CN115605270A

CN115605270A - 物理混合ha-胶原蛋白皮肤填充物

Info

Publication number: CN115605270A
Application number: CN202080096634.5A
Authority: CN
Inventors: 约西夫·施特雷因; 俞小洁; 达林·J·梅西纳; 朱莉·莫雷尔; 弗洛朗·迪里厄; 让-哈维尔·罗卡·马丁内斯
Original assignee: Allergan Inc
Current assignee: Allergan Inc
Priority date: 2019-12-26
Filing date: 2020-12-28
Publication date: 2023-01-13
Also published as: EP4081312A1; JP2023508448A; CA3166012A1; WO2021134084A1; US20230042665A1; AU2020413349A1; JP2024105358A; AU2020413349B2; BR112022012721A2; JP7481453B2; MX2022008064A

Abstract

本公开涉及包含与胶原蛋白物理混合的交联透明质酸的组合物。还考虑了改善人体解剖特征的美学质量的方法。

Description

物理混合HA-胶原蛋白皮肤填充物

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年12月26日提交的美国专利申请第62/953,925号的优先权，该申请的全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本公开涉及组合物和组合物的制造方法，所述组合物包含用作填充物的与胶原蛋白混合的透明质酸。其他方法包括治疗组织内体积不足的方法。

背景技术

本文所述的实施方案涉及皮肤填充物组合物，更具体地涉及包含与胶原蛋白物理混合的透明质酸的皮肤填充物组合物。

皮肤老化随时间而发生，并且会因多种因素而加剧，例如阳光暴露(UVA和UVB射线)、遗传和不良的个人习惯(如吸烟、饮酒和不良饮食习惯)。随着皮肤老化，皮肤可能会感觉和看起来更粗糙，皮肤也可能开始变薄并变得缺乏弹性。

透明质酸(hyaluronan，也称为hyaluronic acid，缩写HA)是一种非硫酸化的糖胺聚糖，其广泛分布于人体的结缔组织、上皮组织和神经组织中。透明质酸在皮肤的不同层中含量丰富，它的作用是确保良好的水合作用，协助细胞外基质的组织，充当空间填充物；并参与组织修复机制。然而，随着年龄的增长，皮肤中存在的透明质酸、胶原蛋白、弹性蛋白和其他基质聚合物的数量会减少。例如，反复暴露在来自太阳的紫外线下会导致真皮细胞减少其透明质酸的产生并增加其降解速度。这种透明质酸的损失会导致各种皮肤状况，例如皮肤干燥、皱纹、瑕疵、缺陷和皮肤厚度减少。

机体还具有在肌腱、肌肉、骨骼、皮肤和韧带中发现的内源性胶原蛋白。然而，随着时间的推移，由于暴露于紫外线、烟草和酒精以及老化过程，体内的胶原蛋白成分可能会丢失。皮肤中的胶原蛋白减少会导致皮肤失去弹性、皮肤厚度减少、形成皱纹和下垂。

因此，人们对解决衰老问题的外科治疗和非外科治疗越来越感兴趣。非手术治疗包括肉毒杆菌毒素注射和软组织填充物注射，这是面部年轻化最常进行的程序。

皮肤填充物已被用于治疗体积不足、抚平皱纹的外观、矫正面部不对称以及塑造面部和身体其他部位的轮廓。成果可能会持续几个月到两年，具体取决于填充物注射的位置和患者；然而，填充物的效果是暂时的，需要后续处理才能保持所需的美学效果。

在约20年前开发了基于透明质酸(HA)的填充物，并且用这种填充物进行的治疗是美容皮肤病学实践中最常进行的程序之一。HA填充物的一个主要优点是通过生物技术方法生产的HA在化学上与人体自然产生的HA相同，因此很少引起过敏反应。由于机体的内源性酶和清除作用，HA易于在组织中发生酶降解，因此，HA可以交联或以其他方式改性以延长填充物的停留时间。此外，由于HA易受透明质酸酶的酶促降解，因此HA填充物可以迅速降解，并且在发生不良事件的情况下，通过用外源性透明质酸酶进行处理可以逆转填充效果。因此，HA填充物对许多患者来说是有吸引力的选择，因为HA治疗的矫正效果持久且HA填充物具有良好的安全性。

除了许多优点之外，HA填充物还具有若干缺点。一个这样的缺点是丁达尔效应，一种在某些表面HA填充物注射部位可以看到的蓝色调。由于HA是亲水性的并且会吸收水分，因此注射部位也会发生肿胀。还应注意，交联度越高，HA可能具有的炎症和肉芽肿形成的风险就越高。

在HA填充物出现在市场上之前，胶原蛋白填充物在十九世纪八十年代被引入市场。胶原蛋白作为填充材料具有若干有利的特性。例如，胶原蛋白填充物是不透明的，因此将这些材料注射到皮肤下不会导致如HA填充物所见的丁达尔效应。此外，胶原蛋白可以充当支架并支持组织向内生长到填充材料中。然而，胶原蛋白填充物并非没有缺点。填充物制剂中需要高胶原蛋白浓度才能达到所需的填充效果，尽管这些胶原蛋白的浓度很高，但材料的丰盈和皱纹填充能力低于HA填充物。此外，皱纹矫正的持续时间已被证明只有3至6个月，而且这些填充物是不可逆的，因为不存在可用于降解胶原蛋白材料的酶处理。

因此，需要提供具有HA和胶原蛋白填充物两者的优点的皮肤填充物。如本文的实施方案中所述，本发明提供了组合物，其在注射时提供提升和体积，同时提供胶原蛋白和HA填充物的益处。

发明内容

因此，提供了新的皮肤填充物组合物，以及其制造方法。一些实施方案包括由透明质酸和胶原蛋白制备的均质水凝胶组合物。一些实施方案还包括水凝胶组合物，其含有完全均匀混合的HA和/或胶原蛋白颗粒。一些实施方案还可以包括部分均质或异质的产品，其含有HA或胶原蛋白(例如胶原蛋白原纤维)的颗粒。这些组合物可以通过包括交联透明质酸从而产生交联透明质酸然后将交联透明质酸与胶原蛋白混合的方法来制备。

在第一个方面，提供了一种制备大分子基质的方法。该方法包括提供交联透明质酸、提供胶原蛋白、以及将胶原蛋白物理混合到交联透明质酸中，其中胶原蛋白在整个交联透明质酸中均质混合，从而形成大分子基质，其中大分子基质包含交联透明质酸且物理混合在胶原蛋白中。

在上述或下述实施方案中的各自中的任何一个或任何一个的一些实施方案中，胶原蛋白以可溶状态作为溶液提供。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何一个的一些实施方案中，胶原蛋白以溶液形式提供，其中胶原蛋白溶液的pH为约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意pH，并且其中胶原蛋白在酸性pH下是可溶的。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何一个的一些实施方案中，胶原蛋白以酸性pH溶液的形式提供，其中胶原蛋白溶液的pH为约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意pH，并且其中胶原蛋白在酸性pH下是可溶的。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，胶原蛋白以中性pH溶液的形式提供。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，胶原蛋白和交联透明质酸与缓冲液物理混合。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，缓冲液包括PBS。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，方法还包括在将胶原蛋白完全均质混合在交联透明质酸中之后，将大分子基质中和至约7的pH。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，该方法还包括在将胶原蛋白与交联透明质酸物理混合之前将胶原蛋白中和至约7的pH。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，在将胶原蛋白物理混合到交联透明质酸中之前中和胶原蛋白导致胶原蛋白沉淀成胶原蛋白原纤维或颗粒，其中胶原蛋白原纤维或颗粒进一步混合到交联透明质酸中，其中原纤维或颗粒在交联透明质酸中完全均质混合。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案中一些实施方案中，胶原蛋白以原纤维化胶原蛋白或胶原蛋白纤维的形式提供。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，其中胶原蛋白以原纤维化胶原蛋白的形式提供，并且其中胶原蛋白在中性或碱性pH下制备，从而产生胶原蛋白纤维的原纤维化胶原蛋白。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，用至少一种盐制备胶原蛋白以获得原纤维化胶原蛋白或胶原蛋白纤维。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，至少一种盐的浓度为：约20mM、约50mM、约100mM、约150mM、约200mM、约250mM、约300mM、约350mM、约400mM、约450mM或约500mM、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，至少一种盐包含阴离子，其中阴离子包含H₂PO^4-、SO₄ ^2-、Cl^-或SCN^-。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，至少一种盐包括NaCl、Na₂SO₄或Li₂SO₄。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，胶原蛋白在整个大分子基质中均质混合。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，交联透明质酸包含具有如下平均分子量的透明质酸组分：约10,000道尔顿、约20,000道尔顿、约30,000道尔顿、约40,000道尔顿、约50,000道尔顿、约60,000道尔顿、约70,000道尔顿、约80,000道尔顿、约90,000道尔顿、约100,000道尔顿、约200,000道尔顿、约300,000道尔顿、约400,000道尔顿、约500,000道尔顿、约600,000道尔顿、约700,000道尔顿、约800,000道尔顿、约900,000道尔顿、约1,000,000道尔顿、约1,100,000道尔顿、约1,200,000道尔顿、约1,300,000道尔顿、约1,400,000道尔顿、约1,500,000道尔顿、约1,600,000道尔顿、约1,700,000道尔顿、约1,800,000道尔顿、约1,900,000道尔顿、约2,000,000道尔顿、约2,100,000道尔顿、约2,200,000道尔顿、约2,300,000道尔顿、约2,400,000道尔顿、约2,500,000道尔顿、约2,600,000道尔顿、约2,700,000道尔顿、约2,800,000道尔顿、约2,900,000道尔顿、约3,000,000道尔顿、约3,100,000道尔顿、约3,200,000道尔顿、约3,300,000道尔顿、约3,400,000道尔顿、约3,500,000道尔顿、约3,600,000道尔顿、约3,700,000道尔顿、约3,800,000道尔顿、约3,900,000道尔顿、约4,000,000道尔顿、约4,100,000道尔顿、约4,200,000道尔顿、约4,300,000道尔顿、约4,400,000道尔顿、约4,500,000道尔顿、约4,600,000道尔顿、约4,700,000道尔顿、约4,800,000道尔顿、约4,900,000道尔顿、约5,000,000道尔顿、约5,100,000道尔顿、约5,200,000道尔顿、约5,300,000道尔顿、约5,400,000道尔顿、约5,500,000道尔顿、约5,600,000道尔顿、约5,700,000道尔顿、约5,800,000道尔顿、约5,900,000道尔顿、约6,000,000道尔顿、约6,100,000道尔顿、约6,200,000道尔顿、约6,300,000道尔顿、约6,400,000道尔顿、约6,500,000道尔顿、约6,600,000道尔顿、约6,700,000道尔顿、约6,800,000道尔顿、约6,900,000道尔顿、约7,000,000道尔顿、约7,100,000道尔顿、约7,200,000道尔顿、约7,300,000道尔顿、约7,400,000道尔顿、约7,500,000道尔顿、约7,600,000道尔顿、约7,700,000道尔顿、约7,800,000道尔顿、约7,900,000道尔顿、约8,000,000道尔顿、约8,100,000道尔顿、约8,200,000道尔顿、约8,300,000道尔顿、约8,400,000道尔顿、约8,500,000道尔顿、约8,600,000道尔顿、约8,700,000道尔顿、约8,800,000道尔顿、约8,900,000道尔顿、约9,000,000道尔顿、约9,100,000道尔顿、约9,200,000道尔顿、约9,300,000道尔顿、约9,400,000道尔顿、约9,500,000道尔顿、约9,600,000道尔顿、约9,700,000道尔顿、约9,800,000道尔顿、约9,900,000道尔顿或约10,000,000道尔顿、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意分子量。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，交联透明质酸包含透明质酸组分的混合物，透明质酸组分包含至少两种不同的分子量。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，该方法还包括将利多卡因添加到大分子基质中。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，利多卡因在基质中的浓度在0.15％(w/w)至0.45％(w/w)的范围之间。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，利多卡因在基质中的浓度在0.27％(w/w)至0.33％(w/w)的范围之间。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，利多卡因在基质中的浓度为约0.15％(w/w)、约0.17％(w/w)、约0.19％(w/w)、约0.21％(w/w)、约0.23％(w/w)、约0.25％(w/w)、约0.27％(w/w)、约0.29％(w/w)、约0.31％(w/w)、约0.33％(w/w)、约0.35％(w/w)、约0.37％(w/w)、约0.39％(w/w)、约0.41％(w/w)、约0.43％(w/w)或约0.45％(w/w)、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，利多卡因在基质中的浓度为约0.3％(w/w)。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，该方法还包括将未交联的HA添加到基质中。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，未交联的HA在基质内的浓度高达约5％(w/w)。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，未交联的HA在基质中的浓度为约0％(w/w)、约1％(w/w)、约2％(w/w)、约3％(w/w)、约4％(w/w)、约5％(w/w)、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，未交联的HA在基质中的浓度为约1％(w/w)。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，未交联的HA在基质中的浓度为2％(w/w)。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，未交联的HA在基质中的浓度为约5％(w/w)。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，未交联的HA改善了基质的可挤出性。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，大分子基质具有增强的通过针的可挤出性，其中针包括27G、28G、29G、30G、31G或32G的计量尺寸。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，大分子基质在至少6个月是稳定的。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，大分子基质在约6、约9、约12、约15、约18、约21、约24、约27、约30、约33或约36个月、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意时间量是稳定的。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，大分子基质在约4℃至约25℃之间的温度下是稳定的。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，大分子基质在约4℃、约5℃、约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意温度下是稳定的。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，大分子基质在4℃是稳定的。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，大分子基质在约25℃是稳定的。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，大分子基质在约3、约6、约9、约12、约15、约18、约21、约24、约27、约30、约33、约36个月或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意时间量内具有最小的降解。。

在第二方面，提供了一种制备大分子基质的方法。该方法包括将透明质酸溶解在水溶液中以形成预反应水溶液并制备第二溶液，其中第二溶液包含水溶性碳二亚胺；和N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基磺基琥珀酰亚胺；或在氢氧化钠存在下的透明质酸钠溶液中的1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)；将第二溶液加入到预反应水溶液中以形成交联反应混合物；交联透明质酸，其中交联反应混合物通过交联透明质酸反应，从而形成交联透明质酸；以及提供胶原蛋白，并将胶原蛋白物理混合到交联透明质酸中，从而产生包含交联透明质酸和胶原蛋白的大分子基质，其中胶原蛋白在整个交联透明质酸中均质混合。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，第二溶液包含水溶性碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基磺基琥珀酰亚胺，其中透明质酸与天然存在的胺交联，从而形成交联透明质酸。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，第二溶液包含水溶性碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基磺基琥珀酰亚胺，并且其中交联在MES的存在下进行。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，第二溶液包含在氢氧化钠存在下的透明质酸钠溶液中的1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)，并且其中BDDE用于使用环氧化物化学交联透明质酸。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，物理混合步骤在缓冲液的存在下进行。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，缓冲液包括PBS。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，胶原蛋白以胶原蛋白溶液的形式提供，其中胶原蛋白溶液的pH为：约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0、约6.5或约7.0、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意pH，并且其中胶原蛋白在酸性pH下是可溶的。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，胶原蛋白以酸性pH溶液的形式提供，其中胶原蛋白溶液的pH为约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意pH，并且其中胶原蛋白在酸性pH下是可溶的。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，胶原蛋白以胶原蛋白溶液的形式提供，其中胶原蛋白溶液的pH为约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0、约6.5或约7.0或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意pH，并且其中胶原蛋白在酸性pH下是可溶的。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，胶原蛋白以酸性至中性pH提供。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，该方法还包括在将胶原蛋白均质混合在整个交联透明质酸中之后，将大分子基质中和至约7的pH。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，胶原蛋白以约pH 5至pH 7的溶液提供用于预纤维化。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，对于预纤维化，胶原蛋白以溶液的形式提供，该溶液的pH为约5.0、约5.5、约6.0、约6.5或约7、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意pH。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，该方法还包括在将胶原蛋白与交联透明质酸物理混合之前，将胶原蛋白中和至约7的pH，其中在将胶原蛋白物理混合到交联透明质酸中之前中和胶原蛋白导致胶原蛋白沉淀成胶原蛋白原纤维或颗粒，其中将胶原蛋白原纤维或颗粒进一步混合到交联透明质酸中，其中将原纤维或颗粒在整个交联透明质酸中均质混合。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，胶原蛋白以原纤维化胶原蛋白或胶原蛋白纤维的形式提供。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，胶原蛋白在碱性pH下制备，从而产生原纤维化胶原蛋白或胶原蛋白纤维。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，用至少一种盐制备胶原蛋白以获得原纤维化胶原蛋白或胶原蛋白纤维。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，至少一种盐的浓度为约20mM、约50mM、约100mM、约150mM、约200mM、约250mM、约300mM、约350mM、约400mM、约450mM或约500mM、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，至少一种盐包含阴离子，其中阴离子包含H₂PO^4-、SO₄ ^2-、Cl^-或SCN^-。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，至少一种盐包括NaCl、Na₂SO₄或Li₂SO₄。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，透明质酸包含透明质酸组分的混合物，该透明质酸组分包含至少两种不同的分子量。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，溶解步骤还包括将透明质酸和胶原蛋白两者溶解在水溶液中以形成包含透明质酸和胶原蛋白的预反应水溶液，其中交联反应通过将透明质酸和胶原蛋白两者交联成HA-胶原蛋白偶联凝胶而反应，并且其中混合步骤包括将HA-胶原蛋白偶联凝胶与另外的胶原蛋白物理混合，其中胶原蛋白处于可溶状态并且其中胶原蛋白在溶液中，其中溶液为酸性pH，从而产生包含物理混合在胶原蛋白中的HA-胶原蛋白偶联凝胶的大分子基质。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，胶原蛋白原纤维或胶原蛋白沉淀物在与胶原蛋白的混合步骤之后形成，并且其中胶原蛋白原纤维或胶原蛋白沉淀物在交联透明质酸中均质混合。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，胶原蛋白原纤维或胶原蛋白沉淀物在与胶原蛋白的混合步骤期间形成，并且其中胶原蛋白原纤维或胶原蛋白沉淀物在交联透明质酸内均质混合.

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，该方法还包括在将胶原蛋白混合在整个交联透明质酸中之后调节大分子基质的渗透压。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，混合步骤在室温下进行。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，混合步骤在约4℃进行。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，该方法在约4℃进行。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，该方法还包括纯化交联透明质酸或HA-胶原蛋白偶联凝胶，其中在与胶原蛋白混合的混合步骤之前进行纯化。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，使用透析纯化进行纯化。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，在交联完成后调节交联反应混合物的pH，其中调节pH在纯化步骤之前进行，并且其中将pH调节至约7.0、约7.2、约7.4、约7.6或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意pH。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，纯化在约2℃至约8℃之间的范围之间进行。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，在约2℃、约4℃、约6℃或约8℃、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意温度下进行纯化。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，该方法还包括在与胶原蛋白混合之前对交联透明质酸或HA-胶原蛋白偶联凝胶进行灭菌，其中在纯化步骤之后进行灭菌步骤。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，灭菌步骤包括将交联透明质酸或HA-胶原蛋白偶联凝胶转移到容器中，以进行灭菌；以及对交联透明质酸或HA-胶原蛋白偶联凝胶进行灭菌。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，容器是注射器。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，灭菌是通过热(干热、蒸汽热、湿热灭菌)、辐射(即非电离，UV)、电离(粒子(例如β射线、γ射线、x射线)、电磁(例如电子束)、过滤)或终端灭菌。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，该方法还包括透析交联的大分子基质或HA-胶原蛋白偶联凝胶，其中透析是通过具有在约1000道尔顿至约100,000道尔顿之间的范围内的分子量截止值的膜进行的，并且其中透析是在灭菌之前进行的。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，透析在缓冲液中进行。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，透析在磷酸盐缓冲盐水或磷酸钠缓冲液中进行。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，缓冲液还包含NaCl和/或KCl。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，该方法还包括在交联反应完成后将交联透明质酸或HA-胶原蛋白偶联凝胶的pH升高至中性pH，其中升高pH在灭菌步骤之前进行。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，该方法还包括在交联反应完成后，将交联透明质酸或HA-胶原蛋白偶联凝胶的pH升高至约7.0、约7.2或约7.4、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意pH，其中在灭菌步骤之前进行pH的升高。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，第二溶液包含水溶性碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基磺基琥珀酰亚胺，并且其中添加和交联步骤是在约2℃和约22℃之间的温度下进行。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，添加和交联步骤在约2℃、约4℃、约6℃、约8℃、约10℃、约12℃、约14℃、约16℃、约18℃、约20℃、约22℃的温度、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意温度下进行。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，交联在约22℃进行。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，交联在约4℃进行

