法，由于Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株采用无致瘤性的DF-1细胞进行增殖，因此安全性高，操作简单，成本低。
附图说明
图1是Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株的PCR鉴定电泳图。其中左侧条带Marker2000，右侧条带为Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株PCR扩增产物。
具体实施方式
实施例1
本实施例描述Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株的获得及特异性鉴定。
SPF种蛋购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司，自孵至10日龄。
DF-1细胞购自美国ATCC。
MEM细胞培养液、DMEM培养液、小牛血清、胰酶购于GIBCO公司。
鸡胚成纤维细胞的制备：按《中华人民共和国兽用生物制品规程》2000版附录制备CEF。
1.Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株的获得
Ⅰ群4型禽腺病毒SD2015株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：V201645。
将Ⅰ群4型禽腺病毒SD2015株解冻后12000rpm离心10分钟，取上清备用。对病毒上清液进行10倍系列梯度稀释。将已长满单层CEF细胞的96孔细胞板，弃去细胞孔内的营养液，取不同稀释度的病毒液各10ul接种至96孔细胞孔的每孔中，37℃、CO2培养箱吸附1小时后，加入含2％(体积百分浓度)小牛血清和1％(体积百分浓度)青链霉素溶液的DMEM维持液，继续在37℃、CO2培养箱中培养，每天观察细胞病变即蚀斑情况。接种后约72～96小时出现蚀斑，并在显微镜下挑蚀斑。将挑好的蚀斑反复冻融3次后，12000转离心10分钟，取上清备用。按上述方法对病毒进行蚀斑纯化3次，收获的病毒液即为蚀斑克隆毒。其中青链霉素溶液是含有1000U/L青霉素和1000U/L链霉素的水溶液。
将蚀斑克隆毒12000转离心10分钟，取上清接种铺有CEF的6孔细胞板。每孔接种25ul病毒液，在37℃、CO2培养箱中吸附1小时后，加入含2％(体积百分含量)小牛血清和1％(体积百分含量)青链霉素溶液的DMEM维持液。每天观察细胞病变情况，待每个细胞孔80％以上细胞出现细胞病变时，收获细胞毒，反复冻融3次后，-20℃保存备用。按照上述方法，将蚀斑克隆毒盲传至F5代时，出现明显细胞病变，反复冻融3次后12000rpm离心10分钟，取上清，命名为FAdV-4-CEF。其中青链霉素溶液是含有1000U/L青霉素和1000U/L链霉素的水溶液。
将已长成单层的DF-1细胞，弃去营养液，用PBS洗一遍，分成3组，第一组中加入0.1ml的FAdV-4-CEF病毒液，再加入9.9ml MEM细胞维持液，37℃、CO2培养箱中培养。第二组，加入禽腺病毒SD2015株0.1ml，再加入9.9ml的MEM细胞维持液，37℃、CO2培养箱中培养。第三组中只加入10ml MEM细胞维持液，37℃、CO2培养箱中培养作为阴性对照细胞。每天观察细胞病变情况，若无细胞病变，第一、二组则接种病毒后5～6天收获细胞毒，反复冻融3次后，12000rpm离心10分钟，取上清再接种DF-1细胞，同时设立阴性对照细胞。如此连续盲传至F5代时，第一组中的细胞出现明显的细胞病变，而第二、三组中的细胞仍然无细胞病变出现，具体结果见表1。对各组盲传至F5代的细胞培养物进行FAdV-4的PCR检测，发现出现细胞病变的第一组检测到FAdV-4的特异性条带；而第二、三组未检测到目的条带，说明Ⅰ群4型禽腺病毒SD2015株经CEF培养后可以在DF-1细胞上扩增繁殖。将第一组盲传至F5代的病毒，命名为Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株，并对其特异性进行验证。
表1 FAdV-4在DF-1细胞上的驯化
初始毒株 F1 F2 F3 F4 F5 F5的PCR检测
FAdV-4-CEF 无CPE 无CPE 无CPE 无CPE CPE +
SD2015株 无CPE 无CPE 无CPE 无CPE 无CPE -
注：表1中“-”表示PCR未能检测到目的条带；“+”PCR检测到目的条带。
2.Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株特异性的验证：
(1)血清中和试验法：
将Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株病毒液在12000g离心10分钟，取上清稀释10倍后备用。
取H9、IB、EDS、IBDV、ND、FADV-4单因子阳性血清在56℃灭活30分钟备用。其中H9、IB、EDS、IBDV、ND、FADV-4阳性血清均为是采用相应抗原灭活后分别免疫接种SPF鸡，采血后分离血清制备而成。
