CN115634222A - 枳椇双黄酮a在制备具有抗肝纤维化作用的药物中的应用 - Google Patents
枳椇双黄酮a在制备具有抗肝纤维化作用的药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及药物化学技术领域，具体涉及枳椇双黄酮A在制备具有抗肝纤维化作用的药物中的应用。研究表明，枳椇双黄酮A具有优异的抗肝纤维化作用；其抗肝纤维化作用显著高于其它结构的黄酮类化合物；相比于其它常规的黄酮类化合物取得了显著的进步。此外，所述的枳椇双黄酮A具有优异的抗TGF‑β1诱导的肝纤维化作用以及抑制肝星状细胞增殖作用。因此，将枳椇双黄酮A作为活性成分制备具有抗肝纤维化作用的药物，尤其是制备具有抗TGF‑β1诱导的肝纤维化作用的药物或具有抑制肝星状细胞增殖作用的药物具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及药物化学技术领域，具体涉及枳椇双黄酮A在制备具有抗肝纤维化作用的药物中的应用。
背景技术
肝纤维化(Hepatic fibrosis，HF)是指多种致病因素持续刺激肝组织，致使细胞外基质稳态失衡，过度积聚。在肝损伤过程中，受损上皮细胞、纤维化组织微环境等可以直接或间接诱导肝星状细胞(Hepatic stellate cells，HSCs)活化。活化的HSCs获得肌成纤维细胞(Myofibroblast，MFB)表型，在肝脏沉积大量细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)，形成大量的瘢痕组织，最终形成肝纤维化。如不及时进行干预，肝纤维化可进一步恶化为肝硬化、肝癌。减弱或消除导致纤维化的多种因素，则可以逆转肝纤维化。目前临床尚无有效治疗HF的特效药物，研究抗HF药物是当前药物研发的热点之一。
枳椇双黄酮A(Hovenianin A)，分子式C30H22O16，分子量为636，其结构式如式Ⅰ所示：
枳椇双黄酮A是从北枳椇种子中分离得到的具有C2’-C2”’连接双黄酮醇类化合物。目前对其药理作用研究较少，本发明发明人在前期的专利(申请号CN201911389008.0)及文献(Fangfang Xu,Meihua Gao,Hua Li,et al.Three new bisflavonols from theseeds of Hovenia dulcis Thunb.and their anti-RSV activities[J].Fitoterapia,2020,143:104587)中仅报道了其具有抗病毒作用及抗炎活性。
现有技术(马婷，邝晓岚，蔡婉娜，刘博，徐方方，黄酮类成分抗肝纤维化作用及其机制的研究进展[J],中草药,2022,53(13):4146)公开了一系列具有抗肝纤维化作用的黄酮类成分；从该文献中可以看出，不同结构的黄酮类成分其抗肝纤维化的作用差别是巨大的。然而，何种结构的黄酮类成分具有优异的抗肝纤维化作用，本领域技术人员也是无法预料的。因此，提供一种具有优异的肝纤维化作用的黄酮类成分具有重要的应用价值。
发明内容
为了克服现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供了枳椇双黄酮A在制备具备抗肝纤维化作用的药物中的应用。
本发明的技术方案如下：
本发明首先提供了枳椇双黄酮A在制备具有抗肝纤维化作用的药物中的应用。
所述的枳椇双黄酮A具有式Ⅰ所示的结构：
本发明在研究中惊奇的发现，枳椇双黄酮A具有优异的抗肝纤维化作用；其抗肝纤维化作用显著高于其它结构的黄酮类化合物。
优选地，所述的抗肝纤维化为抗TGF-β1诱导的肝纤维化。
本发明还提供枳椇双黄酮A在制备具有抑制肝星状细胞增殖作用的药物中的应用。
优选地，所述的药物以枳椇双黄酮A作为活性成分，还包含药学上可接受的辅料。
优选地，枳椇双黄酮A在药物中的重量含量为0.1-99.9％。
优选地，所述的药物制成散剂、丸剂、片剂、胶囊剂、口服液、气雾剂或注射剂。
本发明还提供了一种组合物或提取物，其包含枳椇双黄酮A。
优选地，所述的组合物或提取物在制备具备抗肝纤维化作用的药物中的应用。
优选地，所述的抗肝纤维化作用的药物为抗TGF-β1诱导的肝纤维化的药物。
优选地，组合物或提取物在制备具有抑制肝星状细胞增殖作用的药物中的应用。
有益效果：本发明提供的枳椇双黄酮A具有优异的抗肝纤维化作用；其抗肝纤维化作用显著高于其它结构的黄酮类化合物；相比于其它常规的黄酮类化合物取得了显著的进步。此外，所述的枳椇双黄酮A具有优异的抗TGF-β1诱导的肝纤维化作用以及抑制肝星状细胞增殖作用。因此，将枳椇双黄酮A作为活性成分制备具有抗肝纤维化作用的药物，尤其是制备具有抗TGF-β1诱导的肝纤维化作用的药物或具有抑制肝星状细胞增殖作用的药物具有重要的应用价值。
附图说明
图1为枳椇双黄酮A以及其它黄酮类化合物对HSC-T6细胞增值的作用；图中，与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。
图2为枳椇双黄酮A对HSC-T6细胞α-SMA和Col-I mRNA和蛋白表达的影响；图中，与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。
图3为枳椇双黄酮A对HSC-T6细胞凋亡的影响；图中，与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。
实施例1枳椇双黄酮A对HSC-T6细胞抑制增殖和活化作用
1方法
1.1HSC-T6细胞培养