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，第二溶液包含在氢氧化钠存在下的透明质酸钠溶液中的1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)，并且其中添加和交联步骤在约45℃和约75℃之间进行。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，第二溶液包含在氢氧化钠存在下的透明质酸钠溶液中的1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)，并且其中添加和交联步骤在约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃的温度下、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意温度下进行。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，第二溶液包含在氢氧化钠存在下的透明质酸钠溶液中的1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)，并且其中添加和交联步骤在约50℃的温度下进行。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，该方法还包括停止交联步骤，其中停止步骤包括向交联反应混合物中添加碱至pH为约8至约10达至少约10分钟，然后向交联混合物中添加酸性溶液直至达到约7的pH。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，交联反应混合物包含约4.0或约10.0之间的pH。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，交联反应混合物的pH在约4.0或约6.0之间。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，第二溶液包含在氢氧化钠存在下的透明质酸钠溶液中的1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)，并且其中交联在碱性条件下进行。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，预反应溶液包含盐，其中该盐的浓度为约50mM、约75mM、约100mM、约125mM、约150mM、约175mM、约200mM、约225mM、约250mM、约275mM、约300mM、325mM、约350mM、约375mM、约400mM、约425mM、约450mM、约475mM、约500mM或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，水溶性碳二亚胺是1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，并且其中在交联反应混合物中水溶性碳二亚胺的浓度为约20mM至约300mM。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，水溶性碳二亚胺为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，浓度为约20mM、约40mM、约60mM、约80mM、约100mM、约120mM、约140mM、约160mM、约180mM、约200mM、约220mM、约240mM、约260mM、约280mM、约300mM或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，水溶性碳二亚胺和透明质酸的水溶性碳二亚胺:透明质酸重复单元的摩尔比为约0.3至约3.0。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，水溶性碳二亚胺和透明质酸的水溶性碳二亚胺:透明质酸重复单元的摩尔比为约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9或约3.0、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意摩尔比。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，赖氨酸和透明质酸的摩尔:摩尔(赖氨酸:HA重复单元)比在约0.01至约0.6之间。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，赖氨酸和透明质酸的摩尔:摩尔(赖氨酸:HA重复单元)比为约0.01、约0.02、约0.03、约0.04、约0.05、约0.06、约0.07、约0.08、约0.09、约0.10、约0.11、约0.12、约0.13、约0.14、约0.15、约0.16、约0.17、约0.18、约0.19、约0.2、约0.21、约0.22、约0.23、约0.24、约0.25、约0.26、约0.27、约0.28、约0.29、约0.3、约0.31、约0.32、约0.33、约0.34、约0.35、约0.36、约0.37、约0.38、约0.39、约0.4、约0.41、约0.42、约0.43、约0.44、约0.45、约0.46、约0.47、约0.48、约0.49、约0.5、约0.51、约0.52、约0.53、约0.54、约0.55、约0.56、约0.57、约0.58、约0.59、约0.6或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意摩尔比。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，在添加第二溶液之前，预反应溶液中的透明质酸水合至少60分钟。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，反应混合物的交联进行约4小时至约24小时。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，该方法还包括将利多卡因添加到大分子基质中。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，利多卡因在基质中的浓度在约0.15％(w/w)至约0.45％(w/w)的范围之间。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，利多卡因在基质中的浓度在约0.27％(w/w)至约0.33％(w/w)的范围之间。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，利多卡因在基质中的浓度为约0.15％(w/w)、约0.17％(w/w)、约0.19％(w/w)、约0.21％(w/w)、约0.23％(w/w)、约0.25％(w/w)、约0.27％(w/w)、约0.29％(w/w)、约0.31％(w/w)、约0.33％(w/w)、约0.35％(w/w)、约0.37％(w/w)、约0.39％(w/w)、约0.41％(w/w)、约0.43％(w/w)或约0.45％(w/w)、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，利多卡因在基质中的浓度为约0.3％(w/w)。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，该方法还包括将未交联的HA添加到基质中。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，未交联的HA在基质内的浓度高达约5％(w/w)。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，未交联的HA在基质中的浓度为约0％(w/w)、约1％(w/w)、约2％(w/w)、约3％(w/w)、约4％(w/w)、约5％(w/w)、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，未交联的HA在基质中的浓度为约1％(w/w)。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，未交联的HA在基质中的浓度为约2％(w/w)。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，未交联的HA在基质中的浓度为约5％(w/w)。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，未交联的HA改善了基质的可挤出性。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，该方法包括在形成包含交联透明质酸和胶原蛋白的大分子基质之后或在形成具有物理混合的胶原蛋白的HA-胶原蛋白偶联凝胶之后进行的中和步骤，其中中和步骤包括将大分子基质调节至生理pH和生理盐浓度。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，中和包括在无菌条件下的混合步骤之后添加碱性溶液或缓冲溶液以调节pH。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，调节pH和生理盐浓度导致胶原蛋白沉淀成原纤维或颗粒，其中胶原蛋白原纤维或颗粒均质分布在大分子基质中。

在第三方面，提供了一种大分子基质，其中大分子基质由本文所述的任一项实施方案制备。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，大分子基质包含交联透明质酸，其中胶原蛋白与交联透明质酸物理混合，并且其中胶原蛋白在整个大分子复合物中是均质的。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，胶原蛋白在整个大分子复合物中均匀混合。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，大分子基质包含HA-胶原蛋白偶联凝胶，其中HA-胶原蛋白偶联凝胶还包括未交联到HA-胶原蛋白偶联凝胶的物理混合的胶原蛋白。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，大分子基质还包含利多卡因。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，利多卡因在基质中的浓度在约0.15％(w/w)至约0.45％(w/w)的范围内。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，利多卡因在基质中的浓度在约0.27％(w/w)至约0.33％(w/w)的范围内。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，利多卡因在基质中的浓度为约0.15％(w/w)、约0.17％(w/w)、约0.19％(w/w)、约0.21％(w/w)、约0.23％(w/w)、约0.25％(w/w)、约0.27％(w/w)、约0.29％(w/w)、约0.31％(w/w)、约0.33％(w/w)、约0.35％(w/w)、约0.37％(w/w)、约0.39％(w/w)、约0.41％(w/w)、约0.43％(w/w)或约0.45％(w/w)、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，利多卡因在基质中的浓度为约0.3％(w/w)。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，基质还包含未交联的HA。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，未交联的HA在基质内的浓度高达5％(w/w)。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，未交联的HA在基质中的浓度为约0％(w/w)、约1％(w/w)、约2％(w/w)、约3％(w/w)、约4％(w/w)、约5％(w/w)、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，未交联的HA在基质中的浓度为约1％(w/w)。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，未交联的HA在基质中的浓度为约2％(w/w)。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，未交联的HA在基质中的浓度为约5％(w/w)。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，未交联的HA改善了基质的可挤出性。

在第四方面，提供了一种大分子基质，其中通过在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的任何一些实施方案中所述的方法制备所述大分子基质。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，该方法还包括在将胶原蛋白添加到交联的HA中之前浓缩胶原蛋白。

在第五方面，提供了一种大分子基质，其中大分子基质包含：透明质酸，其中透明质酸是交联的；和胶原蛋白；其中胶原蛋白与交联透明质酸物理混合。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，大分子基质还包含利多卡因。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，利多卡因在基质中的浓度在约0.15％(w/w)至约0.45％(w/w)的范围之间。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，利多卡因在基质中的浓度在约0.27％(w/w)至约0.33％(w/w)的范围之间。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，利多卡因在基质中的浓度为约0.15％(w/w)、约0.17％(w/w)、约0.19％(w/w)、约0.21％(w/w)、约0.23％(w/w)、约0.25％(w/w)、约0.27％(w/w)、约0.29％(w/w)、约0.31％(w/w)、约0.33％(w/w)、约0.35％(w/w)、约0.37％(w/w)、约0.39％(w/w)、约0.41％(w/w)、约0.43％(w/w)或约0.45％(w/w)、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，利多卡因在基质中的浓度为0.3％(w/w)。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，基质还包含未交联的HA。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，未交联的HA在基质内的浓度高达约5％(w/w)。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，未交联的HA在基质中的浓度为约0％(w/w)、约1％(w/w)、约2％(w/w)、约3％(w/w)、约4％(w/w)、约5％(w/w)、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，未交联的HA在基质中的浓度为约1％(w/w)。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，未交联的HA在基质中的浓度为约2％(w/w)。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，未交联的HA在基质中的浓度为约5％(w/w)。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，未交联的HA改善了基质的可挤出性。

在第六方面，提供了一种大分子基质，其中该大分子基质包括：HA-胶原蛋白偶联凝胶，其中HA-胶原蛋白偶联凝胶包括与胶原蛋白交联的透明质酸；和物理混合的胶原蛋白，其中物理混合的胶原蛋白不交联到HA-胶原蛋白偶联凝胶中，并且其中物理混合的胶原蛋白均匀混合在HA-胶原蛋白偶联凝胶中。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，大分子基质还包含利多卡因。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，利多卡因在基质中的浓度在约0.15％(w/w)至约0.45％(w/w)的范围之间。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，利多卡因在基质中的浓度在约0.27％(w/w)至约0.33％(w/w)的范围之间。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，利多卡因在基质中的浓度为约0.15％(w/w)、约0.17％(w/w)、约0.19％(w/w)、约0.21％(w/w)、约0.23％(w/w)、约0.25％(w/w)、约0.27％(w/w)、约0.29％(w/w)、约0.31％(w/w)、约0.33％(w/w)、约0.35％(w/w)、约0.37％(w/w))、约0.39％(w/w)、约0.41％(w/w)、约0.43％(w/w)或约0.45％(w/w)、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，利多卡因在基质中的浓度为约0.3％(w/w)。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，透明质酸与天然存在的胺交联。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，天然存在的胺来自赖氨酸。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，胶原蛋白来自牛胶原蛋白、海洋胶原蛋白、人胶原蛋白或猪胶原蛋白。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，胶原蛋白是重组人胶原蛋白。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，大分子基质的弹性模量(G′)为约100Pa、约200Pa、约300Pa、约400Pa、约500Pa、约600Pa、约700Pa、约800Pa、约900Pa、约1000Pa、约1100Pa、约1200Pa、约1300Pa、约1400Pa、约1500Pa、约1600Pa、约1700Pa、约1800Pa、约1900Pa、约2000Pa、约2100Pa、约2200Pa、约2300Pa、约2400Pa、约2500Pa、约2600Pa、约2700Pa、约2800Pa、约2900Pa或约3000Pa、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意值。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，大分子基质的压缩力值为约10gmf、约20gmf、约30gmf、约40gmf、约50gmf、约60gmf、约70gmf、约80gmf、约90gmf、约100gmf、约110gmf、约120gmf、约130gmf、约140gmf、约150gmf、约160gmf、约170gmf、约180gmf、约190gmf、约200gmf、约210gmf、约220gmf、约230gmf、约240gmf、约250gmf、约260gmf、约270gmf、约280gmf、约290gmf、约300gmf、约310gmf、约320gmf、约330gmf、约340gmf、约350gmf、约360gmf、约370gmf、约380gmf、约390gmf、约400gmf、约410gmf、约420gmf、约430gmf、约440gmf、约450gmf、约460gmf、约470gmf、约480gmf、约490gmf、约500gmf、约510gmf、约520gmf、约530gmf、约540gmf、约550gmf、约560gmf、约570gmf、约580gmf、约590gmf或约600gmf、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意压缩力值。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，透明质酸的浓度为约2mg/mL、约4mg/mL、约6mg/mL、约8mg/mL、约10mg/mL、约12mg/mL、约14mg/mL、约16mg/mL、约18mg/mL、约20mg/mL、约22mg/mL、约24mg/ml、约26mg/mL、约28mg/mL、约30mg/mL、32mg/mL、约34mg/mL或约36mg/mL、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，透明质酸与胶原蛋白的重量比为约20:3、约24:2.3、约24:10、约24:12、约24:4、约24:6、约28:6或约28:11。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，透明质酸包含透明质酸的混合物，其中该混合物包含具有两种不同分子量的HA的50:50共混物。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，胶原蛋白包括I型胶原蛋白和/或III型胶原蛋白。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，胶原蛋白的浓度为约1mg/mL、约2mg/mL、约3mg/mL、约4mg/mL、约6mg/mL、约7mg/mL、约8mg/mL、约9mg/mL、约10mg/mL、约11mg/mL、约12mg/mL、约13mg/mL、约14mg/mL或约15mg/mL、约16mg/mL、约17mg/mL、约18mg/mL、约19mg/mL、约20mg/mL、约21mg/mL、约22mg/mL、约23mg/mL、约24mg/mL、约25mg/mL或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，大分子基质的渗透压在250mOsm/kg至350mOsm/kg之间。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，大分子基质的渗透压为约250mOsm/kg、约275mOsm/kg、约300mOsm/kg、约325mOsm/kg或约350mOsm/kg、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意渗透压。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，透明质酸是线性的。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，大分子基质的粘性模量(G")为约10Pa、约20Pa、约30Pa、约40Pa、约50Pa、约60Pa、约70Pa、约80Pa、约90Pa、约100Pa、约200Pa、约300Pa、约400Pa、约500Pa、约600Pa、约700Pa、约800Pa、约900Pa或约1000Pa、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意粘性模量(G")。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，大分子基质的介质损耗角正切值(G"/G′)为约0.01、约0.02、约0.03、约0.04、约0.05、约0.06、约0.07、约0.08、约0.09、约0.1、约0.12、约0.14、约0.16、约0.18、约0.20、约0.22、约0.24、约0.26、约0.28、约0.30、约0.32、约0.34、约0.36、约0.38、约0.40、约0.42、约0.44、约0.46、约0.48、约0.50或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意介质损耗角正切值(G"/G′)。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，大分子基质的pH为约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意pH。

在第七方面，提供了一种改进人体解剖特征的美学质量的方法。该方法包括将组合物注射到人体组织中，从而改善解剖特征的美学质量；其中，组合物包含通过本文所述的任一实施方案的方法制备的大分子基质或本文所述的任一实施方案的大分子基质。

在第八方面，提供了一种提高人体解剖特征的美学质量的方法，该方法包括：将组合物注射到人体组织中，从而提高解剖特征的美学质量；其中组合物包含大分子基质，该大分子基质包含：交联透明质酸；赖氨酸；和胶原蛋白；其中胶原蛋白物理混合到交联透明质酸中。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，该方法不会在注射部位引起蓝色变色。

在第九方面，提供了一种通过将组合物注射到人体组织中以改善人体外观的方法，由此组合物促进从周围组织到注射的组合物中的细胞浸润和胶原蛋白沉积。该方法包括将组合物注射到人体组织中，由此改善解剖特征的美学质量；其中组合物包含交联大分子基质，该交联大分子基质包含：透明质酸、赖氨酸和胶原蛋白；其中透明质酸包括与胶原蛋白物理混合的交联透明质酸；并且其中注射有组合物的组织显示出与组合物的组织整合性。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，大分子基质还包含利多卡因。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，利多卡因在基质中的浓度在约0.15％(w/w)至约0.45％(w/w)的范围之间。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，利多卡因在基质中的浓度在约0.27％(w/w)至约0.33％(w/w)的范围之间。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，利多卡因在基质中的浓度为约0.15％(w/w)、约0.17％(w/w)、约0.19％(w/w)、约0.21％(w/w)、约0.23％(w/w)、约0.25％(w/w)、约0.27％(w/w)、约0.29％(w/w)、约0.31％(w/w)、约0.33％(w/w)、约0.35％(w/w)、约0.37％(w/w)、约0.39％(w/w)、约0.41％(w/w)、约0.43％(w/w)或约0.45％(w/w)、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，利多卡因在基质中的浓度为0.3％(w/w)。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，基质还包含未交联的HA。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，未交联的HA在基质内的浓度高达约5％(w/w)。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，未交联的HA在基质中的浓度为0％(w/w)、约1％(w/w)、约2％(w/w)、约3％(w/w)、约4％(w/w)或约5％(w/w)、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，未交联的HA在基质中的浓度为约1％(w/w)。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，未交联的HA在基质中的浓度为约2％(w/w)。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，未交联的HA在基质中的浓度为约5％(w/w)。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，未交联的HA改善了基质的可挤出性。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，透明质酸组分具有如下的平均分子量：约10,000道尔顿、约20,000道尔顿、约30,000道尔顿、40,000道尔顿、约50,000道尔顿、约60,000道尔顿、约70,000道尔顿、约80,000道尔顿、约100,000道尔顿、约200,000道尔顿、约300,000道尔顿、约400,000道尔顿、约500,000道尔顿、约600,000道尔顿、约700,000道尔顿、约800,000道尔顿、约900,000道尔顿、约1,000,000道尔顿、约1,100,000道尔顿、约1,200,000道尔顿、约1,300,000道尔顿、约1,400,000道尔顿、约1,500,000道尔顿、约1,600,000道尔顿、约1,700,000道尔顿、约1,800,000道尔顿、约1,900,000道尔顿、约2,000,000道尔顿、约2,100,000道尔顿、约2,200,000道尔顿、约2,300,000道尔顿、约2,400,000道尔顿、约2,500,000道尔顿、约2,600,000道尔顿、约2,700,000道尔顿、约2,800,000道尔顿、约2,900,000道尔顿、约3,000,000道尔顿、约3,100,000道尔顿、约3,200,000道尔顿、约3,300,000道尔顿、约3,400,000道尔顿、约3,500,000道尔顿、约3,600,000道尔顿、约3,700,000道尔顿、约3,800,000道尔顿、约3,900,000道尔顿、约4,000,000道尔顿、约4,100,000道尔顿、约4,200,000道尔顿、约4,300,000道尔顿、约4,400,000道尔顿、约4,500,000道尔顿、约4,600,000道尔顿、约4,700,000道尔顿、约4,800,000道尔顿、约4,900,000道尔顿、约5,000,000道尔顿、约5,100,000道尔顿、约5,200,000道尔顿、约5,300,000道尔顿、约5,400,000道尔顿、约5,500,000道尔顿、约5,600,000道尔顿、约5,700,000道尔顿、约5,800,000道尔顿、约5,900,000道尔顿、约6,000,000道尔顿、约6,100,000道尔顿、约6,200,000道尔顿、约6,300,000道尔顿、约6,400,000道尔顿、约6,500,000道尔顿、约6,600,000道尔顿、约6,700,000道尔顿、约6,800,000道尔顿、约6,900,000道尔顿、约7,000,000道尔顿、约7,100,000道尔顿、约7,200,000道尔顿、约7,300,000道尔顿、约7,400,000道尔顿、约7,500,000道尔顿、约7,600,000道尔顿、约7,700,000道尔顿、约7,800,000道尔顿、约7,900,000道尔顿、约8,000,000道尔顿、约8,100,000道尔顿、约8,200,000道尔顿、约8,300,000道尔顿、约8,400,000道尔顿、约8,500,000道尔顿、约8,600,000道尔顿、约8,700,000道尔顿、约8,800,000道尔顿、约8,900,000道尔顿、约9,000,000道尔顿、约9,100,000道尔顿、约9,200,000道尔顿、约9,300,000道尔顿、约9,400,000道尔顿、约9,500,000道尔顿、约9,600,000道尔顿、约9,700,000道尔顿、约9,800,000道尔顿、约9,900,000道尔顿或约10,000,000道尔顿、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意重量。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，交联透明质酸的透明质酸包含透明质酸组分的混合物，透明质酸组分包含至少两种不同的分子量。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，其中注射有组合物的组织显示出与组合物的整合性，其中通过来自周围组织的细胞浸润而在组合物中沉积胶原蛋白。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，其中注射有组合物的组织显示出与组合物的整合性，并且在注射组合物后，在注射后的组合物中具有胶原蛋白沉积。

附图说明

图1显示了具有不同量的胶原蛋白和透明质酸的水凝胶的不同组合物的若干例子。对于含有约6.5mg/mL HA的凝胶和含有约12.7mg/mL透明质酸的凝胶，水凝胶的不透明度随着胶原蛋白浓度的增加而增加。

图2显示了HA-胶原蛋白水凝胶在25℃、频率为5Hz和两个直径为25mm、间隙长度为1mm的平行板之间的0.8％应变下的G′、G”和介质损耗角正切值。

图3显示了水凝胶制剂的溶胀。

图4显示了HA-胶原蛋白制剂的压缩力从2.5mm到0.9mm间隙的变化。

图5显示了使用1mL BD结核菌素注射器通过27G-¹/₂"针头的HA-胶原蛋白水凝胶的平均挤压力。

图6显示了植入大鼠模型中的BDDE交联的和天然存在的胺(NOA)交联的HA水凝胶样品随时间变化的平均高度，显示了NOA交联制剂随着HA浓度的增加而升高。

图7显示了植入大鼠模型中的BDDE交联和NOA交联的HA-胶原蛋白水凝胶样品随时间变化的平均高度，显示了胶原蛋白混合(<3mg/mL)对提升能力的影响。

图8显示了植入大鼠模型中的BDDE交联和NOA交联的HA-胶原蛋白水凝胶样品随时间变化的平均高度，显示了胶原蛋白混合(高达11mg/mL)对提升能力的影响。

图9显示了在BDDE交联和NOA交联的HA-胶原蛋白水凝胶上培养的人真皮成纤维细胞的细胞活力。*p<0.05，Tukey事后方差分析。

图10显示了在NOA水凝胶或NOA交联HA-胶原蛋白水凝胶(24mg/mL HA，6mg/mL胶原蛋白)上培养的人真皮成纤维细胞的细胞形态分析。*p<0.05，学生t检验。

图11显示了大鼠I型胶原蛋白的免疫组织化学，显示在含有3mg/mL胶原蛋白的20mg/mL HA水凝胶团注(bolus)中胶原蛋白沉积增加。

图12显示了大鼠I型胶原蛋白的免疫组织化学，显示了含有28mg/mL HA的水凝胶团注物中心的包封。添加有高达11mg/mL的胶原蛋白可适度改善沿水凝胶团注物外周的胶原蛋白沉积。

图13显示了大鼠I型胶原蛋白的免疫组织化学，显示随着胶原蛋白浓度的增加(2.3mg/mL至6mg/mL)，24mg/mL HA水凝胶团注物中的胶原蛋白沉积增加。含有24mg/mL HA和6mg/mL胶原蛋白(24NOA6CN)的制剂表现出最强的组织整合性(tissue integration)。

