CN115627252A - 人肺胚细胞系及其应用 - Google Patents

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CN115627252A CN202211272408.5A CN202211272408A CN115627252A CN 115627252 A CN115627252 A CN 115627252A CN 202211272408 A CN202211272408 A CN 202211272408A CN 115627252 A CN115627252 A CN 115627252A
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乔自林
田玲
王家敏
刘振斌
杨迪
马忠仁
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Abstract

本发明提供人胚肺细胞系MU‑L1，其保藏编号为CCTCC No:C2022196。本发明还提供其扩大培养方法以及在培养病毒中的应用。本发明的人胚肺细胞来源清晰；形态呈典型的成纤维样，长满单层后呈漩涡状生长；生长时对培养基营养成分要求低，含8％～10％新生牛血清的MEM培养基即生长良好。本发明的人胚肺细胞按1:4分种率传代，可传67代；经液氮冻存复苏后细胞活率均可保持在90％以上，且生长良好。本发明的人胚肺细胞未经发现细菌、真菌、支原体及内外源病毒因子污染；符合《中国药典》三部(2020版)人二倍体细胞染色体要求；裸鼠成瘤性试验结果为阴性，无成瘤性，且对水痘病毒较现用的MRC‑5细胞敏感。

Description

人肺胚细胞系及其应用
技术领域
本发明涉及人肺胚细胞系及其应用。
背景技术
接种疫苗是预防和控制传染病的最有效的手段之一。随着社会发展，大众对安全性更高、免疫原性更好的疫苗需求量不断增加，开发出更安全、更高效的用于生产疫苗的细胞基质十分重要。人二倍体细胞来源于正常人胚胎组织，染色体组型与供体组织保持一致，无外源病毒因子污染，无致瘤性，对多种病毒易感，所制备的人二倍体细胞基质疫苗具有良好的免疫原性和安全性，因此被世界卫生组织组织(WHO)评价为病毒性疫苗生产最安全的细胞基质。以人二倍体细胞基质生产的狂犬病疫苗被WHO推荐为狂犬病疫苗的“黄金标准”。
目前，用于疫苗生产的人二倍体细胞主要是WI-38、MRC-5、2BS和KMB-17等细胞株。WI-38是Hayflick于1961年从一个人工流产的3月龄女胚肺组织分离培养的，可稳定传代48代次，并对多种人类病毒易感，曾被广泛应用于脊髓灰质炎疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、狂犬病疫苗和甲型肝炎疫苗等多种病毒疫苗的研究与生产，现已很少使用。MRC-5是Jacobs于1966年从14周龄男性胎儿的肺组织中分离建立的，体外可传48代，经过多次检定其生物学特性均良好。因WI-38种子库存逐渐减少、部分种子细胞被发现存在污染，MRC-5则作为最适宜的细胞基质代替WI-38广泛应用于疫苗生产。 2BS和KMB-17细胞均为国内自主分离培养的人二倍体细胞株，其中，2BS是1973年，北京生物制品研究所于1973年从一个3月龄女胎肺组织分离建立的，体外可传63-65代，以其制备的水痘减毒活疫苗于2000年在上海问世；KMB-17是昆明医学生物研究所于1974 年从一个4月龄女胎的肺组织分离建立的，研究发现其至少对71种病毒敏感。KMB-17 主要用于脊髓灰质炎减毒活疫苗、甲型肝炎减毒活疫苗和灭活疫苗的研究和生产，以 KMB-17细胞株为细胞基质生产的甲型肝炎灭活疫苗和减毒活疫苗分别于2004年和2006 年在国内获批上市。