取上述10倍稀释的Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株病毒液0.5ml分别与等体积灭活的各血清在37℃、CO2培养箱中中和1小时，然后分别接种于用PBS洗过2次的DF-1单层细胞中，在37℃、CO2培养箱中吸附1小时后，加入9ml MEM培养液，在37℃、CO2培养箱中继续培养，每天观察细胞病变情况。病毒对照组中以0.5ml稀释10倍的病毒液替代采用各阳性血清中和过的病毒液，其它不变。健康细胞对照中以1.0ml MEM培养液替代采用各阳性血清中和过的病毒液，其它不变。每天观察细胞病变情况。观察结果如表2。
表2血清中和试验
Figure BDA0002617012260000041
注：表2中“-”代表阴性；“+”代表阳性。
(2)鸡红细胞凝集试验
鸡红细胞凝集试验：按《中华人民共和国兽用生物制品规程》2000版附录进行，试验结果如表3。鸡红细胞凝集试验结果说明了Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株中无外源病毒。
表3鸡红细胞凝集试验结果
组别 H9N2 NDV SD-F PBS对照
结果 + + - -
注：表3中“-”代表阴性；“+”代表阳性。
(3)PCR检测
提取Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株的DNA，具体操作步骤如下：取SD-F株病毒液400ul，加入12.5ul蛋白酶K溶液和50ul浓度为10％的SDS溶液，混匀；56℃作用30min；依次加入200ul氯仿和200ul苯酚，剧烈震荡15s，室温放置5分钟；4℃、12000rpm离心10min；取上清加入等体积的氯仿混匀，室温放置5min；4℃、12000rpm离心10min,取上清加入等体积的氯仿混匀，室温放置5min；4℃、12000rpm离心10min；取上清，加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积、浓度为3M的乙酸钠溶液，-20℃放置30min；4℃、12000rpm离心10min；弃上清，加入75％的乙醇溶液1000ul洗涤，4℃、12000rpm离心5min；弃上清，干燥10min；加入30ul双蒸水溶解沉淀，得到Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株的DNA，用作模板进行PCR扩增。
设计一对Ⅰ群4型禽腺病毒的Hexon基因区域引物(Hexon上游引物和Hexon下游引物)进行PCR鉴定。
Hexon上游引物的序列为5-GTCTATACCAACACGAGCACC-3’；
Hexon下游引物的序列为5-GGTTAATGAAGTTATCCCTGAACCC-3’。
PCR反应体系(20ul)如下：
Figure BDA0002617012260000051
其中2×Premix Taq购自上海生工生物工程有限公司。
PCR反应程序如下：94℃预变性5min；94℃30S，52℃30s，72℃1min，35个循环；72℃延伸10分钟。
PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。图1显示Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株的扩增片段，与预期的目的片段大小相符。将扩增出的目的片段送上海英俊生物技术有限公司进行测序，结果显示片段大小为686bp，序列如SEQ ID NO:1所示。
采用DNAStar软件对测得的SD-F株Hexon基因的核苷酸序列进行分析，并与GenBank中Ⅰ群禽腺病毒毒株的相应序列进行比较，发现SD-F株与Ⅰ群4型禽腺病毒同源性为99％～100％。因此，PCR检测结果证明SD-F株是Ⅰ群4型禽腺病毒。
Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株的保藏信息如下：
保藏单位：中国典型培养物保藏中心。
单位地址：中国.武汉.武汉大学
分类命名：Ⅰ群4型禽腺病毒株SD-F株。
保藏编号：CCTCC NO：V201964。
保藏日期：2019年10月22日。
Ⅰ群4型禽腺病毒株SD-F株即Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株。
实施例2禽腺病毒灭活疫苗的制备
禽腺病毒灭活疫苗的制备方法包括如下步骤：
(1)DF-1细胞的培养
细胞生长液的配方：在MEM培养液中添加终浓度为5％(体积百分含量)的小牛血清和终浓度为1％(体积比百分含量)的青链霉素溶液，调节pH至7.0～7.2后用0.22um的滤纸过滤分装、备用。其中，青链霉素溶液是含有1000U/L青霉素和1000U/L链霉素的水溶液。
将DF-1种子细胞从液氮中取出，置37℃水浴迅速解冻，并用细胞生长液培养2～3天进行复苏，待细胞长成致密单层时(细胞数约达4×107)进行1:3传代。
(2)病毒接种：待步骤(1)中传代后的DF-1细胞长成致密单层后，用PBS液洗涤细胞表面一次，将Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株按MOI＝0.05接种细胞，再加入细胞维持液继续培养。待80％以上细胞出现细胞病变时(对应的病毒培养时间约为接毒后120h～144h)，收获细胞毒。将细胞毒反复冻融3次后，12000rpm离心，取上清液即得Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株病毒液。其中细胞维持液是含有2％(体积百分含量)小牛血清和1％(体积比百分含量)青链霉素溶液的MEM培养液。其中青链霉素溶液是含有1000U/L青霉素和1000U/L链霉素的水溶液。