图14显示大鼠I型胶原蛋白的免疫组织化学，显示在大鼠皮下植入后4至12周，BDDE交联的HA和NOA交联的HA-胶原蛋白水凝胶内的胶原蛋白沉积/组织整合性。与仅含BDDE交联HA凝胶相比，含有24mg/mL HA和6mg/mL胶原蛋白(24NOA6CN)的制剂在4周和12周时表现出更强的组织整合性。在24NOA6CN制剂中，组织整合性似乎从4周改善到12周。

图15显示了到仅含BDDE交联HA水凝胶和24NOA6CN水凝胶中组织整合性的半定量组织病理学评分。评分系统：最佳整合性＝10，最差整合性＝-5。(A)胶体铁染色显示到24NOA6CN水凝胶团注物中增强的组织整合性和相关的组织病理学评分。(B)条形图显示仅含BDDE交联HA水凝胶和24NOA6CN在大鼠皮下植入4周和12周后的组织病理学评分。24NOA6CN凝胶在12周后表现出最高的组织整合性分数。

具体实施方式

诸如阳光暴露、遗传、疾病、损伤和生活方式等因素会破坏我们的下层组织并导致我们的皮肤发生不希望的变化，从而导致皱纹、褶皱和组织下垂，从而导致明显的衰老效应。这些变化在很大程度上可归因于脂肪组织和细胞外基质蛋白(如胶原蛋白和弹性蛋白)的损失。这些成分的损失会导致皮肤层变薄，再加上骨骼和肌肉结构的变化，会导致体积减少和皱纹形成。为了使皮肤恢复到以前的年轻外观，当前的方法旨在恢复皮肤的体积和增加皮肤的厚度。

皮肤填充物是可用于消除皱纹和恢复体积的许多治疗方法之一。注射后，皮肤填充物用于替代丢失的胶原蛋白和弹性蛋白，从而使皮肤变厚，提升组织并最终去除皱纹。皮肤填充物的作用是暂时的，并且随着时间的推移会逐渐消失。因此，需要后续注射来保持年轻的外观。

透明质酸(HA)皮肤填充物在去除皱纹方面非常有效，并且由于若干原因而主导市场。可以改进皮肤填充物以影响填充物在组织中的持续时间。非限制性地，例如改变皮肤填充物的交联等改进可以影响例如填充物在组织中的持续时间。

HA皮肤填充物除了持久的优点之外，其也是可逆的。可逆性是一项关键优势，尤其是在填充物放置不正确或发生不良事件(AE)(例如使得血管闭塞)时。例如，在AE的情况下，可以通过在受影响区域注射透明质酸酶来快速降解皮肤填充物。透明质酸酶是一种分解HA并将凝胶填充物转化为液体溶液的酶，该溶液可以从受影响的部位扩散开来。这些益处使HA皮肤填充物成为当今市场上最受欢迎的填充物之一。

尽管HA皮肤填充物具有很多优势，但它们的性能仍然可以得到改善。例如，HA填充物不会补充和/或显著刺激与年轻化相关的细胞外基质(ECM)蛋白的合成，例如胶原蛋白。此外，如果表面注射，HA皮肤填充物可能会导致AE，其表现为皮肤表面处的蓝色变色，称为丁达尔效应(Cohen等人.Understanding,avoiding,and managing dermal fillercomplications.Dermatol Surg,2008.34Suppl 1:p.S92-9；通过引用并入本文)。这是因为皮肤填充物中的透明颗粒会以某种方式散射光，从而导致蓝色色调。注射的HA产品以及注射的解剖区域都会影响出现丁达尔效应的可能性(Bailey等人，Etiology,prevention,andtreatment of dermal filler complications.Aesthet Surg J,2011.31(1):p.110-21；通过引用并入本文)。溶胀也可能是HA填充物需要关心的问题，因为HA具有极强的亲水性并强烈吸水。因此，随着水凝胶中HA浓度的增加或交联度的降低，水的吸收也会增加。例如，一些HA填充物在暴露于盐水时可以吸收超过其起始重量6倍的重量。水的吸收会导致溶胀，尤其是当填充物表面注射或注射到皮肤较薄的区域时。此外，市场上仅包含HA的可用填充物未显示出允许组织整合性。尽管存在这些问题，HA皮肤填充物仍因其性能而成为市场上最受欢迎的填充物。

胶原蛋白皮肤填充物于1981年被引入市场。胶原蛋白是这种应用的理想材料，因为它是皮肤的天然成分，赋予其强度、丰满度和质地。注射后，这些填充物会将胶原蛋白重新添加到皮肤中，从而补充与年轻化相关的ECM蛋白。此外，凝胶不会导致丁达尔效应。例如，推荐将

1和

1等胶原蛋白皮肤填充物注射到乳头状真皮中(Gold等人，Use of hyaluronic acid fillers for the treatment of the agingface.Clinical Interventions in Aging,2007.2(3):p.369-376；通过引用并入本文)。尽管它们是表面注射的，但材料的不透明外观阻止了对丁达尔效应的观察。因此，与基于HA的填充物相比，胶原蛋白填充物具有一些优势。

尽管有这些优势，但胶原蛋白填充物具有一些使HA填充物优选的缺点。例如，无法像HA填充物一样使用可注射的市售酶溶液逆转胶原蛋白填充物。为了达到预期效果，胶原蛋白皮肤填充物具有高浓度的胶原蛋白(35mg/mL至65mg/mL胶原蛋白)，并且如果发生不良反应，这种高浓度的胶原蛋白可能难以去除。此外，已经证明胶原蛋白皮肤填充物的持续时间有限，平均矫正时间为3到6个月。胶原蛋白的交联可以产生更坚固的水凝胶，该水凝胶可以放置在皮肤中更深处，并可以延长持续时间。然而，与未交联的胶原蛋白填充物相比，交联的胶原蛋白凝胶与体内存在的胶原蛋白相似度更低，因此不太自然。

在以下实施方案中，描述了由含有物理混合的胶原蛋白的HA填充物制成的混合材料的制备和表征。该材料利用了胶原蛋白和HA填充物所提供的优势，同时消除了每种材料单独存在的问题。

由于材料的混合性质，HA皮肤填充物的优势得以保留，而包含胶原蛋白积极地解决了其他问题。例如，由于向HA凝胶中添加胶原蛋白会产生不透明的制剂(参见实施例2和图1)，因此这可以解决丁达尔效应的问题。此外，胶原蛋白的加入使得能够产生高凝胶刚度而不改变溶胀特性。单独使用HA填充物，可以通过增加HA浓度或增加水凝胶网络的交联密度来增加G′(即刚度)。然而，增加HA浓度会导致溶胀增加，而交联度越高的凝胶溶胀性越低。因此，物理混合的HA胶原蛋白水凝胶的独特之处在于G′/刚度随着胶原蛋白浓度的增加而增加，而不影响溶胀特性(实施例3和4)。最后，由于胶原蛋白与年轻皮肤有关，注射与胶原蛋白混合的HA填充物组合物可以补充与年轻皮肤有关的ECM蛋白。与胶原蛋白混合的HA填充物也可用作注射后组织向内生长和新胶原蛋白沉积的支架。这种增强的组织整合性可能会转化为更自然、更持久的效果。因此，当胶原蛋白掺入HA皮肤填充物中时，它惊人地改善了最终产品的物理特性以及生物学性能。

同样，胶原蛋白皮肤填充物的缺点可以通过在制剂中包含HA皮肤填充物来解决。例如，可以通过使用与胶原蛋白混合的更持久的HA皮肤填充物来改善胶原蛋白填充物的短持续时间。此外，与胶原蛋白混合的HA填充物的制剂需要显著更少的胶原蛋白来实现所需的生物学效果，因此，由于组合物的HA部分可以使用注射的透明质酸酶降解，因此与仅有胶原蛋白的皮肤填充物相比，制剂的可逆性得到了增强。使用HA-胶原蛋白凝胶，填充效果是由HA皮肤填充物产生的。如果遇到AE，可以使用透明质酸酶降解HA，从而将材料变成液体并确保患者的安全。因此，与单独使用HA或胶原蛋白相比，具有胶原蛋白制剂的混合HA皮肤填充物具有显著优势。

如本文实施方案中所述，混合的HA和胶原蛋白组合物产生具有令人惊讶的有益特性的水凝胶。发现不同组合浓度的HA和胶原蛋白使得水凝胶能够实现提升和组织整合。在一些实施方案中，包含20mg/mL HA或24mg/mL HA的组合物产生组织中的良好提升。然而，其中浓度增加到至少28mg/mL的一些组合物产生改进的提升，但没有改进组织整合到注射部位的组织整合性。在一些实施方案中，组合物包含24mg/mL HA和6mg/mL的胶原蛋白。在一些实施方案中，组合物包含20mg/mL HA和10mg/mL胶原蛋白。在一些实施方案中，组合物产生组织提升以及增强的组织整合到组合物注射部位的组织整合性。在一些实施方案中，与仅有HA的凝胶相比，该组合物具有良好的提升和更高的组织整合性。

易于注射性也是皮肤填充物的关键特性，并且可以使用挤压力(EF)测量来量化。本质上，EF是施加到柱塞上以通过特定计量的针头挤出凝胶所需的力。易于注射的皮肤填充物的特征在于具有较小的挤压力和在注射器长度上平滑且均匀的挤压轮廓。<40N的力被认为是可接受的，并且在注射过程中易于注射、控制和精确。HA胶原蛋白制剂的平均挤压力基本上小于40N(参见实施例6)。在本文的一些实施方案中，大分子基质具有小于40N的挤压力。此外，挤压力曲线看起来平滑，表明材料是均质的。因此，HA胶原蛋白皮肤填充物易于通过细针头注射。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，大分子复合物还包含未交联的HA。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，未交联的HA在大分子复合物中的浓度为1％、2％或5％。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，未交联的HA使得易于挤出并降低了组合物的挤压力。

本文的这些实施方案具体描述了与胶原蛋白物理混合的HA皮肤填充物。或者，胶原蛋白可以与HA化学交联以形成不同类型的HA胶原蛋白凝胶。然而，与化学交联凝胶相比，物理混合凝胶含有的胶原蛋白更类似于天然组织中的胶原蛋白。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，组合物使皮肤质量得到改善，例如皮肤的水合作用、改善的弹性和减少的皮肤皱纹。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

如本文所用，“一个(a、an)”可表示一个或多于一个。如本文所用，当提及可测量值时，“约”是指包含与指定值相比+20％或+10％、更优选+5％、甚至更优选+1％、还更优选+0.1％的变化。

如本文所用，除非上下文另有要求，否则术语“包含(comprise)”和该术语的变体，例如“包含(comprising、comprises、comprised)”不旨在排除进一步的添加剂、组分、整体或步骤。

术语“透明质酸”或“HA”是一种非硫酸化糖胺聚糖，其广泛分布于整个人体的结缔组织、上皮组织和神经组织中。不受限制地，也可以使用这种透明质酸钠。透明质酸在皮肤的不同层中含量丰富，具有多种功能，例如，确保良好的水合作用、协助细胞外基质的组织、充当填充材料；并参与组织修复机制。然而，随着年龄的增长，皮肤中存在的透明质酸、胶原蛋白、弹性蛋白和其他基质聚合物的数量会减少。例如，反复暴露于紫外线(例如来自太阳的紫外线)会导致真皮细胞减少其透明质酸的产生以及增加其降解速率。这种透明质酸损失导致各种皮肤状况，例如不完美、缺陷、疾病和/或紊乱等。例如，皮肤中的水分含量与真皮组织中的透明质酸水平之间存在很强的相关性。随着皮肤老化，皮肤中透明质酸的数量和质量都会降低。这些变化会导致皮肤干燥和起皱。

HA可包括透明质酸及其任何透明质酸盐，包括例如透明质酸钠(钠盐)、透明质酸钾、透明质酸镁和透明质酸钙。来自多种来源的透明质酸可用于本文。例如，透明质酸可以从动物组织中提取，作为细菌发酵的产物收获或者通过生物工艺技术以商业数量生产。在本文所述的实施方案中，交联的透明质酸包含约10,000道尔顿至约10,000,000道尔顿的分子量。

“大分子基质”是指由与胶原蛋白物理混合的交联HA形成的基质。在一些实施方案中，大分子基质还包含与HA交联的胶原蛋白。

本文所述的“胶原蛋白”是一种结构蛋白，存在于体内的各种结缔组织中。任何类型的胶原蛋白都可以用于本文所述的方法和组合物中。在一些实施方案中，可以使用I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、III型胶原蛋白、IV型胶原蛋白、VI型胶原蛋白或者它们的组合。例如，胶原蛋白可以来源于细胞培养物、动物组织或重组方式，并且可以来源于人、猪、重组体或牛来源。一些实施方案包括源自人成纤维细胞培养物的胶原蛋白。一些实施方案包含已经变性为明胶的胶原蛋白。在大分子复合物的一些实施方案中，大分子复合物包含I型和/或III型胶原蛋白。

本领域技术人员将理解对不同来源的胶原蛋白的考虑。组织病理学上，牛胶原蛋白纤维可能比人胶原蛋白更粗，具有其间几乎没有空间的均质外观，成纤维细胞更少，并且不能折射偏振光。在注射牛或其他动物胶原蛋白产品之前可能需要进行皮肤测试。曾报道过罕见的过敏反应，包括牛胶原蛋白的异物肉芽肿和栅栏肉芽肿。罕见的全身并发症包括流感样症状、感觉异常或呼吸困难，并且在注射牛胶原蛋白后报告了严重的过敏性休克。因此，可能需要在注射前进行皮肤测试，以识别有过敏反应风险的患者及其短暂的作用时间。本领域技术人员将考虑在本文的实施方案中使用的胶原蛋白的类型并且将理解胶原蛋白来源之间的差异。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，组合物还包含HA颗粒或胶原蛋白的颗粒或原纤维。

如本文所述，“局部递送”是指将组合物施用到需要治疗组合物的组织中或附近。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，大分子基质被局部递送到患者身体上存在体积不足的区域中。

治疗方法

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，组合物作为注射剂施用到面部软组织中以增加面部特征的大小、形状和/或轮廓，例如增加嘴唇、脸颊或眼睛区域的大小、形状和/或轮廓；改变面部特征的大小、形状和/或轮廓，例如改变嘴唇、脸颊或眼睛区域形状的大小、形状和/或轮廓；减少或消除皮肤中的皱痕、皱褶或皱纹；抵抗皮肤中的皱痕、皱褶或皱纹；皮肤补水；增加皮肤弹性；减少或消除皮肤粗糙；增加和/或改善皮肤紧致度。非限制性地，这些区域可以包括例如眼睛区域、脸颊区域和/或颈部区域。

本领域技术人员会理解，在施用之前，可以使用无菌技术，例如用2％至4％的双氯苯双胍己烷或70％的异丙醇溶液对皮肤进行适当消毒，并避免在清洁患者的皮肤后污染治疗区域。应该使用一种注射方法，以减少皮肤穿刺的次数，并使用最小计量的可用针头进行注射。避免注射到发炎或感染的皮肤中也很重要。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，本文所述的组合物在递送和隔离胶原蛋白的同时在注射时提供即时提升和体积。在本文所述的实施方案中，这些方法为接受注射的患者提供了自然的外观效果。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，胶原蛋白不与交联的HA网络化学结合。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，HA组分是线性HA。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，HA使用EDC和NHS化学或BDDE交联的HA与天然存在的胺交联。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，天然存在的胺是赖氨酸。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，组合物刺激皮肤的必要结构单元(例如ECM蛋白)的合成。可以从注射组合物的组织刺激蛋白质(如胶原蛋白)的产生，但不限于此。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，治疗方法在透明质酸酶治疗后是可逆的。在不良反应期间或如果结果不利，可以提供透明质酸酶治疗。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，该组合物可用于表面消除细纹和深层(皮下和/或骨膜上)用于脸颊隆起以纠正面部中部与年龄相关的体积不足。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，治疗方法不会导致注射部位的丁达尔效应。

本领域技术人员将理解可将大分子基质施用于有需要的患者的不同方法。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，大分子基质用针或套管施用。

本文实施方案中使用的胶原蛋白可以从任何来源提供。非限制性地，例如，可以使用猪、牛、重组和人胶原蛋白。在一些实施方案中，组合物不需要过敏测试。

如本文所述，HA胶原蛋白皮肤填充物可在注射后提供即时提升和体积，同时递送和捕获胶原蛋白。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，组合物可以刺激必要结构单元的合成，从而得到看起来年轻和健康的皮肤。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，该方法在透明质酸酶处理后是可逆的。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，组合物允许增加模量(刚度)，同时不显著影响填充物的溶胀性质。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，该组合物可用于表面消除细纹和深纹(皮下和/或骨膜上)用于脸颊隆起以纠正面部中部与年龄相关的体积不足。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，组合物在填充物的整个寿命期间几乎不产生肉芽肿或不产生肉芽肿。因此，填充物不会导致皮肤或注射区域内出现“鹅卵石”外观。

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，组合物提供了以下益处，例如皮肤的水合作用和恢复活力。

水凝胶的制造方法

在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，制造水凝胶的方法包括提供：HA、胶原蛋白、水和PBS，并在酸性pH下混合。该方法中使用的HA可以是交联的。胶原蛋白可以由任何来源提供。非限制性地，胶原蛋白可以是猪胶原蛋白、人胶原蛋白或重组形式的胶原蛋白。

存在将胶原蛋白混合到透明质酸或上述混合物中的不同方法。本领域技术人员将理解制备水凝胶的多种方法。非限制性地，可以使用例如Thinky混合器、声学混合器、反应器、注射器-注射器混合、不锈钢筒将胶原蛋白混合到交联透明质酸中。

在上述或下述实施方案中任何一个的一些实施方案中，混合物的HA浓度为约5mg/mL、约10mg/mL、约15mg/mL、约20mg/mL、约24mg/mL，约28mg/mL、或在由任意两个上述值之间的范围内的任意浓度。在上述或下述实施方案中任何一个的一些实施方案中，混合物的HA浓度为约5mg/mL。在上述或下述实施方案中任何一个的一些实施方案中，混合物的HA浓度为约25mg/mL。

在一些实施方案中，其中HA浓度为约20mg/mL，组合物提供提升和组织整合。

在上述或下述实施方案中任何一个的一些实施方案中，组合物包含24mg/mL的HA和约6mg/mL的胶原蛋白。

在上述或下述实施方案中任何一个的一些实施方案中，组合物包含20mg/mL的HA和约10mg/mL的胶原蛋白

在上述或下述实施方案中任何一个的一些实施方案中，该方法还包括对组合物进行灭菌。有许多对水凝胶进行灭菌的方法，并且这些方法可以为本领域技术人员所理解。非限制性地，组合物可以例如通过热(干热、蒸汽热)、辐射(非电离、电离(粒子(如γ射线)、电磁(如电子束)、过滤)或终端灭菌(例如产品在其最终容器中的灭菌，如注射器)进行灭菌。在以上或以下实施方案中任一个的一些实施方案中，组合物可以通过热(干热、蒸汽热)、辐射(非电离、电离(粒子(如γ射线)、电磁(如电子束)、过滤或终端灭菌(例如产品在其最终容器中的灭菌，如注射器)进行灭菌。

例如，蒸汽热可用于通过将组合物暴露于压力下的饱和蒸汽来对产品进行灭菌。例如，这可以在121℃至124℃的温度下进行15分钟。例如，在一些替代方案中，可以使用不同的时间量和更高的温度。

可以使用干热并且可能需要更高的温度和更长的暴露时间(Galante等，2017)。在上述或下述实施方案中的任何实施方案的一些实施方案中，提供了一种制备大分子基质的方法，其中提供了交联的HA水凝胶并提供了胶原蛋白，其中胶原蛋白在溶液中处于可溶状态，并且其中胶原蛋白物理混合到交联的HA水凝胶中。

在上述或下述实施方案中的任何实施方案的一些实施方案中，胶原蛋白以溶液形式提供，其中该溶液是酸性的。在上述或下述实施方案中的任何实施方案的一些实施方案中，胶原蛋白以溶液状态提供。在上述或下述实施方案中的任何实施方案的一些实施方案中，胶原蛋白处于可溶状态。在上述或下述实施方案中的任何实施方案的一些实施方案中，制造大分子基质的方法还包括中和包含交联透明质酸和混合的胶原蛋白的混合物。在上述或下述实施方案中的任何实施方案的一些实施方案中，在混合后形成胶原蛋白原纤维或胶原蛋白沉淀物。然而，胶原蛋白原纤维或胶原蛋白沉淀物将均质地混入HA水凝胶中。在上述或下述实施方案中的任何实施方案的一些实施方案中，该方法还包括在将可溶性胶原蛋白与交联HA混合之后调节水凝胶的渗透压。在一些实施方案中，调节步骤可导致胶原蛋白形成沉淀物或原纤维，然而胶原蛋白沉淀物或原纤维围绕交联透明质酸均质混合。

在本文所述的实施方案中，重要的是HA是交联的并且胶原蛋白作为溶液添加。应混合混合物以使混合物充分混合且均质。然后将混合物中和并调节渗透压以使大分子基质处于恰当的pH/渗透压。本质上，重要的是组合物是均匀且均质的，这样才能发挥填充物的功能，如提升能力和允许组织整合的性能。

在一些实施方案中，在混合到交联透明质酸中之前，中和胶原蛋白(在酸性溶液中)。在一些实施方案中，中和至约7的pH导致不同的胶原蛋白结构，例如胶原蛋白的原纤维化。在一些实施方案中，这些原纤维均质地混合到交联透明质酸中。