人二倍体细胞株因其良好的特性，在疫苗生产行业颇受欢迎，但是又存在一定的局限。第一，人二倍体细胞是来自正常人胚肺组织，不宜获得，且伦理审查严格。第二，从国外引进的WI-38细胞株因种子细胞发现有污染情况，现已很少使用；MRC-5细胞株的能提供代次普遍在20代以上，可使用空间较小；而2BS、KMB-17仅在自建单位及少数企业使用，很多科研及生产单位使用该细胞将受到诸多限制。第三，目前国内用于疫苗生产的二倍体细胞株有国外引进的WI-38、MRC-5和国内自主分离的 KMB-17、2BS，这几株细胞已使用五十年之久，导致细胞种子资源逐渐减少，已不能满足我国疫苗行业快速发展的需求。为此，我们将建立符合生产要求的新的人二倍体细胞系，为人二倍体细胞疫苗的研究和生产提供低代次的细胞资源。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了新的人胚肺细胞系，该细胞系可以用于人类病毒性疫苗研究和生产。本发明的人胚肺细胞系MU-L1于2022年6月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299 号武汉大学校内，保藏编号为CCTCC No:C2022196。
本发明是本申请人实验室于2021年6月从一个15周龄流产胚胎分离的人胚肺细胞，命名为MU-L1，已证实对水痘病毒敏感。本发明的人肺胚细胞系MU-L1CCTCC No:C2022196代次较低，为种子细胞P3代，解决现有人二倍体细胞资源逐渐减少、细胞代次相对较高的问题。
本发明的第一个目的是提供人胚肺细胞系MU-L1，其保藏编号为CCTCC No:C2022196。
本发明的第二个目的是提供上述人胚肺细胞系MU-L1的扩大培养方法，将人胚肺细胞系MU-L1加入到含有血清的培养基中进行培养，然后按照1:2-1:16的比例进行传代；所述培养基为MEM、DMEM、M199、DME/F12或PRMI1640；所述血清为胎牛血清或新生牛血清；所述培养条件为：37℃，5％CO2。
作为优选，所述培养基中含有4-10％的血清。
作为优选，所述培养基中含有8-10％的血清。
作为优选，按照1:4-1:8的比例进行传代培养。
作为优选，所述培养基为MEM、DMEM、或DME/F12。
作为优选，还包括将扩大培养的细胞进行冻存的步骤，人胚肺细胞系MU-L1 CCTCCNo:C2022196使用的细胞冻存液为70％MEM+20％胎牛血清+10％DMSO，传代后使用的细胞冻存液为70％MEM+20％新生牛血清+10％DMSO。
本发明的第三个目的是提供上述人胚肺细胞系MU-L1在培养病毒中的应用。可以预见，本申请的人胚肺细胞系MU-L1能够用于培养多种病毒，在本申请中，仅公开了用于培养水痘病毒的案例。
作为优选，采用直接接种法，在含人胚肺细胞系MU-L1的细胞维持液中接种水痘病毒进行培养；
作为进一步优选，所述培养为在36±1℃下培养；
在本申请中，因人胚肺细胞系MU-L1能够在各种常见培养基中生长，故对于细胞维持液没有具体要求，比如所述细胞维持液可以为MEM+2％新生牛血清。
本发明的第四个目的是提供一种培养水痘病毒的方法，采用直接接种法，在含人胚肺细胞系MU-L1的细胞维持液中接种水痘病毒进行培养；
作为进一步优选，所述培养为在36±1℃下培养；
作为进一步优选，所述细胞维持液为MEM+2％新生牛血清。
本发明提供的人胚肺细胞系MU-L1 CCTCC No:C2022196具有以下生物学特性：
(1)本发明的人胚肺细胞来源清晰。
(2)本发明的人胚肺细胞形态呈典型的成纤维样，长满单层后呈漩涡状生长。
(3)本发明的人胚肺细胞生长对培养基营养成分要求低，含8％～10％新生牛血清的 MEM培养基即生长良好。
(4)本发明的人胚肺细胞按1:4分种率传代，可传67代。
(5)本发明的人胚肺细胞经液氮冻存复苏后细胞活率均可保持在90％以上，且生长良好。
(6)本发明的人胚肺细胞未经发现细菌、真菌、支原体及内外源病毒因子污染。