按《中华人民共和国兽药典》(2010版)用DF-1细胞测定Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株病毒液的病毒含量，结果：病毒含量达到105.5TCID50/ml。若用LMH(鸡肝癌细胞)检测，病毒含量达到108.5TCID50/ml。为了操作方便和节约成本，以下病毒含量均用DF-1细胞测定。
病毒灭活：向收获的病毒液中加入终浓度(体积百分浓度)为0.15％～0.2％的甲醛，在37℃灭活24～48小时。
(3)乳化
水相制备：将步骤(2)中所得灭活的Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株病毒液与吐温-80按照体积比为94:6混合，搅拌混匀，得到水相。
油相制备：将白油与司本-80按照体积比为94:6混合，搅拌均匀，灭菌后得到油相。
配苗：将水相与油相按体积比为1:3混合，乳化，即得Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株灭活疫苗。
Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株灭活疫苗的作用与用途：Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株灭活疫苗用于预防禽心包液肝炎综合征。14日龄以上鸡均可免疫接种，接种后9天产生免疫力，免疫期为6个月。
实施例3 Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株灭活疫苗免疫效力
按实施例2方法制备3批次Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株灭活疫苗(20170210、20170211、20170212批疫苗)。各批次疫苗的病毒含量≥104.4/羽份。
每批次疫苗，取21日龄SPF鸡20只作为免疫组，每只颈部皮下注射0.3ml的Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株灭活疫苗；另20只作对照，不免疫。免疫后21～28天，免疫组与对照组各取10只进行攻毒，攻毒剂量为107.0TCID50(0.3ml)的肝组织毒。其中，肝组织毒的制备方法如下：将Ⅰ群4型禽腺病毒SD2015株肌肉注射49日龄SPF鸡，1000EID50/只，鸡发病后取鸡的肝组织，研磨、冻融、离心、测定病毒含量，按2010版《兽药典》检验合格后分装置于-70℃冰箱备用。
攻毒后，7天判定结果。只要出现以下一项以上(包括一项)症状均判为感染：精神萎靡、羽毛蓬松、卧地不起、排黄色稀粪、死亡时间出现在接种后48～96小时、剖检死亡鸡心包有不同程度的心包积液、肝脏肿大、肝脏出血、肾脏肿大；死亡鸡出现肺水肿、腺胃乳头或肌胃腺胃交界处出现出血。
从表4可以看到，对照组全部发病，9/10以上死亡，剖检病死鸡均有禽心包积液肝炎综合征的典型症状，出现心包积液、肝脏肿大、质脆、出血或坏死，肾脏肿大。免疫组保护率为90％～100％。
表4 3批次疫苗的免疫效力试验结果
Figure BDA0002617012260000081
实施例4Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株灭活疫苗免疫产生期试验
选取60只日龄相同的鸡只，随机分为6组(包括第一至第五组和对照组)，每组10只。采用实施例3中Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株灭活疫苗(20170212批次)分别对第一至第五组鸡只进行免疫，第一组在14日龄时免疫，第二组在21日龄时免疫、第三组在28日龄时免疫、第四组在31日龄时免疫、第五组在33日龄时免疫，对照组不免疫。第一至第五组以及对照组鸡只均在42日龄时攻毒，具体分组如表5。
表5免疫分组表
Figure BDA0002617012260000082
攻毒当天，免疫组与对照组各取10只鸡进行采血检测血清抗体，然后进行攻毒，每只鸡的攻毒剂量为107.0TCID50/0.3ml的Ⅰ群4型禽腺病毒SD2015株肝组织毒。
血清抗体用琼脂扩散试验(参照《动物病毒学》第二版，殷震、刘景华主编P373～377)来检测。攻毒后7天，按照实施例3中方法判定攻毒结果。
结果：从表6可见，免疫组鸡只免疫后第9天可以测到血清中的琼扩抗体，且抗体阳性率达90％以上；从表7可见，攻毒保护率为100％。对照组鸡只在整个考察期间内均无抗体产生，攻毒保护率为0。
表6疫苗免疫后禽腺病毒琼扩抗体产生期测定结果
Figure BDA0002617012260000091
表7禽腺病毒攻毒结果
Figure BDA0002617012260000092
注：表7中“+”表示感染，“-”表示阴性。
实施例5Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株灭活疫苗对蛋鸡及其子代的免疫效力