将细胞接种于含10％FBS的DMEM(含青霉素+链霉素)培养基中，于37℃、5％CO2培养箱中培养。当细胞处于对数生长期时，用含EDTA的胰蛋白酶消化传代。将细胞随机分为正常组、TGF-β1组及枳椇双黄酮A、槲皮素、杨梅素、二氢杨梅素、芹菜素、山奈酚、斯皮诺素组(25、50、75、100μmol/L)。用含10％FBS的培养基培养24h后，除正常组外，其他组加入10ng/mL的TGF-β1。Hovenianin A组分别加入25、50、75、100μmol/L的Hovenianin A培养24h。
1.2CCK8法检测HSC-T6细胞增殖
各组作用24h时吸净孔内培养基，PBS洗两次，每孔加入10μL CCK8，混匀后培养箱孵育2小时，采用酶标仪检测450nm波长处各孔的吸光度(A)值。酶标仪读取待测样品和空白对照在450nm处的OD值，计算不同药物浓度对HSC的细胞存活率。
细胞存活率＝[(实验孔-空白孔)/(对照孔-空白孔)]×100％
实验结果如图1所示，由图1可知枳椇双黄酮A对HSC-T6细胞增殖具有抑制作用，且具有明显的量效关系。其中50、75、100μM浓度的枳椇双黄酮A能显著抑制HSC-T6细胞的增殖(P＜0.01)。本实验例结果表明枳椇双黄酮A发挥抗肝脏纤维化的作用机制可能是抑制肝星状细胞增殖。
尤其是枳椇双黄酮A在100μM浓度时，其对HSC-T6细胞增殖的抑制作用显著高于常规的黄酮类成分，如槲皮素、杨梅素、二氢杨梅素、芹菜素、山奈酚、斯皮诺素。
1.3枳椇双黄酮A对HSC-T6细胞Col-Ia1和α-SMA mRNA表达的影响
取各组作用24h细胞，采用TRIzol法提取细胞总RNA，超微量紫外可见光分析光度计测OD值，定量RNA浓度。按cDNA第一链合成试剂盒说明逆转录为cDNA,然后进行PCR扩增。GAPDH为内参对照。引物信息为
表1引物信息
1.4枳椇双黄酮A对HSC-T6细胞Col-Ia1和α-SMA蛋白表达的影响
取各组作用24h细胞，采用RIPA蛋白裂解液法刮取总蛋白，BCA法进行蛋白定量。将等量的蛋白溶解于十二烷基硫酸钠(SDS)样品缓冲液中，经10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移到PVDF膜上。继而加入一抗α-SMA、Col-Ia1抗体，4℃孵育过夜。用TBST于室温洗三次，每次10分钟。然后用二抗兔抗IgG孵育1h，再洗膜三次，每次5分钟。随后用ECL浸润PVDF膜后在化学发光成像系统下扫描。以GAPDH蛋白为内参对照。
TGF-β1是一类调节细胞生长和分化的多肽，能促进胶原的生成，具有活化HSC，促进肝脏胶原基因表达，促进ECM合成的作用，TGF-β1是最强的肝纤维化促进因子。α-SMA蛋白主要存在于平滑肌与肌成纤维细胞中，肝脏组织中发生肝纤维化时，活化的HSCs会表达α-SMA和Col-Ia1，因此α-SMA和Col-Ia1可被视为HSCs活化的标记。
实验结果见图2，由图2可知，枳椇双黄酮A对TGF-β1诱导的HSC-T6中Col-Ia1和α-SMA的mRNA和蛋白的表达具有抑制作用，且具有明显的量效关系。本实验例结果表明枳椇双黄酮A抑制HSCs的活化，降低活化标志蛋白α-SMA和Col-Ia1的表达，来发挥抗肝脏纤维化作用。
1.5枳椇双黄酮A对HSC-T6细胞凋亡的影响
取HSC-T6细胞，加药处理24h后，用磷酸缓冲盐PBS洗涤细胞2次后，采用胰蛋白酶消化、收集细胞，离心后弃去上清后制成细胞悬液，加入5μL的Annexin V-FITC染液，混匀后再加入10μL的碘化丙啶染色，混匀。37℃放置4min，PI染色后用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况。
肝纤维化进程中肝星状细胞(HSCs)分化成增殖性的肌成纤维细胞是肝纤维化的核心过程。促进HSC的凋亡，减少活化的HSCs数量是逆转或延缓肝纤维化的关键环节。
实验结果见图3，图3中流式结果提示，50、75、100μM浓度的枳椇双黄酮A能显著抑制HSC-T6细胞的凋亡(P＜0.01)。枳椇双黄酮A通过促进TGF-β1诱导的HSC-T6细胞凋亡而发挥抗肝纤维化作用。本实验例表明枳椇双黄酮A可能通过促进活化的HSCs凋亡，抑制α-SMA和Col-Ia1的表达，抑制肝纤维化的发生。
Claims (10)
1.枳椇双黄酮A在制备具有抗肝纤维化作用的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗肝纤维化为抗TGF-β1诱导的肝纤维化。
3.枳椇双黄酮A在制备具有抑制肝星状细胞增殖作用的药物中的应用。
4.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述的药物以枳椇双黄酮A作为活性成分，还包含药学上可接受的辅料。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，枳椇双黄酮A在药物中的重量含量为0.1-99.9％。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的药物制成散剂、丸剂、片剂、胶囊剂、口服液、气雾剂或注射剂。
7.一种组合物或提取物，其特征在于，包含枳椇双黄酮A。
8.权利要求7所述的组合物或提取物在制备具备抗肝纤维化作用的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的抗肝纤维化作用的药物为抗TGF-β1诱导的肝纤维化的药物。
10.权利要求7所述的组合物或提取物在制备具有抑制肝星状细胞增殖作用的药物中的应用。
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