(7)本发明的人胚肺细胞染色体为正常人二倍体核型，符合《中国药典》三部(2020版)人二倍体细胞染色体要求。
(8)本发明的人胚肺二倍体细胞裸鼠成瘤性试验结果为阴性，无成瘤性。
(9)本发明的人胚肺细胞对水痘病毒较现用的MRC-5细胞敏感。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为MU-L1细胞原代培养至12h(A)和48h(B)细胞状态(×100)。
图2为MU-L1细胞P3代冻存前(A)和复苏后(B)细胞状态(×100)。
图3为人胚肺细胞系MU-L1在不同培养基及血清条件下状态观察(×100)。
图4为人胚肺细胞系MU-L1在不同血清浓度条件下的最大增殖密度(A)、比生长速率(B)及倍增时间(C)。
图5为人胚肺细胞系MU-L1在不同传代比例下状态观察(×100)。
图6为人胚肺细胞系MU-L1在不同传代比例下的倍增时间(A)及比生长速率(B)。
图7为人胚肺细胞系MU-L1的P9、P37、P61及67代生长状态(×100)。
图8为人肺胚细胞系MU-L1 CCTCC No:C2022196支原体检查。其中，泳道M为Marker，泳道1为人肺胚细胞系MU-L1 CCTCC No:C2022196，泳道2为阴性对照，泳道 3为阳性对照。
图9中，A图为人肺胚细胞系MU-L1 CCTCC No:C2022196血吸附检查；B图为人肺胚细胞系MU-L1 CCTCC No:C2022196直接荧光抗体检查。
图10为人肺胚细胞系MU-L1 CCTCC No:C2022196染色体核型。
图11为人肺胚细胞系MU-L1 CCTCC No:C2022196成瘤性检查。
图12为人肺胚细胞系MU-L1 CCTCC No:C2022196对水痘病毒敏感性(72h)。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均购自常规生化试剂公司。
实施例1人胚肺细胞系的建立
1.材料：
胚胎：兰州市某医院人工流产的15周龄胚胎，其父母健康状况良好，父系及母系三代无明显遗传缺陷疾病史，该工作已通过西北民族大学伦理委员会审查。
培养基：MEM培养基
血清：胎牛血清(Gibco)，新生牛血清(兰州民海)
消化液：0.25％胰蛋白酶
细胞生长液：原代培养时为含15％胎牛血清的MEM培养基，P3代复苏后传代培养时为含10％新生牛血清的MEM培养基。
细胞冻存液：种子细胞(即P3代细胞)冻存时为70％MEM+20％胎牛血清+10％DMSO，后期传代培养过程中为70％MEM+20％新生牛血清+10％DMSO。
2.实验方法
2.1原代培养
人工流产手术后立即将胚胎样品置于无菌运输箱运输到细胞培养室，于超净工作台上取出胚胎样品，用PBS冲洗胚胎表面，然后用75％酒精浸泡3次，每次1min，晾干胚胎表面液体。
解剖胚胎样品胸腔，分离肺组织，PBS浸洗。用眼科剪将肺组织剪成1～3mm3的碎块，加入PBS漂洗至液体澄清，将组织碎块转入含玻璃珠的锥形瓶内，加入0.25％胰蛋白酶，37℃水浴20～30min。
消化结束，弃上清，加入细胞生长液终止消化，用力摇动锥形瓶进一步分离胚肺细胞，经100目细胞筛网过滤，收集细胞，1×105cells/cm2接种至T75细胞培养瓶若干个，加入含10％胎牛血清的MEM培养基，标记为P0代，置于培养箱培养，培养条件为：37℃， 5％CO2。细胞贴壁后更换细胞生长液继续培养至细胞长满单层。
2.2传代培养
原代培养细胞长成单层，弃掉原培养液，加入0.25％胰蛋白酶消化细胞至细胞间出现明显间隙后，弃掉胰酶继续消化至细胞脱落，加入细胞生长液终止消化，轻微吹打使细胞分散均匀，按1:2比例传代，标记为P1代，置于培养箱培养。P1代细胞长满单层，选择 4瓶生长状态较好的细胞，消化，按1:4比例传代，共16瓶，标记为P3代，置于培养箱培养(分离接种标为P0代，P0代1：2传代后标为P1代，P1代1：4传代后标P3代。二倍体细胞的代次标记规则，1个细胞分为2个细胞即生长一代，通常情况下，1瓶长满的细胞传到2个瓶中长满计为生长1代，1：4的计为2代)。