采用实施例3中Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株灭活疫苗(20170212批次)免疫海兰蛋种鸡30只(免疫组)，接种剂量为0.3ml/只；另20只不免疫，作为对照。免疫后7天、14天、21天、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月免疫组、对照组各取10只鸡采血，分离血清，测定血清中的琼扩抗体水平，评价疫苗效果。另外，在免疫后1～6个月内，收集免疫鸡、对照鸡群(公母混群，平养本交)种蛋孵化至出雏，进行子代攻毒保护试验，通过子代获得的母源抗体保护力评价疫苗的免疫持续期。
只要能测到琼扩抗体均判为合格。子代攻毒保护试验中，用Ⅰ群4型禽腺病毒SD2015株的肝组织毒肌肉注射攻毒，攻毒剂量为0.3ml/只(含107.0TCID50)，攻毒后，观察7天判定结果。以免疫组8/10以上保护，对照组8/10以上感染判为合格。
结果表明：该批次的疫苗免疫后6个月，鸡群血清琼扩抗体水平为2.4(表8)。子代攻毒保护率为90％～100％，对照组全部感染(表9)。试验结果说明：母鸡免疫后1～6个月产生的抗体可以对子代提供有效保护。
表8 Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株灭活疫苗免疫后琼扩抗体测定结果(㏒2)
Figure BDA0002617012260000101
表9 Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株灭活疫苗免疫后对子代的攻毒保护测定结果
Figure BDA0002617012260000102
实施例6Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株灭活疫苗双倍剂量接种安全性试验
考察批号为20170210、20170211、20170212的Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株灭活疫苗双倍剂量接种的安全性。接种对象为14日龄SPF鸡(购自北京梅里亚维通实验动物有限公司的种蛋自孵出雏，养至14日龄)和14日龄的白羽肉鸡(购自南京石佛寺养鸡场)。购回的白羽肉鸡适应数天后，核实鸡的健康状况和临床疾病情况，剔除弱鸡，选择健康鸡进行试验。
三批灭活疫苗分别双倍剂量(0.6ml/只)颈部皮下注射SPF鸡，每次设1组不接种，作为对照；三批Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株灭活疫苗分别双倍剂量颈部皮下接种(0.6ml/只)白羽肉鸡，每批次苗设一组对照不接种。观察接种后14天内是否出现由疫苗引起的任何局部和全身反应，接种后14天、28天各组随机抽取试验鸡5～10只，剖检注射部位，检测疫苗的吸收情况。
结果：接种后14天内，未观察到临床异常，采食、饮水正常，健康情况良好，未发现由疫苗引起的任何局部和全身反应，具体见表10。接种后14天，各组取5～10只剖检注射部位，60％以上有粟粒样大小颗粒未吸收完全。注射后28天，剖检注射部位，80％以上疫苗基本吸收，注射部位未见由疫苗接种引起的异常反应，具体见表11。因此，Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株灭活疫苗双倍剂量接种是安全的。
表10双倍剂量接种灭活疫苗后14天内临床观察结果
Figure BDA0002617012260000111
表11双倍剂量接种Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株灭活疫苗的吸收检验结果
Figure BDA0002617012260000112
Figure BDA0002617012260000121
实施例7Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株灭活疫苗对流行毒株的攻毒保护效果研究
采用Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株灭活疫苗免疫SPF鸡，免疫后采血测定血清琼扩抗体，同时分别用本实验室自行分离鉴定的FADV-4 2016～2019年分离的流行毒株FAdV-4 2016、FAdV-4 2017株、FAdV-4 2018株、FAdV-4 2018株进行攻毒，其中，对照组不免疫只攻毒。观察灭活疫苗对FAdV-4流行毒株的攻毒保护效果。结果如果表12所示，用FAdV-4 2016、FAdV-4 2017、FAdV-4 2018株、FAdV-4 2019株攻毒后，对照组10/10发病，免疫组10/10保护，保护率均为100％。试验证明，用FAdV-4SD-F株禽腺病毒灭活疫苗对目前的流行毒株具有很好的保护效果。
表12 FAdV-4交叉攻毒保护结果
Figure BDA0002617012260000122
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株、灭活疫苗及制备方法
<130> 20200804
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1071
<212> DNA
<213> Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株
<400> 1