在一些实施方案中，交联透明质酸和胶原蛋白在酸性pH下混合在一起。混合后，可通过添加碱和第二次混合将溶液的pH提高到7.0和7.5之间。在一些实施方案中，pH的增加可引发胶原蛋白网络的自组装。在一些实施方案中，混合物可在混合后进行高压灭菌。

如本文所用，除非上下文另有要求，否则术语“包含(comprise)”和该术语的变体，例如“包含(comprising、comprises和comprised)”不旨在排除进一步的添加剂、组分、整体或步骤。

术语“透明质酸”或“HA”是一种非硫酸化糖胺聚糖，其广泛分布于整个人体的结缔组织、上皮组织和神经组织中。透明质酸在皮肤的不同层中含量丰富，具有多种功能，例如，确保良好的水合作用、协助细胞外基质的组织、充当填充物材料；并参与组织修复机制。然而，随着年龄的增长，皮肤中存在的透明质酸、胶原蛋白、弹性蛋白和其他基质聚合物的数量会减少。例如，反复暴露于紫外线(例如来自太阳的紫外线)会导致真皮细胞减少其透明质酸的产生以及增加其降解速率。这种透明质酸损失导致各种皮肤状况，例如不完美、缺陷、疾病和/或紊乱等。例如，皮肤中的水分含量与真皮组织中的透明质酸水平之间存在很强的相关性。随着皮肤老化，皮肤中透明质酸的数量和质量都会降低。这些变化会导致皮肤干燥和起皱。

HA可包括透明质酸及其任何透明质酸盐，包括例如透明质酸钠(钠盐)、透明质酸钾、透明质酸镁和透明质酸钙。来自多种来源的透明质酸可用于本文。例如，透明质酸可以从动物组织中提取，作为细菌发酵的产物收获或者通过生物工艺技术以商业数量生产。

如本文所述的“胶原蛋白”是一种结构蛋白，存在于体内的各种结缔组织中。提供的胶原蛋白可能来自任何来源。非限制性地，例如，胶原蛋白可以是海洋胶原蛋白、牛胶原蛋白、猪胶原蛋白、人胶原蛋白、来自细胞培养物的人胶原蛋白或重组胶原蛋白。

如本文所述，“局部递送”是指将组合物施用到需要治疗组合物的组织中或附近。在上述或下述实施方案各自中的任何一个或任何实施方案的一些实施方案中，大分子基质被局部递送到患者身体上具有体积不足的区域中。

“物理混合”是添加或调入另一种物质用于混合。物理混合可以通过例如搅拌、搅拌棒、声学混合器、轨道混合器来进行，但不限于此。

主题技术作为条款的说明

为方便起见，本公开的方面的各种实施例被描述为编号的条款(1、2、3等)。这些是作为实施例提供的，并不限制主题技术。下面提供的附图和参考数字的标识仅作为实施例和说明的目的，并且条款不受这些标识的限制。

条款1.一种制备大分子基质的方法，该方法包括：提供交联透明质酸，提供胶原蛋白；将胶原蛋白物理混合到交联透明质酸中，其中胶原蛋白在整个交联透明质酸中均质混合，从而形成大分子基质，其中大分子基质包含交联透明质酸和物理混合的胶原蛋白。

条款2.条款1的方法，其中胶原蛋白以可溶状态作为溶液提供。

条款3.条款1或2的方法，其中胶原蛋白以酸性pH溶液的形式提供，其中胶原蛋白溶液的pH为约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意pH，并且其中胶原蛋白在酸性pH下是可溶的。

条款4.条款1至3中任一项的方法，其中胶原蛋白以酸性pH溶液的形式提供，其中胶原蛋白溶液的pH为约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意pH，并且其中胶原蛋白在酸性pH下是可溶的。

条款5.条款1至3中任一项的方法，其中胶原蛋白以中性pH溶液的形式提供。

条款6.条款1至5中任一项的方法，其中胶原蛋白和交联透明质酸与缓冲液物理混合。

条款7.条款6的方法，其中缓冲溶液包括PBS。

条款8.条款1至7中任一项的方法，其中该方法还包括在将胶原蛋白均质混合在整个交联透明质酸中之后，将大分子基质中和至约7的pH。

条款9.条款1至8中任一项的方法，其中方法还包括在将胶原蛋白与交联透明质酸物理混合之前将胶原蛋白中和至约7的pH。

条款10.条款9的方法，其中在将胶原蛋白物理混合到交联透明质酸中之前中和胶原蛋白，从而导致胶原蛋白沉淀成胶原蛋白原纤维或颗粒，其中将胶原蛋白原纤维或颗粒进一步混合到交联透明质酸中，其中原纤维或颗粒在整个交联透明质酸中均质混合。

条款11.条款1的方法，其中胶原蛋白作为原纤维化胶原蛋白或胶原蛋白纤维提供。

条款12.条款11的方法，其中在碱性pH下制备胶原蛋白，从而产生原纤维化胶原蛋白或胶原蛋白纤维。

条款13.条款11或12的方法，其中用至少一种盐制备胶原蛋白以获得原纤维化胶原蛋白或胶原蛋白纤维。

条款14.条款13的方法，其中至少一种盐的浓度为约20mM、约50mM、约100mM、约150mM、约200mM、约250mM、约300mM、约350mM、约400mM、约450mM或约500mM、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

条款15.条款13或14的方法，其中至少一种盐包含阴离子，其中阴离子包含H₂PO^4-、SO₄ ^2-、Cl^-或SCN^-。

条款16.条款13至15中任一项的方法，其中至少一种盐包括NaCl、Na₂SO₄或Li₂SO₄。

条款17.条款1至16中任一项的方法，其中胶原蛋白在整个大分子基质中均质混合。

条款18.条款1至16中任一项的方法，其中胶原蛋白在整个大分子基质中均匀混合。

条款19.条款1至18中任一项的方法，其中交联透明质酸包含具有如下平均分子量的透明质酸组分：约10,000道尔顿、约20,000道尔顿、约30,000道尔顿、约40,000道尔顿、约50,000道尔顿、约60,000道尔顿、约70,000道尔顿、约80,000道尔顿、约90,000道尔顿、约100,000道尔顿、约200,000道尔顿、约300,000道尔顿、约400,000道尔顿、约500,000道尔顿、约600,000道尔顿、约700,000道尔顿、约800,000道尔顿、约900,000道尔顿、约1,000,000道尔顿、约1,100,000道尔顿、约1,200,000道尔顿、约1,300,000道尔顿、约1,400,000道尔顿、约1,500,000道尔顿、约1,600,000道尔顿、约1,700,000道尔顿、约1,800,000道尔顿、约1,900,000道尔顿、约2,000,000道尔顿、约2,100,000道尔顿、约2,200,000道尔顿、约2,300,000道尔顿、约2,400,000道尔顿、约2,500,000道尔顿、约2,600,000道尔顿、约2,700,000道尔顿、约2,800,000道尔顿、约2,900,000道尔顿、约3,000,000道尔顿、约3,100,000道尔顿、约3,200,000道尔顿、约3,300,000道尔顿、约3,400,000道尔顿、约3,500,000道尔顿、约3,600,000道尔顿、约3,700,000道尔顿、约3,800,000道尔顿、约3,900,000道尔顿、约4,000,000道尔顿、约4,100,000道尔顿、约4,200,000道尔顿、约4,300,000道尔顿、约4,400,000道尔顿、约4,500,000道尔顿、约4,600,000道尔顿、约4,700,000道尔顿、约4,800,000道尔顿、约4,900,000道尔顿、约5,000,000道尔顿、约5,100,000道尔顿、约5,200,000道尔顿、约5,300,000道尔顿、约5,400,000道尔顿、约5,500,000道尔顿、约5,600,000道尔顿、约5,700,000道尔顿、约5,800,000道尔顿、约5,900,000道尔顿、约6,000,000道尔顿、约6,100,000道尔顿、约6,200,000道尔顿、约6,300,000道尔顿、约6,400,000道尔顿、约6,500,000道尔顿、约6,600,000道尔顿、约6,700,000道尔顿、约6,800,000道尔顿、约6,900,000道尔顿、约7,000,000道尔顿、约7,100,000道尔顿、约7,200,000道尔顿、约7,300,000道尔顿、约7,400,000道尔顿、约7,500,000道尔顿、约7,600,000道尔顿、约7,700,000道尔顿、约7,800,000道尔顿、约7,900,000道尔顿、约8,000,000道尔顿、约8,100,000道尔顿、约8,200,000道尔顿、约8,300,000道尔顿、约8,400,000道尔顿、约8,500,000道尔顿、约8,600,000道尔顿、约8,700,000道尔顿、约8,800,000道尔顿、约8,900,000道尔顿、约9,000,000道尔顿、约9,100,000道尔顿、约9,200,000道尔顿、约9,300,000道尔顿、约9,400,000道尔顿、约9,500,000道尔顿、约9,600,000道尔顿、约9,700,000道尔顿、约9,800,000道尔顿、约9,900,000道尔顿或约10,000,000道尔顿、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意分子量。

条款20.条款1至19中任一项的方法，其中交联透明质酸包含具有至少两种不同的分子量的透明质酸组分的混合物。

条款21.条款1至20中任一项的方法，其中该方法还包括将利多卡因添加到大分子基质中。

条款22.条款1至21中任一项的方法，其中利多卡因在基质中的浓度在约0.15％(w/w)至约0.45％(w/w)的范围之间。

条款23.条款21或22的方法，其中利多卡因在基质中的浓度为约0.15％(w/w)、约0.17％(w/w)、约0.19％(w/w)、约0.21％(w/w)、约0.23％(w/w)、约0.25％(w/w)、约0.27％(w/w)、约0.29％(w/w)、约0.31％(w/w)w)、约0.33％(w/w)、约0.35％(w/w)、约0.37％(w/w))、约0.39％(w/w)、约0.41％(w/w)、约0.43％(w/w)或约0.45％(w/w)、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

条款24.条款21至23中任一项的方法，其中利多卡因在基质中的浓度在约0.27％(w/w)至约0.33％(w/w)的范围之间。

条款25.条款1至24中任一项的方法，其中基质还包含未交联的HA。

条款26.条款25的方法，其中未交联的HA在基质内的浓度高达约5％(w/w)。

条款27.条款25或26的方法，其中未交联的HA在基质中的浓度为约0％(w/w)、约1％(w/w)、约2％(w/w)、约3％(w/w)、约4％(w/w)、约5％(w/w)或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

条款28.条款25至27中任一项的方法，其中未交联的HA在基质中的浓度为约1％(w/w)。

条款29.条款25至27中任一项的方法，其中未交联的HA在基质中的浓度为约2％(w/w)。

条款30.条款25至27中任一项的方法，其中未交联的HA在基质中的浓度为约5％(w/w)。

条款31.条款1至30中任一项的方法，其中大分子基质具有增强的通过针的可挤出性，其中针包括27G、28G、29G、30G、31G或32G的计量尺寸。

条款32.条款1至31中任一项的方法，其中大分子基质在至少6个月是稳定的。

条款33.条款1至32中任一项的方法，其中大分子基质在约6、约9、约12、约15、约18、约21、约24、约27、约30、约33个月或约36个月或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意时间量是稳定的。

条款34.条款1至33中任一项的方法，其中大分子基质在约4℃、约5℃、约10℃、约15℃、约20℃、约25℃或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意温度下是稳定的。

条款35.条款1至34中任一项的方法，其中大分子基质在约4℃是稳定的。

条款36.条款1至35中任一项的方法，其中大分子基质在约25℃是稳定的。

条款37.条款1至36中任一项的方法，其中大分子基质在约3、约6、约9、约12、约15、约18、约21、约24、约27、约30、约33或约36个月或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意时间量具有最小降解。

条款38.一种制备大分子基质的方法，该方法包括：将透明质酸溶解在水溶液中以形成预反应水溶液并制备第二溶液，其中第二溶液包含：a)水溶性碳二亚胺；和N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基磺基琥珀酰亚胺；或b)在氢氧化钠存在下的透明质酸钠溶液中的1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)；以及将第二溶液添加到预反应水溶液中以形成交联反应混合物；使透明质酸交联，其中交联反应混合物通过使透明质酸交联而发生反应，从而形成交联透明质酸；以及

提供胶原蛋白；以及将胶原蛋白物理混合到交联透明质酸中，从而产生包含交联透明质酸和胶原蛋白的大分子基质，其中胶原蛋白在整个交联透明质酸中均质混合。

条款39.条款38的方法，其中第二溶液包含水溶性碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基磺基琥珀酰亚胺，其中透明质酸与天然存在的胺交联，从而形成交联透明质酸。

条款40.条款38或39的方法，其中第二溶液包含水溶性碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基磺基琥珀酰亚胺，并且其中交联在MES的存在下进行。

条款41.条款38的方法，其中第二溶液包含在氢氧化钠存在下透明质酸钠溶液中的1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)，并且其中BDDE用于使用环氧化物化学使透明质酸交联。

条款42.条款38至41中任一项的方法，其中胶原蛋白以可溶状态作为溶液提供。

条款43.如条款38至42中任一项的方法，其中在存在缓冲液的情况下进行物理混合步骤。

条款44.根据条款43的方法，其中缓冲液包括PBS。

条款45.条款38至44中任一项的方法，其中胶原蛋白以胶原蛋白溶液的形式提供，其中胶原蛋白溶液的pH为约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意pH，并且其中胶原蛋白在酸性pH下是可溶的。

条款46.如条款38至45中任一项的方法，其中胶原蛋白以酸性pH溶液的形式提供，其中胶原蛋白溶液的pH为约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意pH，并且其中胶原蛋白在酸性pH下是可溶的。

条款47.条款38至46中任一项的方法，其中胶原蛋白以酸性至中性pH提供。

条款48.条款38至46中任一项的方法，还包括在将胶原蛋白均质混合在整个交联透明质酸中之后，将大分子基质中和至约7的pH。

条款49.条款38至48中任一项的方法，还包括在将胶原蛋白与交联透明质酸物理混合之前将胶原蛋白中和至约7的pH，其中在将胶原蛋白物理混合到交联透明质酸中之前中和胶原蛋白导致胶原蛋白沉淀成胶原蛋白原纤维或颗粒，其中胶原蛋白原纤维或颗粒进一步混合到交联透明质酸中，其中原纤维或颗粒在整个交联透明质酸中均质混合。

条款50.条款49的方法，其中胶原蛋白以原纤维化胶原蛋白或胶原蛋白纤维的形式提供。

条款51.条款50的方法，其中在碱性pH下制备胶原蛋白，从而产生原纤维化胶原蛋白或胶原蛋白纤维。

条款52.条款50或51的方法，其中用至少一种盐制备胶原蛋白以获得原纤维化胶原蛋白或胶原蛋白纤维。

条款53.条款52的方法，其中至少一种盐的浓度为约20mM、约50mM、约100mM、约150mM、约200mM、约250mM、约300mM的浓度、约350mM、约400mM、约450mM或约500mM、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

条款54.条款52或53的方法，其中至少一种盐包含阴离子，其中阴离子包含H₂PO^4-、SO₄ ^2-、Cl^-或SCN^-。

条款55.条款52-54中任一项的方法，其中至少一种盐包括NaCl、Na₂SO₄或Li₂SO₄。

条款56.条款38至55中任一项的方法，其中透明质酸包含如下的平均分子量：约10,000道尔顿、约20,000道尔顿、约30,000道尔顿、40,000道尔顿、约50,000道尔顿、约60,000道尔顿、约70,000道尔顿、约80,000道尔顿、约90,000道尔顿、约100,000道尔顿、约200,000道尔顿、约300,000道尔顿、约400,000道尔顿、约500,000道尔顿、约600,000道尔顿、约700,000道尔顿、约800,000道尔顿、约900,000道尔顿、约1,000,000道尔顿、约1,100,000道尔顿、约1,200,000道尔顿、约1,300,000道尔顿、约1,400,000道尔顿、约1,500,000道尔顿、约1,600,000道尔顿、约1,700,000道尔顿、约1,800,000道尔顿、约1,900,000道尔顿、约2,000,000道尔顿、约2,100,000道尔顿、约2,200,000道尔顿、约2,300,000道尔顿、约2,400,000道尔顿、约2,500,000道尔顿、约2,600,000道尔顿、约2,700,000道尔顿、约2,800,000道尔顿、约2,900,000道尔顿、约3,000,000道尔顿、约3,100,000道尔顿、约3,200,000道尔顿、约3,300,000道尔顿、约3,400,000道尔顿、约3,500,000道尔顿、约3,600,000道尔顿、约3,700,000道尔顿、约3,800,000道尔顿、约3,900,000道尔顿、约4,000,000道尔顿、约4,100,000道尔顿、约4,200,000道尔顿、约4,300,000道尔顿、约4,400,000道尔顿、约4,500,000道尔顿、约4,600,000道尔顿、约4,700,000道尔顿、约4,800,000道尔顿、约4,900,000道尔顿、约5,000,000道尔顿、约5,100,000道尔顿、约5,200,000道尔顿、约5,300,000道尔顿、约5,400,000道尔顿、约5,500,000道尔顿、约5,600,000道尔顿、约5,700,000道尔顿、约5,800,000道尔顿、约5,900,000道尔顿、约6,000,000道尔顿、约6,100,000道尔顿、约6,200,000道尔顿、约6,300,000道尔顿、约6,400,000道尔顿、约6,500,000道尔顿、约6,600,000道尔顿、约6,700,000道尔顿、约6,800,000道尔顿、约6,900,000道尔顿、约7,000,000道尔顿、约7,100,000道尔顿、约7,200,000道尔顿、约7,300,000道尔顿、约7,400,000道尔顿、约7,500,000道尔顿、约7,600,000道尔顿、约7,700,000道尔顿、约7,800,000道尔顿、约7,900,000道尔顿、约8,000,000道尔顿、约8,100,000道尔顿、约8,200,000道尔顿、约8,300,000道尔顿、约8,400,000道尔顿、约8,500,000道尔顿、约8,600,000道尔顿、约8,700,000道尔顿、约8,800,000道尔顿、约8,900,000道尔顿、约9,000,000道尔顿、约9,100,000道尔顿、约9,200,000道尔顿、约9,300,000道尔顿、约9,400,000道尔顿、约9,500,000道尔顿、约9,600,000道尔顿、约9,700,000道尔顿、约9,800,000道尔顿、约9,900,000道尔顿或约10,000,000道尔顿、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意分子量。

条款57.条款38至56中任一项的方法，其中透明质酸包含具有至少两种不同的分子量的透明质酸组分的混合物。

条款58.条款38至57中任一项的方法，其中溶解步骤还包括将透明质酸和胶原蛋白两者溶解在水溶液中以形成包含透明质酸和胶原蛋白两者的预反应水溶液，并且其中交联反应通过将透明质酸和胶原蛋白交联成HA-胶原蛋白偶联凝胶进行反应，其中混合步骤包括将HA-胶原蛋白偶联凝胶与另外的胶原蛋白物理混合，其中胶原蛋白处于可溶状态并且其中胶原蛋白是在溶液中，其中溶液处于酸性pH，从而产生包含具有物理混合的胶原蛋白的HA-胶原蛋白偶联凝胶的大分子基质。

条款59.条款38至58中任一项的方法，其中胶原蛋白原纤维或胶原蛋白沉淀物在与胶原蛋白的混合步骤之后形成，并且其中胶原蛋白原纤维或胶原蛋白沉淀物在交联透明质酸内均质混合。

条款60.条款38至58中任一项的方法，其中胶原蛋白原纤维或胶原蛋白沉淀物在与胶原蛋白混合的混合步骤期间形成，并且其中胶原蛋白原纤维或胶原蛋白沉淀物在交联透明质酸内均质混合

条款61.条款1至60中任一项的方法，其中方法还包括在将胶原蛋白混合在整个交联透明质酸中之后调节大分子基质的渗透压。

条款62.条款1至61中任一项的方法，其中混合步骤在室温下进行。

条款63.条款1至61中任一项的方法，其中混合步骤在约4℃进行。

条款64.条款1至63中任一项的方法，其中方法在约4℃进行。

条款65.条款1至64中任一项的方法，其中该方法还包括纯化交联透明质酸或HA-胶原蛋白偶联凝胶，其中在与胶原蛋白混合步骤之前进行纯化。

条款66.如条款65的方法，其中使用透析纯化进行纯化。

条款67.条款65或66的方法，其中在交联完成之后调节交联反应混合物的pH，其中调节pH在纯化步骤之前进行，并且其中pH调节至约7.0、约7.2、约7.4、约7.6或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意pH。

条款68.条款65至67中任一项的方法，其中纯化在约2℃至约8℃之间的范围之间进行。

条款69.条款65至68中任一项的方法，其中纯化在约2℃、约4℃、约6℃或约8℃、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意温度下进行。

条款70.条款65至69中任一项的方法，其中该方法还包括在与胶原蛋白混合之前对交联透明质酸或HA-胶原蛋白偶联凝胶进行灭菌的灭菌步骤，其中在纯化步骤之后进行灭菌步骤。

条款71.条款70的方法，其中灭菌步骤包括将交联透明质酸或HA-胶原蛋白偶联凝胶转移到容器中，以进行灭菌；对交联透明质酸或HA-胶原蛋白偶联凝胶进行灭菌。

条款72.条款71的方法，其中容器是注射器。

条款73.条款70至72中任一项的方法，其中通过热(干热、蒸汽热、湿热灭菌)、辐射(非电离、UV)、电离(粒子(β射线、γ射线、x射线)、电磁(电子束)、过滤或终端灭菌进行灭菌。