2.3细胞冻存
P3代细胞长满单层后，用0.25％胰蛋白酶消化并收集细胞，1000rpm/min离心5min，弃上清，加入细胞冻存液吹打成分散均匀的细胞悬液，分装至冻存管(1瓶T75冻4支)，4℃放2h，-80℃过夜，最终置于液氮中保存，经细胞检定合格后作为种子细胞备用。
2.4细胞复苏
取液氮中冻存的P3代细胞，37℃水浴快速解冻，于超净工作台上吹打均匀，取细胞悬液用台盼蓝染色法检查细胞活率，剩余细胞悬液接入T75细胞瓶，补充细胞生长液，放入培养箱培养，观察细胞生长状态。
3.实验结果
按照上述实验方法，成功分离了人胚肺细胞，命名为人胚肺细胞系MU-L1，P0代细胞经体外培养12h已贴壁，细胞形态呈多角形、梭形，分布均匀(见图1A)，培养基无污染浑浊现象，换细胞生长液继续培养至48h即形成单层，细胞呈长梭形，漩涡状排列(见图1B)。细胞传代至P3代，生长状态良好，呈典型的成纤维状，边界清晰(见图2A)，于P3代冻存了64支细胞，复苏活率(n＝3,
Figure BDA0003895583250000061
)为(97.81±0.28)％，生长状态良好，镜下观察细胞形态与冻存前无明显差异，72h即形成致密单层(见图2B)。
图1为MU-L1细胞原代培养至12h(A)和48h(B)细胞状态(×100)。
图2为MU-L1细胞P3代冻存前(A)和复苏后(B)细胞状态(×100)。
将P3代人胚肺细胞系MU-L1于2022年6月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏编号为 CCTCCNo:C2022196。
实施例2人胚肺细胞系MU-L1培养条件的研究
1.材料
细胞：人胚肺细胞系MU-L1。
细胞培养基：MEM、DMEM、M199、DME/F12和PRMI1640均为兰州百灵生物技术有限公司提供。
血清：胎牛血清，Gibco公司生产，简写：GF；胎牛血清和新生牛血清，兰州民海生物工程有限公司生产，分别简写：MF和MN。
2.实验方法
2.1培养基及血清
选择5种常用培养基(MEM、DMEM、M199、DME/F12和PRMI1640)和三种血清 (GF、MF和MN)，分别配置成含10％血清的细胞生长液。P9代人胚肺细胞系MU-L1 长成单层后用0.25％胰酶消化，按照1:4比例接种，补充对应细胞生长液培养，培养条件为：37℃，5％CO2。形成单层后均按1:4连续传代培养，连续传代培养3次后，观察细胞生长状态及致密程度。
2.2血清浓度
根据步骤2.1的实验结果，进一步选择3种培养效果较好的培养基(MEM、DMEM、DME/F-12)和新生牛血清分别配置成体积百分比10％、8％、6％和4％的细胞生长液。P25 代人胚肺细胞系MU-L1长满致密单层后用0.25％胰酶消化，加入培养基吹打使细胞分散均匀，1:4接种至T25细胞培养瓶，分别加入各组细胞培养液，置于培养箱培养，培养条件为：37℃，5％CO2。形成单层后均按1:4连续传代培养，适应培养3次。用对应的细胞生长液稀释至2×104cells/mL，分别接种于24孔培养板中培养，每孔1mL。每隔24h观察细胞状态并消化计数3孔，绘制生长曲线，计算倍增时间和对数生长期的比生长速率。
2.3传代比例
根据步骤2.2的实验结果，选择含10％新生牛血清MEM培养基进行传代比例研究。P13代人胚肺细胞系MU-L1长成单层后用0.25％胰酶消化，按1:2、1:4、1:8和1:16接种至T25细胞培养瓶，置于培养箱培养，培养条件为：37℃，5％CO2。每隔24h观察细胞状态，分别取3瓶消化计数后，计算倍增时间及对数生长期的比生长速率。
3.实验结果
MU-L1细胞在常用培养基及血清条件下均能生长良好，72h内均可长成致密单层，见图3。