gttattactg tgtccgactc cggcgtgtgc tcgggcaccc tcaactcgga gcgttcgggc 60
atgaacgtgg tggtcgagct gcccgaccgg aataccgagc tcagctacca gtacatgctg 120
gccgacatga tgtcccgcca tcactatttc gccctgtgga accaggccgt ggaccagtac 180
gaccccgagg tgcgagtctt ctccaatgac ggttacgaag aaggcgcgcc cagctacgcc 240
ttcaaccccg aagcggtagg cgcgggagaa ggctacggcc ccgatctcag tcaaattaaa 300
ctctacacca acaacaccgc cgcgaacgac aaaaacaccg ccgtggctaa cgccactacc 360
aacttctact tcggcacggt accctcctac gaaatcgata tcagcgctac ccagaggcgc 420
aactttatca tggccaacat cgccgagtat ctgcccgacc gttacaagtt tagcatctcc 480
ggcttcgacg ccaccagcgt cgcgcctacc acctacgagt acatgaacaa gcgcgtcccc 540
ctcaccaacg tcgtcgacat gttcacgaac gtgggtgcgc gttggtccat cgaccagatg 600
gacaacgtca accccttcaa ccaccacaga aactgggggc tgaaataccg ctaagggcga 660
cacgcgattg cagtcaatac tgacgatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc 720
cgcttccata gcagaaagtc aaaagcctcc gaccggaggc ttttgacttg atcggcacgt 780
aagaggttcc aactttcacc ataatgaaat aagatcacta ccgggcgtat tttttgagtt 840
atcgagattt tcaggagcta aggaagctaa aatgagtatt caacatttcc gtgtcgcact 900
tattccgttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct caccagaaac gctggtgaaa 960
gtaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtac atccaactgg atctcacagc 1020
ggaagatcct tgagagtttc gccccgaaaa cggtttccat ggtgggcctt t 1071

Claims (8)

1.Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株，保藏编号：CCTCC NO：V201964。
2.一种禽腺病毒灭活疫苗，其特征在于，所述的疫苗中的抗原为灭活的Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株，该SD-F株的保藏编号为CCTCC NO：V201964。
3.权利要求1所述禽腺病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）将Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株病毒液灭活，然后与吐温-80混合，搅拌混匀，得到水相；
（2）将白油与司本-80混合，搅拌均匀，灭菌后得到油相；
（3）将水相与油相按体积比为1:2-4混合，乳化，即得Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株灭活疫苗。
4.根据权利要求3所述禽腺病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于步骤（1）中所述病毒液采用DF-1细胞测定病毒含量不低于105.5TCID50/ml。
5.根据权利要求4所述禽腺病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于步骤（1）中所述病毒液是将Ⅰ群4型禽腺病毒SD-F株采用DF-1细胞增殖后获得。
6.根据权利要求5所述禽腺病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于步骤（1）中灭活后的病毒液中甲醛的体积百分含量为0.15%-0.2%。
7.根据权利要求6所述禽腺病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于步骤（1）中灭活后的病毒液与吐温-80的体积比为94:6。
8.根据权利要求7所述禽腺病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于步骤（2）中白油与司本-80的体积比为94:6。
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