条款74.条款1至73中任一项的方法，其中方法还包括透析交联的大分子基质或HA-胶原蛋白偶联凝胶，其中通过具有在1000道尔顿至约100,000道尔顿之间的范围之间的分子量截止值的膜进行透析，并且其中在灭菌之前进行透析。

条款75.如条款74的方法，其中在缓冲液中进行透析。

条款76.条款75的方法，其中缓冲液包括磷酸盐缓冲盐水或磷酸钠缓冲液。

条款77.条款75或76中任一项的方法，其中缓冲液还包含NaCl和/或KCl。

条款78.条款38至75中任一项的方法，其中该方法还包括在交联反应完成后将交联透明质酸或HA-胶原蛋白偶联凝胶的pH升高至中性pH，其中升高pH在灭菌步骤之前进行。

条款79.条款38至75中任一项的方法，其中方法还包括在交联反应完成后将交联透明质酸或HA-胶原蛋白偶联凝胶的pH升高至约7.0、约7.2或约7.4、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意pH，其中升高pH在灭菌步骤之前进行。

条款80.条款38至78中任一项的方法，其中第二溶液包含水溶性碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基磺基琥珀酰亚胺，并且其中添加和交联步骤在约4℃和约22℃之间的温度下进行。

条款81.条款80的方法，其中交联在约22℃进行。

条款82.条款80的方法，其中交联在约4℃进行。

条款83.条款38至78中任一项的方法，其中第二溶液包含在氢氧化钠存在下的透明质酸钠溶液中的1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)，并且其中添加和交联步骤在约45℃和约75℃之间进行。

条款84.条款38至83中任一项的方法，其中第二溶液包含在氢氧化钠存在下的透明质酸钠溶液中的1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)，并且其中添加和交联步骤在约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃的温度下、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意温度下进行。

条款85.条款38至84中任一项的方法，其中第二溶液包含在氢氧化钠存在下的透明质酸钠溶液中的1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)，并且其中添加和交联步骤在约50℃的温度下进行。

条款86.条款1至85中任一项的方法，其中方法包括在形成包含交联透明质酸和胶原蛋白的大分子基质之后或在形成具有物理混合的胶原蛋白的HA-胶原蛋白偶联凝胶之后进行的中和步骤，其中中和步骤包括将大分子基质调节至生理pH和生理盐浓度。

条款87.条款86的方法，其中中和包括在混合步骤之后，在无菌条件下添加碱性溶液或缓冲溶液以调节pH。

条款88.条款86或87的方法，其中调节pH和生理盐浓度从而导致胶原蛋白沉淀成原纤维或颗粒，其中胶原蛋白原纤维或颗粒均质分布在大分子基质中。

条款89.条款38至88中任一项的方法，其中方法还包括停止交联步骤，其中停止步骤包括向交联反应混合物中添加碱至pH在约8和约10之间至少10分钟，然后向交联混合物中加入酸性溶液，直到pH达到约7。

条款90.条款38至89中任一项的方法，其中天然存在的胺来自赖氨酸。

条款91.条款38至90中任一项的方法，其中交联反应混合物的pH在约4.0和约10.0之间。

条款92.条款91的方法，其中交联反应混合物的pH在约4.0和约6.0之间。

条款93.条款38至78或83至92中任一项的方法，其中第二溶液包含在氢氧化钠存在下在透明质酸钠溶液中的1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)，并且其中交联是在碱性条件下进行。

条款94.条款38至93中任一项的方法，其中预反应溶液包含盐，其中盐的浓度为约50mM、约75mM、约100mM、约125mM、约150mM、约175mM、约200mM、约225mM、约250mM、约275mM、约300mM、325mM、约350mM、约375mM、约400mM、约425mM、约450mM、约475mM、约500mM或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

条款95.条款38至81、86至92或94中任一项的方法，其中水溶性碳二亚胺是1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺并且其中水溶性碳二亚胺在交联反应混合物中的浓度为约20mM至约300mM。

条款96.条款95的方法，其中水溶性碳二亚胺为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，其浓度为约20mM、约40mM、约60mM、约80mM、约100mM、约120mM、约140mM、约160mM、约180mM、约200mM、约220mM、约240mM、约260mM、约280mM、约300mM或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

条款97.条款38至81、86至92或94至96中任一项的方法，其中水溶性碳二亚胺和透明质酸的水溶性碳二亚胺:透明质酸重复单元的摩尔比为约0.3至约3.0。

条款98.条款97的方法，其中水溶性碳二亚胺和透明质酸的水溶性碳二亚胺:透明质酸重复单元的摩尔比为约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9或约3.0、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意摩尔比。

条款99.条款38至98中任一项的方法，其中赖氨酸和透明质酸的摩尔:摩尔(赖氨酸:HA重复单元)比为约0.01至约0.6。

条款100.条款99的方法，其中赖氨酸和透明质酸的摩尔:摩尔(赖氨酸:HA重复单元)比为约0.01、约0.02、约0.03、约0.04、约0.05、约0.06、约0.07、约0.08、约0.09、约0.10、约0.11、约0.12、约0.13、约0.14、约0.15、约0.16、约0.17、约0.18、约0.19、约0.2、约0.21、约0.22、约0.23、约0.24、约0.25、约0.26、约0.27、约0.28、约0.29、约0.3、约0.31、约0.32、约0.33、约0.34、约0.35、约0.36、约0.37、约0.38、约0.39、约0.4、约0.41、约0.42、约0.43、约0.44、约0.45、约0.46、约0.47、约0.48、约0.49、约0.5、约0.51、约0.52、约0.53、约0.54、约0.55、约0.56、约0.57、约0.58、约0.59、约0.6或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意摩尔比。

条款101.条款38至100中任一项的方法，其中预反应溶液中的透明质酸在添加第二溶液之前水合至少约60分钟。

条款102.条款38至101中任一项的方法，其中反应混合物的交联进行约4小时至约24小时。

条款103.条款38至102中任一项的方法，其中方法还包括将利多卡因添加到大分子基质中。

条款104.条款103的方法，其中利多卡因在基质中的浓度在约0.15％(w/w)至约0.45％(w/w)的范围之间。

条款105.条款103或104的方法，其中利多卡因在基质中的浓度为约0.15％(w/w)、约0.17％(w/w)、约0.19％(w/w)、约0.21％(w/w)、约0.23％(w/w)、约0.25％(w/w)、约0.27％(w/w)、约0.29％(w/w)、约0.31％(w/w)、约0.33％(w/w)、约0.35％(w/w)、约0.37％(w/w)、约0.39％(w/w)、约0.41％(w/w)、约0.43％(w/w)或约0.45％(w/w)、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

条款106.条款103至105中任一项的方法，其中利多卡因在基质中的浓度在约0.27％(w/w)至约0.33％(w/w)的范围之间。

条款107.条款38至106中任一项的方法，其中基质还包含未交联的HA。

条款108.条款107的方法，其中未交联的HA在基质中的浓度高达约5％(w/w)。

条款109.条款107至108的方法，其中在基质中未交联的HA的浓度为约0％(w/w)、约1％(w/w)、约2％(w/w)、约3％(w/w)、约4％(w/w)、约5％(w/w)、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

条款110.条款107至109中任一项的方法，其中未交联的HA在基质中的浓度为约1％(w/w)。

条款111.条款107至109中任一项的方法，其中未交联的HA在基质中的浓度为约2％(w/w)。

条款112.条款107至109中任一项的方法，其中未交联的HA在基质中的浓度为约5％(w/w)。

条款113.条款38至112中任一项的方法，其中大分子基质具有增强的通过针的可挤出性，其中针包括27G、28G、29G、30G、31G或32G的计量尺寸。

条款114.条款1至113中任一项的方法，其中方法还包括在将胶原蛋白添加到交联HA中之前浓缩胶原蛋白。

条款115.一种通过条款1至114中任一项的方法制备的大分子基质。

条款116.条款115的大分子基质，其中大分子基质包含交联透明质酸，其中胶原蛋白与交联透明质酸物理混合，并且其中胶原蛋白在整个大分子复合物中是均质的。

条款117.条款115的大分子基质，其中大分子基质包含HA-胶原蛋白偶联凝胶，其中HA-胶原蛋白偶联凝胶还包含未交联于HA-胶原蛋白偶联凝胶中的物理混合的胶原蛋白。

条款118.一种大分子基质，包括：透明质酸，其中透明质酸是交联的；和胶原蛋白；其中胶原蛋白与交联透明质酸物理混合。

条款119.一种大分子基质，包括：HA-胶原蛋白偶联凝胶，其中HA-胶原蛋白偶联凝胶包含与胶原蛋白交联的透明质酸；和物理混合的胶原蛋白，其中物理混合的胶原蛋白不与HA-胶原蛋白偶联凝胶交联，并且其中物理混合的胶原蛋白在HA-胶原蛋白偶联凝胶内均质混合。

条款120.条款115至119中任一项的大分子基质，其中透明质酸与天然存在的胺交联。

条款121.条款120的大分子基质，其中天然存在的胺来自赖氨酸。

条款122.条款115至121中任一项的大分子基质，其中胶原蛋白来自牛胶原蛋白、海洋胶原蛋白、人胶原蛋白或猪胶原蛋白。

条款123.条款115至122中任一项的大分子基质，其中胶原蛋白是重组人胶原蛋白。

条款124.条款115至123中任一项的大分子基质，其中大分子基质的弹性模量(G′)为约100Pa、约200Pa、约300Pa、约400Pa、约500Pa、约600Pa、约700Pa、约800Pa、约900Pa、约1000Pa、约1100Pa、约1200Pa、约1300Pa、约1400Pa、约1500Pa、约1600Pa、约1700Pa、约1800Pa、约1900Pa、约2000Pa、约2100Pa、约2200Pa、约2300Pa、约2400Pa、约2500Pa、约2600Pa、约2700Pa、约2800Pa、约2900Pa、或约3000Pa、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意值。

条款125.条款115至124中任一项的大分子基质，其中大分子基质的压缩力值为约10gmf、约20gmf、约30gmf、约40gmf、约50gmf、约60gmf、约70gmf、约80gmf、约90gmf、约100gmf、约110gmf、约120gmf、约130gmf、约140gmf、约150gmf、约160gmf、约170gmf、约180gmf、约190gmf、约200gmf、约210gmf、约220gmf、约230gmf、约240gmf、约250gmf、约260gmf、约270gmf、约280gmf、约290gmf、约300gmf、约310gmf、约320gmf、约330gmf、约340gmf、约350gmf、约360gmf、约370gmf、约380gmf、约390gmf、约400gmf、约410gmf、约420gmf、约430gmf、约440gmf、约450gmf、约460gmf、约470gmf、约480gmf、约490gmf、约500gmf、约510gmf、约520gmf、约530gmf、约540gmf、约550gmf、约560gmf、约570gmf、约580gmf、约590gmf或约600gmf、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意压缩力值。

条款126.条款115至125中任一项的大分子基质，其中透明质酸的浓度为约2mg/mL、约4mg/mL、约6mg/mL、约8mg/mL、约10mg/mL、约12mg/mL、约14mg/mL、约16mg/mL、约18mg/mL、约20mg/mL、约22mg/mL、约24mg/mL、约26mg/mL、约28mg/mL、约30mg/mL、32mg/mL、约34mg/mL或约36mg/mL、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

条款127.条款115至126中任一项的大分子基质，透明质酸与胶原蛋白的重量比为约20:3、约24:2.3、约24:10、约24:12、约24:4、约24:6、约28:6或约28:11。

条款128.条款115至127中任一项的大分子基质，其中交联透明质酸包含具有如下平均分子量的透明质酸组分：约10,000道尔顿、约20,000道尔顿、约30,000道尔顿、40,000道尔顿、约50,000道尔顿、约60,000道尔顿、约70,000道尔顿、约80,000道尔顿、约100,000道尔顿、约200,000道尔顿、约300,000道尔顿、约400,000道尔顿、约500,000道尔顿、约600,000道尔顿、约700,000道尔顿、约800,000道尔顿、约900,000道尔顿、约1,000,000道尔顿、约1,100,000道尔顿、约1,200,000道尔顿、约1,300,000道尔顿、约1,400,000道尔顿、约1,500,000道尔顿、约1,600,000道尔顿、约1,700,000道尔顿、约1,800,000道尔顿、约1,900,000道尔顿、约2,000,000道尔顿、约2,100,000道尔顿、约2,200,000道尔顿、约2,300,000道尔顿、约2,400,000道尔顿、约2,500,000道尔顿、约2,600,000道尔顿、约2,700,000道尔顿、约2,800,000道尔顿、约2,900,000道尔顿、约3,000,000道尔顿、约3,100,000道尔顿、约3,200,000道尔顿、约3,300,000道尔顿、约3,400,000道尔顿、约3,500,000道尔顿、约3,600,000道尔顿、约3,700,000道尔顿、约3,800,000道尔顿、约3,900,000道尔顿、约4,000,000道尔顿、约4,100,000道尔顿、约4,200,000道尔顿、约4,300,000道尔顿、约4,400,000道尔顿、约4,500,000道尔顿、约4,600,000道尔顿、约4,700,000道尔顿、约4,800,000道尔顿、约4,900,000道尔顿、约5,000,000道尔顿、约5,100,000道尔顿、约5,200,000道尔顿、约5,300,000道尔顿、约5,400,000道尔顿、约5,500,000道尔顿、约5,600,000道尔顿、约5,700,000道尔顿、约5,800,000道尔顿、约5,900,000道尔顿、约6,000,000道尔顿、约6,100,000道尔顿、约6,200,000道尔顿、约6,300,000道尔顿、约6,400,000道尔顿、约6,500,000道尔顿、约6,600,000道尔顿、约6,700,000道尔顿、约6,800,000道尔顿、约6,900,000道尔顿、约7,000,000道尔顿、约7,100,000道尔顿、约7,200,000道尔顿、约7,300,000道尔顿、约7,400,000道尔顿、约7,500,000道尔顿、约7,600,000道尔顿、约7,700,000道尔顿、约7,800,000道尔顿、约7,900,000道尔顿、约8,000,000道尔顿、约8,100,000道尔顿、约8,200,000道尔顿、约8,300,000道尔顿、约8,400,000道尔顿、约8,500,000道尔顿、约8,600,000道尔顿、约8,700,000道尔顿、约8,800,000道尔顿、约8,900,000道尔顿、约9,000,000道尔顿、约9,100,000道尔顿、约9,200,000道尔顿、约9,300,000道尔顿、约9,400,000道尔顿、约9,500,000道尔顿、约9,600,000道尔顿、约9,700,000道尔顿、约9,800,000道尔顿、约9,900,000道尔顿或约10,000,000道尔顿、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意重量。

条款129.条款128的大分子基质，其中所述透明质酸组分包含透明质酸组分的混合物，所述透明质酸组分包含至少两种不同的分子量。

条款130.条款115至129中任一项的大分子基质，其中透明质酸包含透明质酸的混合物，其中混合物包含具有两种不同分子量的HA的50:50共混物。

条款131.条款115至130中任一项的大分子基质，其中胶原蛋白包括I型胶原蛋白和/或III型胶原蛋白。

条款132.条款115至131中任一项的大分子基质，其中胶原蛋白的浓度为约1mg/mL、约2mg/mL、约3mg/mL、约4mg/mL、约6mg/mL、约7mg/mL、约8mg/mL、约9mg/mL、约10mg/mL、约11mg/mL、约12mg/mL、约13mg/mL、约14mg/mL或约15mg/mL、约16mg/mL、约17mg/mL、约18mg/mL、约19mg/mL、约20mg/mL、约21mg/mL、约22mg/mL、约23mg/mL、约24mg/mL、约25mg/mL或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

条款133.条款115至132中任一项的大分子基质，其中大分子基质具有约250mOsm/kg和约390mOsm/kg之间的渗透压。

条款134.条款115至133中任一项的大分子基质，其中大分子基质具有约250mOsm/kg、约275mOsm/kg、约300mOsm/kg、约325mOsm/kg或约390mOsm之间的渗透压、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意渗透压。

条款135.条款115至134中任一项的大分子基质，其中透明质酸是线性的。

条款136.条款115至135中任一项的大分子基质，其中大分子基质的粘性模量(G”)为约10Pa、约20Pa、约30Pa、约40Pa、约50Pa、约60Pa、约70Pa、约80Pa、约90Pa、约100Pa、约200Pa、约300Pa、约400Pa、约500Pa、约600Pa、约700Pa、约800Pa、约900Pa或约1000Pa、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意粘性模量(G”)。

条款137.条款115至136中任一项的大分子基质，其中大分子基质的介质损耗角正切值(G”/G′)为约0.01、约0.02、约0.03、约0.04、约0.05、约0.06、约0.07、约0.08、约0.09、约0.1、约0.12、约0.14、约0.16、约0.18、约0.20、约0.22、约0.24、约0.26、约0.28、约0.30、约0.32、约0.34、约0.36、约0.38、约0.40、约0.42、约0.44、约0.46、约0.48、约0.50或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意介质损耗角正切值(G”/G′)。

条款138.条款115至137中任一项的大分子基质，其中大分子基质的pH为约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意pH。

条款139.条款115至138中任一项的大分子基质，其中大分子基质还包含利多卡因。

条款140.条款139的大分子基质，其中利多卡因在基质中的浓度为约0.15％(w/w)、约0.17％(w/w)、约0.19％(w/w)、约0.21％(w/w)、约0.23％(w/w)、约0.25％(w/w)、约0.27％(w/w)、约0.29％(w/w)、约0.31％(w/w)、约0.33％(w/w)、约0.35％(w/w)、约0.37％(w/w)、约0.39％(w/w)、约0.41％(w/w)、约0.43％(w/w)或约0.45％(w/w)、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

条款141.条款139或140中任一项的大分子基质，其中利多卡因在基质中的浓度在约0.27％(w/w)至约0.33％(w/w)的范围之间。

条款142.条款115至141中任一项的大分子基质，其中基质还包含未交联的HA。

条款143.条款142的大分子基质，其中未交联的HA在基质中的浓度高达约5％(w/w)。

条款144.条款142至143的大分子基质，其中未交联HA在基质中的浓度为约0％(w/w)、约1％(w/w)、约2％(w/w)、约3％(w/w)、约4％(w/w)、约5％(w/w)或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

条款145.条款142至144中任一项的大分子基质，其中未交联的HA在基质中的浓度为约1％(w/w)。

条款146.条款142至144中任一项的大分子基质，其中未交联的HA在基质中的浓度为约2％(w/w)。

条款147.条款142至144中任一项的大分子基质，其中未交联的HA在基质中的浓度为约5％(w/w)。

条款148.条款115至147中任一项的大分子基质，其中大分子基质具有增强的通过针的可挤出性，其中针包括27G、28G、29G、30G、31G或32G的计量尺寸。

条款149.一种改善人体解剖特征的美学质量的方法，包括：将组合物注射到人体组织中，从而提高解剖特征的美学质量；其中，组合物包含权利要求1至102中任一项的方法制备的大分子基质或权利要求115至139中任一项的大分子基质。

条款150.一种改善人体解剖特征的美学质量的方法，包括：将组合物注射到人体组织中，从而提高解剖特征的美学质量；其中组合物包含大分子基质，该大分子基质包含：交联透明质酸；赖氨酸；和胶原蛋白；其中胶原蛋白物理混合到交联透明质酸中。

条款151.条款150的方法，其中组合物还包含利多卡因。

条款152.条款151的方法，其中利多卡因在基质中的浓度在0.15％(w/w)至0.45％(w/w)的范围之间。

条款153.条款151或152的方法，其中利多卡因在基质中的浓度为约0.15％(w/w)、约0.17％(w/w)、约0.19％(w/w)、约0.21％(w/w)、约0.23％(w/w)、约0.25％(w/w)、约0.27％(w/w)、约0.29％(w/w)、约0.31％(w/w)、约0.33％(w/w)、约0.35％(w/w)、约0.37％(w/w)、约0.39％(w/w)、约0.41％(w/w)、约0.43％(w/w)或约0.45％(w/w)、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

条款154.条款151至153中任一项的方法，其中利多卡因在基质中的浓度在约0.27％(w/w)至约0.33％(w/w)的范围之间。

条款155.条款150至154中任一项的方法，其中组合物还包含未交联的HA。

条款156.条款155的方法，其中未交联的HA在基质中的浓度高达约5％(w/w)。

条款157.条款155或156的方法，其中在基质中未交联的HA的浓度为约0％(w/w)、约1％(w/w)、约2％(w/w)、约3％(w/w)、约4％(w/w)、约5％(w/w)或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