MU-L1细胞随着血清浓度的降低，其最大增殖浓度降低(见图4A)，平均比生长速率减慢(见图4B)，倍增时间增加(见图4C)。MU-L1细胞在8％～10％新生牛血清浓度下最大增值浓度、倍增时间及比生长速率均无显著性差异(P>0.05)。
MU-L1细胞在传代比例为1：2、1：4、1：8、1：16时均能长成致密单层(见图5)，形成单层的时间分别为48h、72h、96h、120h。随着传代比例的增加，MU-L1细胞的倍增时间延长，分别为34.16±1.29、39.45±1.18、41.32±0.6和42.16±0.31(h)。1：2、1：4和 1：16传代比例下MU-L1细胞比生长速率无显著性差异(P>0.05)，1:8传代比例显著增加 (P<0.05)，见图6所示。
图3为人胚肺细胞系MU-L1在不同培养基及血清条件下状态观察(×100)。
图4为人胚肺细胞系MU-L1在不同血清浓度条件下的最大增殖密度(A)、比生长速率(B)及倍增时间(C)。
图5为人胚肺细胞系MU-L1在不同传代比例下状态观察(×100)。
图6为人胚肺细胞系MU-L1在不同传代比例下的倍增时间(A)及比生长速率(B)。
实施例3人胚肺细胞系MU-L1有限培养代次的研究
1.材料
细胞：人胚肺细胞系MU-L1
培养基：MEM(兰州百灵)
血清：新生牛血清(兰州民海)。
2.实验方法
在人胚肺细胞系MU-L1中加入含10％新生牛血清的MEM培养基置于培养箱培养，形成单层后按1：4的比例传代，即每传代一次，细胞培养代次增加2代，直至细胞不能形成致密单层，衰老死亡，细胞传代培养过程中观察细胞形态、生长状态及致密程度。
3.实验结果
人胚肺细胞系MU-L1生长特性符合人二倍体细胞特征(见图7)，P3至P45代时细胞生长活跃，边界清晰，呈典型长梭形，72h即可长成致密单层。P47代至P61代时细胞形成单层时间延长至96～144h，细胞体逐渐扁平、变大并出现细小颗粒。P61代以后细胞形成单层时间更长，细胞形态不佳、边缘不清晰、少许细胞胞质中可见空泡，细胞间间隙增大；P67代细胞边界模糊，呈网状排列，黑色颗粒增多，多次换液仍不能形成单层，无法继续传代，判定P67为MU-L1细胞有限培养代次。
图7为人胚肺细胞系MU-L1的P9、P37、P61及67代生长状态(×100)。
实施例4人胚肺细胞系MU-L1冻存及复苏活力的检测
1.材料：
细胞：人胚肺细胞系MU-L1
培养基：MEM(兰州百灵)
血清：新生牛血清(兰州民海)
0.4％台盼蓝(Sigma)
冷冻保护液：DMSO(Sigma)
细胞冻存液：70％MEM+20％新生牛血清+10％DMSO。
2.实验方法
2.1细胞冻存
人胚肺细胞有限培养代次研究过程中每传代5次冻存细胞。P9、P19、P29、P39、P49代人胚肺细胞长满单层，消化，收集细胞，1000rpm/min离心5min，弃上清，加入细胞冻存液吹打成分散均匀的细胞悬液，使用台盼蓝染色法检查细胞活率并分装至冻存管(1瓶 T75冻4支)，4℃放2h，-80℃过夜，最终置于液氮中保存。
2.2细胞复苏
取液氮中冻存的细胞，于37℃水中快速摇晃使其融化，于超净工作台上吹打均匀，取细胞悬液用台盼蓝染色法检查细胞活率，剩余细胞悬液接入T75细胞瓶，补充培养基，放入培养箱培养，观察细胞生长状态。
3.实验结果
MU-L1细胞于P9、P19、P29、P39、P49代冻存，冻存前及复苏后活率均保持90％以上，如表1所示。
表1 MU-L1细胞冻存前和复苏后活率检测(n＝3,
Figure BDA0003895583250000091
)
Figure BDA0003895583250000092
实施例5人胚肺细胞系MU-L1 CCTCC No:C2022196的细胞检定
1.材料
细胞：人肺胚细胞系MU-L1 CCTCC No:C2022196、指示细胞(Vero、MRC-5、MDBK)