条款158.条款155至157中任一项的方法，其中未交联的HA在基质中的浓度为约1％(w/w)。

条款159.条款155至157中任一项的方法，其中未交联的HA在基质中的浓度为约2％(w/w)。

条款160.条款155至157中任一项的方法，其中未交联的HA在基质中的浓度为约5％(w/w)。

条款161.条款150至160中任一项的方法，其中交联透明质酸包含具有如下平均分子量的透明质酸组分：约10,000道尔顿、约20,000道尔顿、约30,000道尔顿、40,000道尔顿、约50,000道尔顿、约60,000道尔顿、约70,000道尔顿、约80,000道尔顿、约100,000道尔顿、约200,000道尔顿、约300,000道尔顿、约400,000道尔顿、约500,000道尔顿、约600,000道尔顿、约700,000道尔顿、约800,000道尔顿、约900,000道尔顿、约1,000,000道尔顿、约1,100,000道尔顿、约1,200,000道尔顿、约1,300,000道尔顿、约1,400,000道尔顿、约1,500,000道尔顿、约1,600,000道尔顿、约1,700,000道尔顿、约1,800,000道尔顿、约1,900,000道尔顿、约2,000,000道尔顿、约2,100,000道尔顿、约2,200,000道尔顿、约2,300,000道尔顿、约2,400,000道尔顿、约2,500,000道尔顿、约2,600,000道尔顿、约2,700,000道尔顿、约2,800,000道尔顿、约2,900,000道尔顿、约3,000,000道尔顿、约3,100,000道尔顿、约3,200,000道尔顿、约3,300,000道尔顿、约3,400,000道尔顿、约3,500,000道尔顿、约3,600,000道尔顿、约3,700,000道尔顿、约3,800,000道尔顿、约3,900,000道尔顿、约4,000,000道尔顿、约4,100,000道尔顿、约4,200,000道尔顿、约4,300,000道尔顿、约4,400,000道尔顿、约4,500,000道尔顿、约4,600,000道尔顿、约4,700,000道尔顿、约4,800,000道尔顿、约4,900,000道尔顿、约5,000,000道尔顿、约5,100,000道尔顿、约5,200,000道尔顿、约5,300,000道尔顿、约5,400,000道尔顿、约5,500,000道尔顿、约5,600,000道尔顿、约5,700,000道尔顿、约5,800,000道尔顿、约5,900,000道尔顿、约6,000,000道尔顿、约6,100,000道尔顿、约6,200,000道尔顿、约6,300,000道尔顿、约6,400,000道尔顿、约6,500,000道尔顿、约6,600,000道尔顿、约6,700,000道尔顿、约6,800,000道尔顿、约6,900,000道尔顿、约7,000,000道尔顿、约7,100,000道尔顿、约7,200,000道尔顿、约7,300,000道尔顿、约7,400,000道尔顿、约7,500,000道尔顿、约7,600,000道尔顿、约7,700,000道尔顿、约7,800,000道尔顿、约7,900,000道尔顿、约8,000,000道尔顿、约8,100,000道尔顿、约8,200,000道尔顿、约8,300,000道尔顿、约8,400,000道尔顿、约8,500,000道尔顿、约8,600,000道尔顿、约8,700,000道尔顿、约8,800,000道尔顿、约8,900,000道尔顿、约9,000,000道尔顿、约9,100,000道尔顿、约9,200,000道尔顿、约9,300,000道尔顿、约9,400,000道尔顿、约9,500,000道尔顿、约9,600,000道尔顿、约9,700,000道尔顿、约9,800,000道尔顿、约9,900,000道尔顿或约10,000,000道尔顿、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意重量。

条款162.条款150至161中任一项的方法，其中交联透明质酸中的透明质酸包括具有至少两种不同分子量的透明质酸组分的混合物。

条款163.条款150至162中任一项的方法，其中胶原蛋白包括I型胶原蛋白和/或III型胶原蛋白。

条款164.如条款150至163中任一项的方法，其中方法不会在注射部位引起蓝色变色。

条款165.条款150至164中任一项的方法，其中组合物具有增强的通过针的可挤出性，其中针包括27G、28G、29G、30G、31G或32G的计量尺寸。

条款166.一种通过将组合物注射到人体组织中以改善人体外观的方法，由此组合物促进从周围组织到注射的组合物中的细胞浸润和胶原蛋白沉积，该方法包括：将组合物注射到人体组织中，从而提高解剖特征的美学质量；其中组合物包含交联的大分子基质，该大分子基质包含：透明质酸；赖氨酸；和胶原蛋白；其中透明质酸包括与胶原蛋白物理混合的交联透明质酸；和其中注射有组合物的组织显示出具有组织整合性。

条款167.条款166的方法，其中组合物还包含利多卡因。

条款168.条款166或167的方法，其中透明质酸组分的平均分子量为约10,000道尔顿、约20,000道尔顿、约30,000道尔顿、40,000道尔顿、约50,000道尔顿、约60,000道尔顿、约70,000道尔顿、约80,000道尔顿、约100,000道尔顿、约200,000道尔顿、约300,000道尔顿、约400,000道尔顿、约500,000道尔顿、约600,000道尔顿、约700,000道尔顿、约800,000道尔顿、约900,000道尔顿、约1,000,000道尔顿、约1,100,000道尔顿、约1,200,000道尔顿、约1,300,000道尔顿、约1,400,000道尔顿、约1,500,000道尔顿、约1,600,000道尔顿、约1,700,000道尔顿、约1,800,000道尔顿、约1,900,000道尔顿、约2,000,000道尔顿、约2,100,000道尔顿、约2,200,000道尔顿、约2,300,000道尔顿、约2,400,000道尔顿、约2,500,000道尔顿、约2,600,000道尔顿、约2,700,000道尔顿、约2,800,000道尔顿、约2,900,000道尔顿、约3,000,000道尔顿、约3,100,000道尔顿、约3,200,000道尔顿、约3,300,000道尔顿、约3,400,000道尔顿、约3,500,000道尔顿、约3,600,000道尔顿、约3,700,000道尔顿、约3,800,000道尔顿、约3,900,000道尔顿、约4,000,000道尔顿、约4,100,000道尔顿、约4,200,000道尔顿、约4,300,000道尔顿、约4,400,000道尔顿、约4,500,000道尔顿、约4,600,000道尔顿、约4,700,000道尔顿、约4,800,000道尔顿、约4,900,000道尔顿、约5,000,000道尔顿、约5,100,000道尔顿、约5,200,000道尔顿、约5,300,000道尔顿、约5,400,000道尔顿、约5,500,000道尔顿、约5,600,000道尔顿、约5,700,000道尔顿、约5,800,000道尔顿、约5,900,000道尔顿、约6,000,000道尔顿、约6,100,000道尔顿、约6,200,000道尔顿、约6,300,000道尔顿、约6,400,000道尔顿、约6,500,000道尔顿、约6,600,000道尔顿、约6,700,000道尔顿、约6,800,000道尔顿、约6,900,000道尔顿、约7,000,000道尔顿、约7,100,000道尔顿、约7,200,000道尔顿、约7,300,000道尔顿、约7,400,000道尔顿、约7,500,000道尔顿、约7,600,000道尔顿、约7,700,000道尔顿、约7,800,000道尔顿、约7,900,000道尔顿、约8,000,000道尔顿、约8,100,000道尔顿、约8,200,000道尔顿、约8,300,000道尔顿、约8,400,000道尔顿、约8,500,000道尔顿、约8,600,000道尔顿、约8,700,000道尔顿、约8,800,000道尔顿、约8,900,000道尔顿、约9,000,000道尔顿、约9,100,000道尔顿、约9,200,000道尔顿、约9,300,000道尔顿、约9,400,000道尔顿、约9,500,000道尔顿、约9,600,000道尔顿、约9,700,000道尔顿、约9,800,000道尔顿、约9,900,000道尔顿或约10,000,000道尔顿、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意重量。

条款169.条款166至168中任一项的方法，其中交联透明质酸中的透明质酸包括具有至少两种不同分子量的透明质酸组分的混合物。

条款170.条款166至169中任一项的方法，其中胶原蛋白包括I型胶原蛋白和/或III型胶原蛋白。

条款171.如条款166至170中任一项的方法，其中注射有组合物的组织显示出具有进入组合物中的组织整合性，并且通过来自周围组织的细胞浸润而在组合物中沉积胶原蛋白。

条款172.如条款166至171中任一项的方法，其中注射有组合物的组织显示出具有进入组合物中的组织整合性，并且在注射组合物后在组合物中沉积胶原蛋白。

条款173.条款166至172中任一项的方法，其中组合物具有增强的通过针的可挤出性，其中针包括27G、28G、29G、30G、31G或32G的计量尺寸。

进一步的考虑

在一些实施方案中，本文中的任何条款可以依赖于任何一个独立条款或任何一个从属条款。在一个方面，任何条款(例如，从属或独立条款)可以与任何其他一个或多个条款(例如，从属或独立条款)组合。在一个方面，权利要求可以包括在从句、句子、短语或段落中引用的一些或全部词语(例如，步骤、操作、方法或组分)。在一个方面，权利要求可以包括在一个或多个从句、句子、短语或段落中列举的一些或全部词语。在一个方面，可以删除每个从句、句子、短语或段落中的一些词。在一个方面，可以将额外的词或元素添加到从句、句子、短语或段落中。在一个方面，可以在不利用本文所述的一些组件、元件、功能或操作的情况下实施本主题技术。在一个方面，可以利用附加组件、元件、功能或操作来实现主题技术。

实施例

以下实施例，包括所进行的实验和获得的结果，仅用于说明目的，不应解释为对本公开的限制。

实施例1-水凝胶制备

为了制备水凝胶制剂，首先在酸性pH下将HA皮肤填充物、猪胶原蛋白、水和10xPBS混合在一起。添加10x PBS以将溶液调节至等渗和缓冲条件。然后通过添加9.1重量％NaOH并再次混合，将溶液的pH提高到～7.4。pH的增加引发了胶原蛋白网络的自组装(表1)。一些制剂也在混合后进行高压灭菌。

表1：HA-胶原蛋白水凝胶的化学组成、渗透压和pH。(NOA：赖氨酸交联HA凝胶；1型：制剂1 24mg/mL HA；2型：制剂2 20mg/mL HA；AS–无菌混合；AC-高压灭菌；TC-11mg/mL胶原蛋白；

CN-胶原蛋白；HA-透明质酸；*-高压灭菌样品)

实施例2-不透明性

随着胶原蛋白的添加，水凝胶在外观上变成白色并且逐渐变得更不透明(图1)。胶原蛋白的自组装导致了物理交联的纤维网络，这些纤维散射光，使凝胶具有不透明的外观。因此，水凝胶的不透明性提供了优于透明的仅含-HA水凝胶的优点，即不会在患者的注射部位产生丁达尔效应。

实施例3-流变特性

用于测量HA/胶原蛋白水凝胶的粘弹性(G′、G")的流变装置由间隙高度设置为1mm且直径为25mm的平行板组成。测量温度设置为25℃，振荡频率为5Hz，应变为0.8％。弹性模量(G′)随着胶原蛋白和HA浓度的增加而增加。在存在胶原蛋白而非不存在胶原蛋白的情况下高压灭菌后G′值降低(图2)。

实施例4-溶胀

量化每种水凝胶制剂的溶胀。简而言之，使用两个连接的注射器将水凝胶样品(1份)与磷酸盐缓冲盐水(PBS)(7份)混合。混合至少1小时。1小时后，将凝胶和PBS转移到一个注射器中并离心(750RCF，10分钟，室温)。将含有染料的聚合物珠粒添加到上清液中，并再次将注射器向下旋转(50RCF，2分钟，室温)以观察凝胶/上清液界面。凝胶体积相对于总体积的变化用于计算水凝胶材料的溶胀(图3)。与不含胶原蛋白的类似凝胶相比，具有较高胶原蛋白浓度的制剂显示出减少的溶胀。

实施例5-内聚性

通过测量HA-胶原蛋白材料的压缩力，即当平行的25mm直径板以0.8mm/min的速度从2.5mm降低到0.9mm的间隙高度时法向力的差异，从而量化内聚性。具有较高压缩力(法向力在2.5mm和0.9mm间隙高度之间变化)的凝胶被认为更具内聚力。随着胶原蛋白的添加和HA浓度的增加，内聚性增加(图4)。含有胶原蛋白的高压灭菌制剂产生的内聚性值与具有相似HA浓度但不含胶原蛋白的那些制剂类似。

实施例6–挤压力

使用配备有27G、

"针头的1mL BD结核菌素注射器以100mm/min的速度测量挤压力。挤压力随着胶原蛋白含量的增加而增加(图5)。高压灭菌后，发现挤压力低于高压灭菌前相同制剂的挤压力。

实施例7–体内提升能力

使用大鼠皮下植入模型在体内评估水凝胶支持组织投射(提升)的能力。将125μL的水凝胶(n＝10)作为皮下团注注射到颅骨顶部。临床3-D成像系统(Canfield Vectra)用于在12周的过程中生成团注物的3-D重建。使用医学成像软件(Canfield Mirror)分析团注物的平均高度。

在4至12周之间测量一系列NOA交联HA制剂(无胶原蛋白)和增加的[HA]的体内提升能力，结果表明与HA浓度从20mg/mL至24mg/mL呈正相关(图6)。[HA]高于24mg/mL的制剂未显示提升能力增加。此外，24NOA凝胶的提升能力与仅含HA的BDDE交联凝胶相当。

在4周和12周之间测量的具有20mg/mL或24mg/mL HA和低浓度胶原蛋白(2.3mg/mL至3.0mg/mL)的一系列NOA交联HA制剂的体内提升能力表明，将胶原蛋白混合到HA凝胶中不会影响提升能力(图7)。此外，24NOA2.3凝胶的提升能力与仅含HA的BDDE交联凝胶相当。

在4至52周之间测量的具有24mg/mL或28mg/mL HA和高浓度胶原蛋白(6mg/mL至11mg/mL)的一系列NOA交联HA制剂的体内提升能力表明，与NOA交联并与胶原蛋白混合的凝胶表现出与仅含HA的比较例相同或更好的长期提升能力(图8)。此外，NOA交联HA凝胶或HA-胶原蛋白凝胶的提升能力类似于仅含BDDE交联HA凝胶。

实施例8–细胞对水凝胶的反应的体外测试。

量化与HA-胶原蛋白水凝胶紧密接触的成纤维细胞的活力。该测定法通过监测细胞酶将四唑盐还原为有色甲臜产物来测量细胞活性。具有更高活力的细胞在特定波长下表现出更大的吸光度，而具有较低活力/增殖的细胞表现出更少的吸光度。可以测量吸光度并将其与阳性对照(组织培养板)和阴性对照(仅含HA的水凝胶)进行比较，以得出相对增殖值。支持更高细胞活力的水凝胶有望诱导更多细胞浸润到凝胶中，这些细胞将ECM沉积在凝胶基质中，并且可能有利于体内组织整合到水凝胶贮库中。相反，那些得到较低细胞增殖值的制剂会表现得更惰性，并允许更少的组织浸润和整合。

将100μL的水凝胶(n＝3)铺在具有低粘附性表面涂层的24孔细胞培养板的底部，并在37℃的加湿培养箱中放置30分钟。将在500μL细胞培养基中的50,000个成人真皮成纤维细胞添加到水凝胶床顶部，并在37℃孵育。孵育48小时后，每孔加入250μL XTT试剂，37℃孵育4小时。然后将板以300xg的速度旋转5分钟，并将每个孔中的200μL上清液转移到具有20μm网孔的96孔过滤板的孔中。将含有XTT上清液的滤板以300xg旋转5分钟。将每个孔中的100μL过滤后的上清液转移到干净的96孔板(黑壁，透明底部)中，并在酶标仪上读取上清液的吸光度(450nm，背景校正为630nm)。将数据标准化为在阳性对照组织培养聚苯乙烯(TCPS)上培养的成纤维细胞的XTT细胞活力。

发现在胶原蛋白混入HA基质的制剂中，细胞活性高于没有胶原蛋白的制剂(图9)。例如，仅由HA组成的水凝胶(BDDE交联或NOA交联)表现出18.9％至21％的细胞活力值。添加6mg/mL或11mg/mL胶原蛋白的水凝胶表现出28.7％(28NOA11CN)、29.2％(24NOA6CN)或30.4％(28NOA6CN)的细胞活力值。

除了上述细胞活性测定法之外，还进行了细胞形态分析以更好地理解某些制剂对细胞大小、形状和细胞骨架组织的影响。对仅含HA或HA/胶原蛋白交联水凝胶上培养的成纤维细胞的肌动蛋白丝排列指数和形态进行成像和量化。肌动蛋白丝排列增加可能与细胞与其基底的粘附增加有关。增加的长宽比与细胞在基底上的铺展增加相关。支持更好的细胞粘附和扩散的水凝胶预计会诱导更多的细胞浸润到凝胶中，这些细胞将ECM沉积在凝胶基质中。增加的细胞浸润和ECM沉积可能有利于体内组织整合到水凝胶贮库中。相反，那些得到较低细胞粘附和扩散值的制剂会表现得更惰性，并允许更少的组织浸润和整合。

在典型程序中，将细胞培养基中的水凝胶(n＝3)和人真皮成纤维细胞添加到具有低粘附性表面涂层的96孔细胞培养板中。孵育48小时后，将细胞固定在福尔马林中并用Hoechst、WGA-488和AlexaFluor-Phalloidin染色。用共聚焦显微镜对孔进行成像，并使用图像分析软件分析肌动蛋白丝排列(鬼笔环肽)和细胞形态(WGA-488)。

含有胶原蛋白的水凝胶表现出在水凝胶材料上改善的细胞粘附和铺展(图10)。与仅含HA(0.016)的情况相比，24NOA6CN凝胶(0.026)的肌动蛋白丝排列指数趋向更高。24NOA6CN水凝胶(1.41)上的细胞长宽比(细胞扩散)明显高于仅含HA的水凝胶(1.28)。

细胞形态分析与XTT细胞活性测定法良好相关，因为在活性测定中表现出比仅含HA凝胶更高的活性的24NOA6CN制剂在形态测定中也显示出增强的细胞粘附和扩散的证据。

实施例9–体内组织整合性

使用大鼠皮下植入模型评估一系列制剂的体内组织整合性。在一个典型的程序中，将125μL的水凝胶以皮下团注的形式递送到大鼠的背侧。4或12周后，将团注物取出，固定在福尔马林中，然后包埋在石蜡中进行组织学检查。对组织切片进行苏木精和伊红(H&E)和胶体铁染色。用不与外源猪胶原蛋白反应的抗体对大鼠I型胶原蛋白进行免疫组织化学染色。

添加有20mg/mL HA(20NOA)和3mg/mL胶原蛋白的制剂在4周后显示增强的细胞浸润和组织到注射的填充物中的整合，这通过在注射的水凝胶团注物中发现的成纤维细胞的新宿主胶原蛋白沉积来判断(图11)。

具有28mg/mL HA(28NOA)的制剂在4周后表现出水凝胶团注物内部的包封(图12)。添加有高达11mg/mL的胶原蛋白改善了围绕水凝胶团注物周围的组织整合性/胶原蛋白沉积，但并未阻止包封。这可能表明存在可能会阻止组织整合的HA浓度的上限。

具有24mg/mL HA(24NOA)的制剂在4周后在整个大部分水凝胶团注物中表现出组织向内生长和胶原蛋白沉积(图13)。添加胶原蛋白似乎以剂量依赖的方式改善了组织整合性。24NOA6CN凝胶在水凝胶颗粒周围表现出强大的新胶原蛋白沉积。

具有24mg/mL HA和6mg/mL胶原蛋白(24NOA6CN)的制剂在皮下植入4至12周时表现出改善的组织整合性/胶原蛋白沉积(图14)。与BDDE交联的仅含HA的凝胶相比，24NOA6CN制剂的组织整合性显著改善。重要的是，这种混合凝胶制剂(24NOA6CN)也表现出与高提升力的仅含BDDE交联HA凝胶相似的提升能力。24NOA6CN制剂展示了适用于纠正体积损失和增强组织整合性的提升能力的组合。这可能会导致的临床优势是在初始体积校正后，获得自然的外观/感觉并且效果持续时间增加。

开发了一种半定量组织病理学评分系统来评估大鼠皮下注射后水凝胶团注物的组织整合性。简而言之，一位不知情的病理学家根据H&E染色切片对组织向内生长的密度(0＝最差，5＝最好)、组织带的厚度(0＝最差，5＝最好)和团注物的组织填充(-5＝无填充，0＝团注物填充有组织)进行评分。这三个分数相结合产生了最高整合性制剂的总分10和最低整合性制剂的-5分。使用该评分系统对24NOA6CN凝胶的组织整合性进行量化，并与仅含BDDE交联HA凝胶进行比较(图15)。24NOA6CN的整合性在4周时与仅含HA的凝胶相似(分别为2.33和2.5)。12周后，24NOA6CN凝胶的整合性评分高于仅含HA的凝胶(分别为5.17和2.83)。同样重要的是要注意到24NOA6CN凝胶的整合性随着时间的推移而改善，而仅含HA的凝胶基本保持不变。这可能表明随着时间的推移使用HA-胶原蛋白混合凝胶会产生改善效果。

关于本文中复数和/或单数术语的使用，本领域技术人员可以根据上下文和/或应用适当地从复数翻译成单数和/或从单数翻译成复数。为了清楚起见，可以在本文中明确阐述各种单数/复数排列。

本领域技术人员将理解，一般而言，本文中，尤其是在所附权利要求(例如，所附权利要求的主体)中使用的术语通常旨在作为“开放”术语(例如，术语“包括(including)”应解释为“包括但不限于”，术语“具有”应解释为“至少具有”，术语“包括(includes)”应解释为“包括但不限于”等)。本领域内的技术人员将还理解，如果打算引述特定数量的所引入的权利要求，则这种意图将在权利要求中明确地记载，并且在没有这种引述的情况下不存在这种意图。例如，为了帮助理解，以下所附权利要求可能包含使用介绍性短语“至少一个”和“一个或多个”来介绍权利要求的陈述。然而，此类短语的使用不应被解释为隐含如下含义：即由不定冠词“一个(a、an)”引入的权利要求陈述将包含此类引入的权利要求陈述的任何特定权利要求限制为仅包含一个此类陈述的实施方案，即使当同一权利要求包括介绍性短语“一个或多个”或“至少一个”和不定冠词，例如“一个(a、an)”(例如，“一个(a)”和/或“一个(an)”应解释为是指“至少一个”或“一个或多个”)；用于引入权利要求陈述的定冠词的使用也是如此。此外，即使明确地列举了所引入的权利要求陈述的具体数目，本领域的技术人员将认识到，这样的陈述应当被解释为至少是指所引述的数目(例如，“两次陈述”的简单陈述，而没有其他修饰语，指至少两次陈述、或两次或多次陈述)。此外，在使用类似于“A、B和C中的至少一个等”的约定的情况下，一般而言，这种结构指本领域技术人员将理解的惯例意义(例如，“具有A、B和C中的至少一个的系统”将包括但不限于以下系统，所述系统包括：单独A、单独B、单独C、A和B一起、A和C一起、B和C一起，和/或A、B和C一起等)。在使用类似于“A、B或C中的至少一个等”的约定的情况下，一般而言，这种结构指本领域技术人员将理解的惯例意义(例如，“具有A、B或C中的至少一个的系统”将包括但不限于以下系统，所述系统包括：单独A、单独B、单独C、A和B一起、A和C一起、B和C一起，和/或A、B和C一起等)。本领域技术人员将还理解，实际上呈现两个或多个替代术语的任何转折词语和/或短语，无论是在说明书、权利要求或附图中，都应被理解为考虑包括这些术语之一的可能性，任何一个条款或两个条款。例如，短语“A或B”将被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。

此外，在根据马库什组描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开因此也根据马库什组的任何个体成员或成员亚组来描述。

第一至第六方面的实施方案的任何特征都适用于本文所确定的所有方面和实施方案。此外，第一至第六方面的实施方案的任何特征可以以任何方式独立地、部分或全部地与本文描述的其他实施方案组合，例如，一个、两个或三个或更多个实施方案可以全部或部分地组合。此外，第一至第九方面的实施方案的任何特征对于其他方面或实施方案是可选的。

Claims

1.一种制备大分子基质的方法，该方法包括：

提供交联透明质酸，

提供胶原蛋白；和

将所述胶原蛋白物理混合到所述交联透明质酸中，其中所述胶原蛋白在整个所述交联透明质酸中均质混合，从而形成所述大分子基质，其中所述大分子基质包含交联透明质酸和物理混合的胶原蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述胶原蛋白以可溶状态作为溶液提供。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述胶原蛋白以酸性pH溶液的形式提供，其中所述胶原蛋白溶液的pH为约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意pH，并且其中所述胶原蛋白在酸性pH下是可溶的。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述胶原蛋白以酸性pH溶液的形式提供，其中所述胶原蛋白溶液的pH为约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意pH，并且其中所述胶原蛋白在酸性pH下是可溶的。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述胶原蛋白以中性pH溶液的形式提供。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中将所述胶原蛋白和所述交联透明质酸与缓冲液物理混合。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述缓冲溶液包括PBS。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在将所述胶原蛋白均质混合在整个所述交联透明质酸中之后，将所述大分子基质中和至pH约7。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在将所述胶原蛋白与所述交联透明质酸物理混合之前，将所述胶原蛋白中和至pH约7。

10.根据权利要求9所述的方法，其中在将所述胶原蛋白物理混合到所述交联透明质酸中之前中和所述胶原蛋白，从而导致所述胶原蛋白沉淀成胶原蛋白原纤维或颗粒，其中所述胶原蛋白原纤维或颗粒进一步混合到所述交联透明质酸中，其中所述原纤维或颗粒在整个所述交联透明质酸中均质混合。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述胶原蛋白以原纤维化胶原蛋白或胶原蛋白纤维的形式提供。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述胶原蛋白是在碱性pH下制备的，从而产生所述原纤维化胶原蛋白或胶原蛋白纤维。

13.权利要求11或12所述的方法，其中用至少一种盐制备所述胶原蛋白以获得原纤维化胶原蛋白或胶原蛋白纤维。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述至少一种盐的浓度为约20mM、约50mM、约100mM、约150mM、约200mM、约250mM、约300mM、约350mM、约400mM、约450mM或约500mM、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述至少一种盐包含阴离子，其中所述阴离子包含H₂PO^4-、SO₄ ^2-、Cl^-或SCN^-。

16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中所述至少一种盐包括NaCl、Na₂SO₄或Li₂SO₄。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述胶原蛋白在整个所述大分子基质中均质混合。

18.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述胶原蛋白在整个所述大分子基质中均匀混合。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述交联透明质酸包含透明质酸组分，所述透明质酸组分具有如下的平均分子量：约10,000道尔顿、约20,000道尔顿、约30,000道尔顿、约40,000道尔顿、约50,000道尔顿、约60,000道尔顿、约70,000道尔顿、约80,000道尔顿、约90,000道尔顿、约100,000道尔顿、约200,000道尔顿、约300,000道尔顿、约400,000道尔顿、约500,000道尔顿、约600,000道尔顿、约700,000道尔顿、约800,000道尔顿、约900,000道尔顿、约1,000,000道尔顿、约1,100,000道尔顿、约1,200,000道尔顿、约1,300,000道尔顿、约1,400,000道尔顿、约1,500,000道尔顿、约1,600,000道尔顿、约1,700,000道尔顿、约1,800,000道尔顿、约1,900,000道尔顿、约2,000,000道尔顿、约2,100,000道尔顿、约2,200,000道尔顿、约2,300,000道尔顿、约2,400,000道尔顿、约2,500,000道尔顿、约2,600,000道尔顿、约2,700,000道尔顿、约2,800,000道尔顿、约2,900,000道尔顿、约3,000,000道尔顿、约3,100,000道尔顿、约3,200,000道尔顿、约3,300,000道尔顿、约3,400,000道尔顿、约3,500,000道尔顿、约3,600,000道尔顿、约3,700,000道尔顿、约3,800,000道尔顿、约3,900,000道尔顿、约4,000,000道尔顿、约4,100,000道尔顿、约4,200,000道尔顿、约4,300,000道尔顿、约4,400,000道尔顿、约4,500,000道尔顿、约4,600,000道尔顿、约4,700,000道尔顿、约4,800,000道尔顿、约4,900,000道尔顿、约5,000,000道尔顿、约5,100,000道尔顿、约5,200,000道尔顿、约5,300,000道尔顿、约5,400,000道尔顿、约5,500,000道尔顿、约5,600,000道尔顿、约5,700,000道尔顿、约5,800,000道尔顿、约5,900,000道尔顿、约6,000,000道尔顿、约6,100,000道尔顿、约6,200,000道尔顿、约6,300,000道尔顿、约6,400,000道尔顿、约6,500,000道尔顿、约6,600,000道尔顿、约6,700,000道尔顿、约6,800,000道尔顿、约6,900,000道尔顿、约7,000,000道尔顿、约7,100,000道尔顿、约7,200,000道尔顿、约7,300,000道尔顿、约7,400,000道尔顿、约7,500,000道尔顿、约7,600,000道尔顿、约7,700,000道尔顿、约7,800,000道尔顿、约7,900,000道尔顿、约8,000,000道尔顿、约8,100,000道尔顿、约8,200,000道尔顿、约8,300,000道尔顿、约8,400,000道尔顿、约8,500,000道尔顿、约8,600,000道尔顿、约8,700,000道尔顿、约8,800,000道尔顿、约8,900,000道尔顿、约9,000,000道尔顿、约9,100,000道尔顿、约9,200,000道尔顿、约9,300,000道尔顿、约9,400,000道尔顿、约9,500,000道尔顿、约9,600,000道尔顿、约9,700,000道尔顿、约9,800,000道尔顿、约9,900,000道尔顿或约10,000,000道尔顿、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意分子量。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述交联透明质酸包含透明质酸组分的混合物，所述透明质酸组分包含至少两种不同的分子量。

21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述方法还包括将利多卡因添加到所述大分子基质中。

22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述利多卡因在所述基质中的浓度在约0.15％(w/w)至约0.45％(w/w)的范围之间。

23.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述利多卡因的浓度为所述基质的约0.15％(w/w)、约0.17％(w/w)、约0.19％(w/w)、约0.21％(w/w)、约0.23％(w/w)、约0.25％(w/w)、约0.27％(w/w)、约0.29％(w/w)、约0.31％(w/w)、约0.33％(w/w)、约0.35％(w/w)、约0.37％(w/w)、约0.39％(w/w)、约0.41％(w/w)、约0.43％(w/w)或约0.45％(w/w)、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

24.根据权利要求21至23中任一项所述的方法，其中所述利多卡因在所述基质中的浓度在约0.27％(w/w)至约0.33％(w/w)的范围之间。

25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述基质还包含未交联的HA。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述未交联的HA在所述基质中的浓度高达约5％(w/w)。

27.根据权利要求25或26所述的方法，其中所述未交联的HA在所述基质中的浓度为约0％(w/w)、约1％(w/w)、约2％(w/w)、约3％(w/w)、约4％(w/w)、约5％(w/w)或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

28.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中所述未交联的HA在所述基质中的浓度为约1％(w/w)。

29.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中所述未交联HA在所述基质中的浓度为约2％(w/w)。

30.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中所述未交联的HA在所述基质中的浓度为约5％(w/w)。

31.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述大分子基质具有增强的通过针的可挤出性，其中所述针包括27G、28G、29G、30G、31G或32G的计量尺寸。

32.根据权利要求1至31中任一项所述的方法，其中所述大分子基质在至少6个月是稳定的。

33.根据权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述大分子基质在约6、约9、约12、约15、约18、约21、约24、约27、约30、约33或约36个月或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意时间量是稳定的。

34.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述大分子基质在约4℃、约5℃、约10℃、约15℃、约20℃、约25℃的温度或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意温度下是稳定的。

35.根据权利要求1至34中任一项所述的方法，其中所述大分子基质在约4℃是稳定的。

36.根据权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述大分子基质在约25℃是稳定的。

37.根据权利要求1至36中任一项所述的方法，其中所述大分子基质在约3、约6、约9、约12、约15、约18、约21、约24、约27、约30、约33或约36个月、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意时间量具有最小的降解。

38.一种制备大分子基质的方法，该方法包括：

将透明质酸溶解在水溶液中以形成预反应水溶液和

制备第二溶液，其中所述第二溶液包括：

a)水溶性碳二亚胺；和

N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基磺基琥珀酰亚胺；或者

b)在氢氧化钠存在下的透明质酸钠溶液中的1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)；以及

将所述第二溶液添加到所述预反应水溶液中以形成交联反应混合物；

使所述透明质酸交联，其中所述交联反应混合物通过使所述透明质酸交联而发生反应，从而形成所述交联透明质酸；以及

提供胶原蛋白；以及

将所述胶原蛋白物理混合到所述交联透明质酸中，从而产生包含交联透明质酸和胶原蛋白的大分子基质，其中所述胶原蛋白在整个所述交联透明质酸中均质混合。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述第二溶液包含水溶性碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基磺基琥珀酰亚胺，其中所述透明质酸与天然存在的胺交联，从而形成所述交联透明质酸。

40.根据权利要求38或39所述的方法，其中所述第二溶液包含所述水溶性碳二亚胺和所述N-羟基琥珀酰亚胺或所述N-羟基磺基琥珀酰亚胺并且其中所述交联在MES的存在下进行。

41.根据权利要求38所述的方法，其中所述第二溶液包含在氢氧化钠存在下在透明质酸钠溶液中的1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)，并且其中所述BDDE用于利用环氧化物化学使所述透明质酸交联。

42.根据权利要求38至41中任一项所述的方法，其中所述胶原蛋白以可溶状态作为溶液提供。

43.根据权利要求38至42中任一项所述的方法，其中物理混合步骤是在存在缓冲液的情况下进行的。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述缓冲液包括PBS。

45.根据权利要求38至44中任一项所述的方法，其中所述胶原蛋白以胶原蛋白溶液的形式提供，其中所述胶原蛋白溶液的pH为约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意pH，并且其中所述胶原蛋白在酸性pH下是可溶的。

46.根据权利要求38至45中任一项所述的方法，其中所述胶原蛋白以酸性pH溶液的形式提供，其中所述胶原蛋白溶液的pH为约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意pH，并且其中所述胶原蛋白在酸性pH下是可溶的。

47.根据权利要求38至46中任一项所述的方法，其中所述胶原蛋白以酸性至中性pH提供。

48.根据权利要求38至46中任一项所述的方法，还包括在将所述胶原蛋白均质混合在整个所述交联透明质酸中之后，将所述大分子基质中和至pH约7。

49.根据权利要求38至48中任一项所述的方法，还包括在将所述胶原蛋白与所述交联透明质酸物理混合之前将所述胶原蛋白中和至pH约7，其中在将所述胶原蛋白物理混合到所述交联透明质酸中之前中和所述胶原蛋白从而导致所述胶原蛋白沉淀成胶原蛋白原纤维或颗粒，其中所述胶原蛋白原纤维或颗粒进一步混合到所述交联透明质酸中，其中所述原纤维或颗粒在整个所述交联透明质酸中均质混合。

50.根据权利要求49所述的方法，其中所述胶原蛋白以原纤维化胶原蛋白或胶原蛋白纤维的形式提供。

51.根据权利要求50所述的方法，其中所述胶原蛋白是在碱性pH下制备的，从而产生所述原纤维化胶原蛋白或胶原蛋白纤维。

52.根据权利要求50或51所述的方法，其中用至少一种盐制备所述胶原蛋白以获得原纤维化胶原蛋白或胶原蛋白纤维。

53.根据权利要求52所述的方法，其中所述至少一种盐的浓度为约20mM、约50mM、约100mM、约150mM、约200mM、约250mM、约300mM、约350mM、约400mM、约450mM或约500mM、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

54.根据权利要求52或53所述的方法，其中所述至少一种盐包含阴离子，其中所述阴离子包含H₂PO^4-、SO₄ ^2-、Cl^-或SCN^-。

55.根据权利要求52至54中任一项所述的方法，其中所述至少一种盐包括NaCl、Na₂SO₄或Li₂SO₄。

56.根据权利要求38至55中任一项所述的方法，其中所述透明质酸包含如下的平均分子量：约10,000道尔顿、约20,000道尔顿、约30,000道尔顿、40,000道尔顿、约50,000道尔顿、约60,000道尔顿、约70,000道尔顿、约80,000道尔顿、约90,000道尔顿、约100,000道尔顿、约200,000道尔顿、约300,000道尔顿、约400,000道尔顿、约500,000道尔顿、约600,000道尔顿、约700,000道尔顿、约800,000道尔顿、约900,000道尔顿、约1,000,000道尔顿、约1,100,000道尔顿、约1,200,000道尔顿、约1,300,000道尔顿、约1,400,000道尔顿、约1,500,000道尔顿、约1,600,000道尔顿、约1,700,000道尔顿、约1,800,000道尔顿、约1,900,000道尔顿、约2,000,000道尔顿、约2,100,000道尔顿、约2,200,000道尔顿、约2,300,000道尔顿、约2,400,000道尔顿、约2,500,000道尔顿、约2,600,000道尔顿、约2,700,000道尔顿、约2,800,000道尔顿、约2,900,000道尔顿、约3,000,000道尔顿、约3,100,000道尔顿、约3,200,000道尔顿、约3,300,000道尔顿、约3,400,000道尔顿、约3,500,000道尔顿、约3,600,000道尔顿、约3,700,000道尔顿、约3,800,000道尔顿、约3,900,000道尔顿、约4,000,000道尔顿、约4,100,000道尔顿、约4,200,000道尔顿、约4,300,000道尔顿、约4,400,000道尔顿、约4,500,000道尔顿、约4,600,000道尔顿、约4,700,000道尔顿、约4,800,000道尔顿、约4,900,000道尔顿、约5,000,000道尔顿、约5,100,000道尔顿、约5,200,000道尔顿、约5,300,000道尔顿、约5,400,000道尔顿、约5,500,000道尔顿、约5,600,000道尔顿、约5,700,000道尔顿、约5,800,000道尔顿、约5,900,000道尔顿、约6,000,000道尔顿、约6,100,000道尔顿、约6,200,000道尔顿、约6,300,000道尔顿、约6,400,000道尔顿、约6,500,000道尔顿、约6,600,000道尔顿、约6,700,000道尔顿、约6,800,000道尔顿、约6,900,000道尔顿、约7,000,000道尔顿、约7,100,000道尔顿、约7,200,000道尔顿、约7,300,000道尔顿、约7,400,000道尔顿、约7,500,000道尔顿、约7,600,000道尔顿、约7,700,000道尔顿、约7,800,000道尔顿、约7,900,000道尔顿、约8,000,000道尔顿、约8,100,000道尔顿、约8,200,000道尔顿、约8,300,000道尔顿、约8,400,000道尔顿、约8,500,000道尔顿、约8,600,000道尔顿、约8,700,000道尔顿、约8,800,000道尔顿、约8,900,000道尔顿、约9,000,000道尔顿、约9,100,000道尔顿、约9,200,000道尔顿、约9,300,000道尔顿、约9,400,000道尔顿、约9,500,000道尔顿、约9,600,000道尔顿、约9,700,000道尔顿、约9,800,000道尔顿、约9,900,000道尔顿或约10,000,000道尔顿、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意分子量。

57.根据权利要求38至56中任一项所述的方法，其中所述透明质酸包含透明质酸组分的混合物，所述透明质酸组分包含至少两种不同的分子量。

58.根据权利要求38至57中任一项所述的方法，其中所述溶解步骤还包括将透明质酸和胶原蛋白两者溶解在水溶液中以形成包含透明质酸和胶原蛋白两者的预反应水溶液，并且其中交联反应通过将所述透明质酸和所述胶原蛋白交联成HA-胶原蛋白偶联凝胶而反应，并且其中所述混合步骤包括将所述HA-胶原蛋白偶联凝胶与另外的胶原蛋白物理混合，其中所述胶原蛋白处于可溶状态并且其中所述胶原蛋白处于溶液中，其中所述溶液处于酸性pH，从而产生包含具有物理混合在胶原蛋白中的HA-胶原蛋白偶联凝胶的大分子基质。

59.根据权利要求38至58中任一项所述的方法，其中在与胶原蛋白混合的所述混合步骤之后形成胶原蛋白原纤维或胶原蛋白沉淀物，并且其中所述胶原蛋白原纤维或胶原蛋白沉淀物在所述交联透明质酸内均质混合。

60.根据权利要求38至58中任一项所述的方法，其中在与胶原蛋白混合的所述混合步骤期间形成胶原蛋白原纤维或胶原蛋白沉淀物，并且其中所述胶原蛋白原纤维或胶原蛋白沉淀物在所述交联透明质酸内均质混合

61.根据权利要求1至60中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在将所述胶原蛋白混合在整个所述交联透明质酸中之后调节所述大分子基质的渗透压。

62.根据权利要求1至61中任一项所述的方法，其中所述混合步骤在室温下进行。

63.根据权利要求1至61中任一项所述的方法，其中所述混合步骤在约4℃进行。

64.根据权利要求1至63中任一项所述的方法，其中所述方法在约4℃进行。

65.根据权利要求1至64中任一项所述的方法，其中所述方法还包括纯化所述交联透明质酸或HA-胶原蛋白偶联凝胶，其中在与所述胶原蛋白混合的所述混合步骤之前进行所述纯化。

66.根据权利要求65所述的方法，其中使用透析纯化进行所述纯化。

67.根据权利要求65或66的方法，其中在所述交联完成后调节所述交联反应混合物的pH，其中调节pH在所述纯化步骤之前进行，并且其中pH调节至约7.0、约7.2、约7.4、约7.6或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意pH。

68.根据权利要求65至67中任一项所述的方法，其中在约2℃和约8℃之间的范围之间进行所述纯化。

69.根据权利要求65至68中任一项所述的方法，其中在约2℃、约4℃、约6℃或约8℃、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意温度下进行所述纯化。

70.根据权利要求65至69中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在与所述胶原蛋白混合之前对所述交联透明质酸或HA-胶原蛋白偶联凝胶进行灭菌的灭菌步骤，其中在所述纯化步骤之后进行所述灭菌步骤。

71.根据权利要求70所述的方法，其中所述灭菌步骤包括将所述交联透明质酸或HA-胶原蛋白偶联凝胶转移到容器中以进行灭菌；和对交联透明质酸或HA-胶原蛋白偶联凝胶进行灭菌。

72.根据权利要求71所述的方法，其中所述容器是注射器。

73.根据权利要求70至72中任一项所述的方法，其中通过热(干热、蒸汽热、湿热灭菌)、辐射(非电离、UV)、电离(粒子(β射线、γ射线、x射线)、电磁(电子束)、过滤或终端灭菌进行所述灭菌。

74.根据权利要求1至73中任一项所述的方法，其中所述方法还包括透析所述交联的大分子基质或HA-胶原蛋白偶联凝胶，其中通过具有在1000道尔顿至约100,000道尔顿之间的范围之间的分子量截止值的膜进行透析，并且其中在灭菌之前进行所述透析。

75.根据权利要求74所述的方法，其中在缓冲液中进行所述透析。

76.根据权利要求75所述的方法，其中所述缓冲液包括磷酸盐缓冲盐水或磷酸钠缓冲液。

77.根据权利要求75或76中任一项所述的方法，其中所述缓冲液还包含NaCl和/或KCl。

78.根据权利要求38至75中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在交联反应完成后将所述交联透明质酸或HA-胶原蛋白偶联凝胶的pH升高至中性pH，其中升高pH在灭菌步骤之前进行。

79.根据权利要求38至75中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在交联反应完成后将所述交联透明质酸或HA-胶原蛋白偶联凝胶的pH升高至约7.0、约7.2或约7.4、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意pH，其中升高pH在灭菌步骤之前进行。