培养基：胰酪大豆胨液体培养基、硫乙醇酸盐流体培养基、0.1％蛋白胨水溶液、精氨酸支原体肉汤培养基、支原体半流体培养基均购自北京三药。
病毒外源因子检查对照品：牛副流感病毒3型(PI-3)、牛腺病毒3型(BAV-3)、牛细小病毒(BPV)、呼肠孤病毒(REO)均购自ATCC，牛腹泻病毒(BVDV)来源于中国兽药监察所，狂犬病毒(RAB)为固定毒株CTN株。
荧光抗体结合物(PI-3、BAV-3、BPV、REO、BVDV和RAB)购自VMRD。
支原体PCR检测试剂盒购自杭州华安生物技术有限公司。
支原体阳性菌株购自上海汉尼生物技术有限公司。
2.实验方法
2.1无菌检查
采用直接镜检法和薄膜过滤法对人肺胚细胞系MU-L1 CCTCC No:C2022196进行无菌检查。直接镜检法，在细胞传代培养过程中用肉眼观察培养液颜色是否有异常和是否发生浑浊情况，用倒置生物显微镜观察细胞生长状态等途径进行初步检查。薄膜过滤法，按照《中国药典》三部(2020版)“通则1101无菌检查法”要求对MU-L1细胞进行无菌检查。
2.2支原体检查
采用培养法和PCR法对人肺胚细胞系MU-L1 CCTCC No:C2022196进行支原体检查。培养法，按照《中国药典》三部(2020版)“通则3301支原体检查法”要求对人肺胚细胞系MU-L1 CCTCC No:C2022196进行支原体检查。PCR法，MU-L1细胞单层融合率至 80％～90％时收集细胞，12000rpm/min离心，2～5min。参照试剂盒说明书进行PCR反应，取5μL扩增产物点样，1％琼脂糖凝胶，120V电泳20min，EB染色后紫外灯下观察条带，凝胶成像系统拍照。
2.3内外源病毒因子检查
按照《中国药典》三部(2020版)“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程”要求，对人肺胚细胞系MU-L1 CCTCC No:C2022196进行内、外源病毒因子检查。
2.4染色体检查
按照《中国药典》三部(2020版)“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程”要求，对人肺胚细胞系MU-L1 CCTCC No:C2022196进行染色体检查，并采用G显带染色法对人肺胚细胞系MU-L1 CCTCC No:C2022196进行核型分析。
2.5成瘤性检查
按照《中国药典》三部(2020版)“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程”要求，对人肺胚细胞系MU-L1 CCTCC No:C2022196进行成瘤性检查。
3.实验结果
人肺胚细胞系MU-L1 CCTCC No:C2022196的细菌和真菌检查结果为阴性，没有被支原体(见图8)和内、外源病毒因子污染(见图9)。
人肺胚细胞系MU-L1 CCTCC No:C2022196染色体核型为2n＝46，XX型，为正常的人二倍体核型(见图10)。
人肺胚细胞系MU-L1 CCTCC No:C2022196无成瘤性(见图11)。
图8为人肺胚细胞系MU-L1 CCTCC No:C2022196支原体检查。其中，泳道M为Marker，泳道1为人肺胚细胞系MU-L1 CCTCC No:C2022196，泳道2为阴性对照，泳道 3为阳性对照。
图9中，A图为人肺胚细胞系MU-L1 CCTCC No:C2022196血吸附检查；B图为人肺胚细胞系MU-L1 CCTCC No:C2022196直接荧光抗体检查。
图10为人肺胚细胞系MU-L1 CCTCC No:C2022196染色体核型。
图11为人肺胚细胞系MU-L1 CCTCC No:C2022196成瘤性检查。
实施例6人胚肺细胞系MU-L1 CCTCC No:C2022196的病毒敏感性检测
1.材料
细胞：人肺胚细胞系MU-L1 CCTCC No:C2022196、MRC-5(对照细胞)
水痘病毒株(Oka株)
细胞维持液：MEM+2％新生牛血清。
2.实验方法
采用直接接种法。人肺胚细胞系MU-L1 CCTCC No:C2022196形成单层，换成2％细胞维持液，接种水痘病毒(MOI＝0.01)，置于36℃培养箱培养，镜下观察细胞病变情况，初步检测人肺胚细胞系MU-L1 CCTCC No:C2022196对水痘病毒的敏感性。
3.实验结果
相同条件下水痘病毒Oka株分别感染人肺胚细胞系MU-L1 CCTCC No:C2022196和MRC-5细胞，人肺胚细胞系MU-L1 CCTCC No:C2022196细胞病变较快，且病变程度明显(见图12)，初步判断人肺胚细胞系MU-L1 CCTCC No:C2022196对水痘病毒Oka株较 MRC-5细胞高。
图12为人肺胚细胞系MU-L1 CCTCC No:C2022196对水痘病毒敏感性(72h)。
综上所述，本发明提供一种新的人胚肺细胞MU-L1，用含10％新生牛血清的MEM培养基培养，形成单层后按1：4的比例传代培养，可传67代，符合人二倍体细胞株的生命特征。实施例1冻存的P3代细胞(即人肺胚细胞系MU-L1 CCTCC No:C2022196)经复苏检定，没有被细菌、真菌、支原体和内、外源病毒因子污染，为正常人二倍体核型，无成瘤性，因此P3代细胞可作为种子细胞供建立主细胞库使用，接下来我们将建立数量都超过200支以上的P7代主细胞库和P11代工作细胞库。采用直接接种法接种水痘病毒Oka 株，发现本发明的人肺胚细胞系MU-L1 CCTCC No:C2022196较现用的MRC-5敏感。本发明的人肺胚细胞系MU-L1CCTCC No:C2022196有望作为细胞基质用于病毒疫苗的研究和生产。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.人胚肺细胞系MU-L1，其保藏编号为CCTCC No:C2022196。
2.权利要求1所述的人胚肺细胞系MU-L1的扩大培养方法，其特征在于：将人胚肺细胞系MU-L1加入到含有血清的培养基中进行培养，然后按照1:2-1:16的比例进行传代；所述培养基为MEM、DMEM、M199、DME/F12或PRMI1640；所述血清为胎牛血清或新生牛血清；所述培养条件为：37℃，5％CO2。
3.根据权利要求2所述的扩大培养方法，其特征在于：所述培养基中含有4-10％的血清。
4.根据权利要求2所述的扩大培养方法，其特征在于：所述培养基中含有8-10％的血清。
5.根据权利要求2所述的扩大培养方法，其特征在于：按照1:4-1:8的比例进行传代培养。
6.根据权利要求2所述的扩大培养方法，其特征在于：所述培养基为MEM、DMEM、或DME/F12。
7.根据权利要求2所述的扩大培养方法，其特征在于：还包括将扩大培养的细胞进行冻存的步骤，人胚肺细胞系MU-L1 CCTCC No:C2022196使用的细胞冻存液为70％MEM+20％胎牛血清+10％DMSO，传代后使用的细胞冻存液为70％MEM+20％新生牛血清+10％DMSO。
8.权利要求1所述的人胚肺细胞系MU-L1在培养病毒中的应用；作为优选，所述病毒为水痘病毒。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述应用具体为：采用直接接种法，在含人胚肺细胞系MU-L1的细胞维持液中接种水痘病毒进行培养；
作为优选，所述培养为在36±1℃下培养；
作为优选，所述细胞维持液为MEM+2％新生牛血清。
10.一种培养水痘病毒的方法，其特征在于：采用直接接种法，在含人胚肺细胞系MU-L1的细胞维持液中接种水痘病毒进行培养；
作为优选，所述培养为在36±1℃下培养；
作为优选，所述细胞维持液为MEM+2％新生牛血清。
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