80.根据权利要求38至78中任一项所述的方法，其中所述第二溶液包含所述水溶性碳二亚胺和所述N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基磺基琥珀酰亚胺，并且其中所述添加和交联步骤在约4℃和约22℃之间的温度下进行。

81.根据权利要求80所述的方法，其中所述交联在约22℃进行。

82.根据权利要求80所述的方法，其中所述交联在约4℃进行。

83.根据权利要求38至78中任一项所述的方法，其中所述第二溶液包含在氢氧化钠存在下的透明质酸钠溶液中的1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)，并且其中所述添加和交联步骤在约45℃和约75℃之间进行。

84.根据权利要求38至83中任一项所述的方法，其中所述第二溶液包含在氢氧化钠存在下的透明质酸钠溶液中的1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)，并且其中所述添加和交联步骤是在约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃的温度下、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意温度下进行。

85.根据权利要求38至84中任一项所述的方法，其中所述第二溶液包含在氢氧化钠存在下的透明质酸钠溶液中的1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)，并且其中所述添加和交联步骤在约50℃的温度下进行。

86.根据权利要求1至85中任一项所述的方法，其中所述方法包括在形成包含所述交联透明质酸和胶原蛋白的所述大分子基质之后或在形成具有物理混合在胶原蛋白中的HA-胶原蛋白偶联凝胶之后进行的中和步骤，其中所述中和步骤包括将大分子基质调节至生理pH和生理盐浓度。

87.根据权利要求86所述的方法，其中所述中和包括在所述混合步骤之后，在无菌条件下添加碱性溶液或缓冲溶液以调节pH。

88.根据权利要求86或87所述的方法，其中调节pH和生理盐浓度从而导致胶原蛋白沉淀成原纤维或颗粒，其中所述胶原蛋白原纤维或颗粒均质分布在所述大分子基质中。

89.根据权利要求38至88中任一项所述的方法，其中所述方法还包括停止所述交联步骤，其中所述停止步骤包括向所述交联反应混合物中添加碱至pH在约8和约10之间至少10分钟，然后向交联混合物中添加酸性溶液，直到pH达到约7。

90.根据权利要求38至89中任一项所述的方法，其中所述天然存在的胺来自赖氨酸。

91.根据权利要求38至90中任一项所述的方法，其中所述交联反应混合物的pH在约4.0和约10.0之间。

92.根据权利要求91所述的方法，其中所述交联反应混合物的pH在约4.0和约6.0之间。

93.根据权利要求38至78或83至92中任一项所述的方法，其中所述第二溶液包含在氢氧化钠存在下在透明质酸钠溶液中的1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)，并且其中所述交联是在碱性条件下进行。

94.根据权利要求38至93中任一项所述的方法，其中所述预反应溶液包含盐，其中所述盐的浓度为约50mM、约75mM、约100mM、约125mM、约150mM、约175mM、约200mM、约225mM、约250mM、约275mM、约300mM、325mM、约350mM、约375mM、约400mM、约425mM、约450mM、约475mM、约500mM或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

95.根据权利要求38至81、86至92或94中任一项所述的方法，其中所述水溶性碳二亚胺是1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺并且其中所述水溶性碳二亚胺在所述交联反应混合物中的浓度为约20mM至约300mM。

96.根据权利要求95所述的方法，其中所述水溶性碳二亚胺为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，其浓度为约20mM、约40mM、约60mM、约80mM、约100mM、约120mM、约140mM、约160mM、约180mM、约200mM、约220mM、约240mM、约260mM、约280mM、约300mM或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

97.根据权利要求38至81、86至92或94至96中任一项所述的方法，其中所述水溶性碳二亚胺和透明质酸的水溶性碳二亚胺:透明质酸重复单元的摩尔比为约0.3至约3.0。

98.根据权利要求97所述的方法，其中所述水溶性碳二亚胺和透明质酸的水溶性碳二亚胺:透明质酸重复单元的摩尔比为约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9或约3.0、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意摩尔比。

99.根据权利要求38至98中任一项所述的方法，其中所述赖氨酸和透明质酸的摩尔:摩尔(赖氨酸:HA重复单元)比为约0.01至约0.6。

100.根据权利要求99所述的方法，其中所述赖氨酸和透明质酸的摩尔:摩尔(赖氨酸:HA重复单元)比为约0.01、约0.02、约0.03、约0.04、约0.05、约0.06、约0.07、约0.08、约0.09、约0.10、约0.11、约0.12、约0.13、约0.14、约0.15、约0.16、约0.17、约0.18、约0.19、约0.2、约0.21、约0.22、约0.23、约0.24、约0.25、约0.26、约0.27、约0.28、约0.29、约0.3、约0.31、约0.32、约0.33、约0.34、约0.35、约0.36、约0.37、约0.38、约0.39、约0.4、约0.41、约0.42、约0.43、约0.44、约0.45、约0.46、约0.47、约0.48、约0.49、约0.5、约0.51、约0.52、约0.53、约0.54、约0.55、约0.56、约0.57、约0.58、约0.59、约0.6或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意摩尔比。

101.根据权利要求38中任一项所述的方法，其中所述预反应溶液中的透明质酸在添加第二溶液之前水合至少约60分钟。

102.根据权利要求38至101中任一项所述的方法，其中反应混合物的交联进行约4小时至约24小时。

103.根据权利要求38至102中任一项所述的方法，其中所述方法还包括将利多卡因添加到所述大分子基质中。

104.权利要求103的方法，其中所述利多卡因在所述基质中的浓度在约0.15％(w/w)至约0.45％(w/w)的范围之间。

105.根据权利要求103或104所述的方法，其中所述利多卡因在所述基质中的浓度为约0.15％(w/w)、约0.17％(w/w)、约0.19％(w/w)、约0.21％(w/w)、约0.23％(w/w)、约0.25％(w/w)、约0.27％(w/w)、约0.29％(w/w)、约0.31％(w/w)、约0.33％(w/w)、约0.35％(w/w)、约0.37％(w/w)、约0.39％(w/w)、约0.41％(w/w)、约0.43％(w/w)或约0.45％(w/w)、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

106.根据权利要求103至105中任一项所述的方法，其中所述利多卡因在所述基质中的浓度在约0.27％(w/w)至约0.33％(w/w)的范围之间。

107.根据权利要求38至106中任一项所述的方法，其中所述基质还包含未交联的HA。

108.根据权利要求107所述的方法，其中所述未交联的HA在所述基质中的浓度高达约5％(w/w)。

109.根据权利要求107至108所述的方法，其中所述未交联的HA在所述基质中的浓度为约0％(w/w)、约1％(w/w)、约2％(w/w)、约3％(w/w)、约4％(w/w)、约5％(w/w)或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

110.根据权利要求107至109中任一项所述的方法，其中所述未交联的HA在所述基质中的浓度为约1％(w/w)。

111.根据权利要求107至109中任一项所述的方法，其中所述未交联的HA在所述基质中的浓度为约2％(w/w)。

112.根据权利要求107至109中任一项所述的方法，其中所述未交联的HA在所述基质中的浓度为约5％(w/w)。

113.根据权利要求38至112中任一项所述的方法，其中所述大分子基质具有增强的通过针的可挤出性，其中所述针包括27G、28G、29G、30G、31G或32G的计量尺寸。

114.根据权利要求1至113中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在将所述胶原蛋白添加到所述交联HA中之前浓缩所述胶原蛋白。

115.一种通过权利要求1至114中任一项所述的方法制备的大分子基质。

116.根据权利要求115所述的大分子基质，其中所述大分子基质包含交联透明质酸，其中所述胶原蛋白与交联透明质酸物理混合，并且其中所述胶原蛋白在整个大分子复合物中是均质的。

117.根据权利要求115所述的大分子基质，其中所述大分子基质包含HA-胶原蛋白偶联凝胶，其中所述HA-胶原蛋白偶联凝胶还包含未交联于所述HA-胶原蛋白偶联凝胶中的物理混合的胶原蛋白。

118.一种大分子基质，包括：

透明质酸，其中所述透明质酸是交联的；和

胶原蛋白；其中所述胶原蛋白与所述交联透明质酸物理混合。

119.一种大分子基质，包括：

HA-胶原蛋白偶联凝胶，其中所述HA-胶原蛋白偶联凝胶包含与胶原蛋白交联的透明质酸；和

物理混合的胶原蛋白，其中所述物理混合的胶原蛋白不与HA-胶原蛋白偶联凝胶交联，并且其中物理混合的胶原蛋白在HA-胶原蛋白偶联凝胶内均质混合。

120.根据权利要求115至119中任一项所述的大分子基质，其中所述透明质酸与天然存在的胺交联。

121.根据权利要求120所述的大分子基质，其中所述天然存在的胺来自赖氨酸。

122.根据权利要求115至121中任一项所述的大分子基质，其中所述胶原蛋白来自牛胶原蛋白、海洋胶原蛋白、人胶原蛋白或猪胶原蛋白。

123.根据权利要求115至122中任一项所述的大分子基质，其中所述胶原蛋白是重组人胶原蛋白。

124.根据权利要求115至123中任一项所述的大分子基质，其中所述大分子基质的弹性模量(G')为约100Pa、约200Pa、约300Pa、约400Pa、约500Pa、约600Pa、约700Pa、约800Pa、约900Pa、约1000Pa、约1100Pa、约1200Pa、约1300Pa、约1400Pa、约1500Pa、约1600Pa、约1700Pa、约1800Pa、约1900Pa、约2000Pa、约2100Pa、约2200Pa、约2300Pa、约2400Pa、约2500Pa、约2600Pa、约2700Pa、约2800Pa、约2900Pa、或约3000Pa、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意值。

125.根据权利要求115至124中任一项所述的大分子基质，其中所述大分子基质的压缩力值为约10gmf、约20gmf、约30gmf、约40gmf、约50gmf、约60gmf、约70gmf、约80gmf、约90gmf、约100gmf、约110gmf、约120gmf、约130gmf、约140gmf、约150gmf、约160gmf、约170gmf、约180gmf、约190gmf、约200gmf、约210gmf、约220gmf、约230gmf、约240gmf、约250gmf、约260gmf、约270gmf、约280gmf、约290gmf、约300gmf、约310gmf、约320gmf、约330gmf、约340gmf、约350gmf、约360gmf、约370gmf、约380gmf、约390gmf、约400gmf、约410gmf、约420gmf、约430gmf、约440gmf、约450gmf、约460gmf、约470gmf、约480gmf、约490gmf、约500gmf、约510gmf、约520gmf、约530gmf、约540gmf、约550gmf、约560gmf、约570gmf、约580gmf、约590gmf或约600gmf、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意压缩力值。

126.根据权利要求115至125中任一项所述的大分子基质，其中所述透明质酸的浓度为约2mg/mL、约4mg/mL、约6mg/mL、约8mg/mL、约10mg/mL、约12mg/mL、约14mg/mL、约16mg/mL、约18mg/mL、约20mg/mL、约22mg/mL、约24mg/mL、约26mg/mL、约28mg/mL、约30mg/mL、32mg/mL、约34mg/mL或约36mg/mL、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

127.根据权利要求115至126中任一项所述的大分子基质，透明质酸与胶原蛋白的重量比为约20:3、约24:2.3、约24:10、约24:12、约24:4、约24:6、约28:6或约28:11。

128.根据权利要求115至127中任一项所述的大分子基质，其中所述交联透明质酸包含具有如下平均分子量的透明质酸组分：约10,000道尔顿、约20,000道尔顿、约30,000道尔顿、40,000道尔顿、约50,000道尔顿、约60,000道尔顿、约70,000道尔顿、约80,000道尔顿、约100,000道尔顿、约200,000道尔顿、约300,000道尔顿、约400,000道尔顿、约500,000道尔顿、约600,000道尔顿、约700,000道尔顿、约800,000道尔顿、约900,000道尔顿、约1,000,000道尔顿、约1,100,000道尔顿、约1,200,000道尔顿、约1,300,000道尔顿、约1,400,000道尔顿、约1,500,000道尔顿、约1,600,000道尔顿、约1,700,000道尔顿、约1,800,000道尔顿、约1,900,000道尔顿、约2,000,000道尔顿、约2,100,000道尔顿、约2,200,000道尔顿、约2,300,000道尔顿、约2,400,000道尔顿、约2,500,000道尔顿、约2,600,000道尔顿、约2,700,000道尔顿、约2,800,000道尔顿、约2,900,000道尔顿、约3,000,000道尔顿、约3,100,000道尔顿、约3,200,000道尔顿、约3,300,000道尔顿、约3,400,000道尔顿、约3,500,000道尔顿、约3,600,000道尔顿、约3,700,000道尔顿、约3,800,000道尔顿、约3,900,000道尔顿、约4,000,000道尔顿、约4,100,000道尔顿、约4,200,000道尔顿、约4,300,000道尔顿、约4,400,000道尔顿、约4,500,000道尔顿、约4,600,000道尔顿、约4,700,000道尔顿、约4,800,000道尔顿、约4,900,000道尔顿、约5,000,000道尔顿、约5,100,000道尔顿、约5,200,000道尔顿、约5,300,000道尔顿、约5,400,000道尔顿、约5,500,000道尔顿、约5,600,000道尔顿、约5,700,000道尔顿、约5,800,000道尔顿、约5,900,000道尔顿、约6,000,000道尔顿、约6,100,000道尔顿、约6,200,000道尔顿、约6,300,000道尔顿、约6,400,000道尔顿、约6,500,000道尔顿、约6,600,000道尔顿、约6,700,000道尔顿、约6,800,000道尔顿、约6,900,000道尔顿、约7,000,000道尔顿、约7,100,000道尔顿、约7,200,000道尔顿、约7,300,000道尔顿、约7,400,000道尔顿、约7,500,000道尔顿、约7,600,000道尔顿、约7,700,000道尔顿、约7,800,000道尔顿、约7,900,000道尔顿、约8,000,000道尔顿、约8,100,000道尔顿、约8,200,000道尔顿、约8,300,000道尔顿、约8,400,000道尔顿、约8,500,000道尔顿、约8,600,000道尔顿、约8,700,000道尔顿、约8,800,000道尔顿、约8,900,000道尔顿、约9,000,000道尔顿、约9,100,000道尔顿、约9,200,000道尔顿、约9,300,000道尔顿、约9,400,000道尔顿、约9,500,000道尔顿、约9,600,000道尔顿、约9,700,000道尔顿、约9,800,000道尔顿、约9,900,000道尔顿或约10,000,000道尔顿、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意重量。

129.根据权利要求128所述的大分子基质，其中所述透明质酸组分包含透明质酸组分的混合物，所述透明质酸组分包含至少两种不同的分子量。

130.根据权利要求115至129中任一项所述的大分子基质，其中所述透明质酸包含透明质酸的混合物，其中所述混合物包含具有两种不同分子量的HA的50:50共混物。

131.根据权利要求115至130中任一项所述的大分子基质，其中所述胶原蛋白包括I型胶原蛋白和/或III型胶原蛋白。

132.根据权利要求115至131中任一项所述的大分子基质，其中所述胶原蛋白的浓度为约1mg/mL、约2mg/mL、约3mg/mL、约4mg/mL、约6mg/mL、约7mg/mL、约8mg/mL、约9mg/mL、约10mg/mL、约11mg/mL、约12mg/mL、约13mg/mL、约14mg/mL或约15mg/mL、约16mg/mL、约17mg/mL、约18mg/mL、约19mg/mL、约20mg/mL、约21mg/mL、约22mg/mL、约23mg/mL、约24mg/mL、约25mg/mL或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

133.根据权利要求115至132中任一项所述的大分子基质，其中所述大分子基质具有约250mOsm/kg和约390mOsm/kg之间的渗透压。

134.根据权利要求115至133中任一项所述的大分子基质，其中所述大分子基质具有约250mOsm/kg、约275mOsm/kg、约300mOsm/kg、约325mOsm/kg或约390mOsm之间的渗透压、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意渗透压。

135.根据权利要求115至134中任一项所述的大分子基质，其中所述透明质酸是线性的。

136.根据权利要求115至135中任一项所述的大分子基质，其中所述大分子基质的粘性模量(G”)为：约10Pa、约20Pa、约30Pa、约40Pa、约50Pa、约60Pa、约70Pa、约80Pa、约90Pa、约100Pa、约200Pa、约300Pa、约400Pa、约500Pa、约600Pa、约700Pa、约800Pa、约900Pa或约1000Pa、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意粘性模量(G”)。

137.根据权利要求115至136中任一项所述的大分子基质，其中所述大分子基质的介质损耗角正切值(G”/G')为约0.01、约0.02、约0.03、约0.04、约0.05、约0.06、约0.07、约0.08、约0.09、约0.1、约0.12、约0.14、约0.16、约0.18、约0.20、约0.22、约0.24、约0.26、约0.28、约0.30、约0.32、约0.34、约0.36、约0.38、约0.40、约0.42、约0.44、约0.46、约0.48、约0.50、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意介质损耗角正切值(G”/G')。

138.根据权利要求115至137中任一项所述的大分子基质，其中所述大分子基质的pH为约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意pH

139.根据权利要求115至138中任一项所述的大分子基质，其中所述大分子基质还包含利多卡因。

140.根据权利要求139所述的大分子基质，其中所述利多卡因在所述基质中的浓度为约0.15％(w/w)、约0.17％(w/w)、约0.19％(w/w)、约0.21％(w/w)、约0.23％(w/w)、约0.25％(w/w)、约0.27％(w/w)、约0.29％(w/w)、约0.31％(w/w)、约0.33％(w/w)、约0.35％(w/w)、约0.37％(w/w)、约0.39％(w/w)、约0.41％(w/w)、约0.43％(w/w)或约0.45％(w/w)、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

141.根据权利要求139或140中任一项所述的大分子基质，其中所述利多卡因在所述基质中的浓度在约0.27％(w/w)至约0.33％(w/w)的范围之间。

142.根据权利要求115至141中任一项所述的大分子基质，其中所述基质还包含未交联的HA。

143.根据权利要求142所述的大分子基质，其中所述未交联的HA在所述基质中的浓度高达约5％(w/w)。

144.根据权利要求142至143所述的大分子基质，其中所述未交联HA在所述基质中的浓度为约0％(w/w)、约1％(w/w)、约2％(w/w)、约3％(w/w)、约4％(w/w)、约5％(w/w)或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

145.根据权利要求142至144中任一项所述的大分子基质，其中所述未交联的HA在所述基质中的浓度为约1％(w/w)。

146.根据权利要求142至144中任一项所述的大分子基质，其中所述未交联的HA在所述基质中的浓度为约2％(w/w)。

147.根据权利要求142至144中任一项所述的大分子基质，其中所述未交联的HA在所述基质中的浓度为约5％(w/w)。

148.根据权利要求115至147中任一项所述的大分子基质，其中所述大分子基质具有增强的通过针的可挤出性，其中所述针包括27G、28G、29G、30G、31G或32G的计量尺寸。

149.一种改善人体解剖特征的美学质量的方法，包括：

将组合物注射到人体组织中，从而提高解剖特征的美学质量；

其中所述组合物包含根据权利要求1至102中任一项所述的方法制备的大分子基质或根据权利要求115至139中任一项所述的大分子基质。

150.一种改善人体解剖特征的美学质量的方法，包括：

其中所述组合物包含大分子基质，该大分子基质包含：

交联透明质酸；

赖氨酸；和

胶原蛋白；

其中所述胶原蛋白与所述交联透明质酸物理混合。

151.根据权利要求150所述的方法，其中所述组合物还包含利多卡因。

152.根据权利要求151所述的方法，其中所述利多卡因在所述基质中的浓度在0.15％(w/w)至0.45％(w/w)的范围之间。

153.根据权利要求151或152所述的方法，其中所述利多卡因在所述基质中的浓度为约0.15％(w/w)、约0.17％(w/w)、约0.19％(w/w)、约0.21％(w/w)、约0.23％(w/w)、约0.25％(w/w)、约0.27％(w/w)、约0.29％(w/w)、约0.31％(w/w)、约0.33％(w/w)、约0.35％(w/w)、约0.37％(w/w)、约0.39％(w/w)、约0.41％(w/w)、约0.43％(w/w)或约0.45％(w/w)、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

154.根据权利要求151至153中任一项所述的方法，其中所述利多卡因在所述基质中的浓度在约0.27％(w/w)至约0.33％(w/w)的范围之间。

155.根据权利要求150至154中任一项所述的方法，其中所述组合物还包含未交联的HA。

156.根据权利要求155所述的方法，其中所述未交联的HA在所述基质中的浓度高达约5％(w/w)。

157.根据权利要求155或156所述的方法，其中所述未交联的HA在所述基质中的浓度为约0％(w/w)、约1％(w/w)、约2％(w/w)、约3％(w/w)、约4％(w/w)、约5％(w/w)或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

158.根据权利要求155至157中任一项所述的方法，其中所述未交联的HA在所述基质中的浓度为约1％(w/w)。

159.根据权利要求155至157中任一项所述的方法，其中所述未交联的HA在所述基质中的浓度为约2％(w/w)。

160.根据权利要求155至157中任一项所述的方法，其中所述未交联的HA在所述基质中的浓度为约5％(w/w)。

161.根据权利要求150至160中任一项所述的方法，其中所述交联透明质酸包含具有如下平均分子量的透明质酸组分：约10,000道尔顿、约20,000道尔顿、约30,000道尔顿、40,000道尔顿、约50,000道尔顿、约60,000道尔顿、约70,000道尔顿、约80,000道尔顿、约100,000道尔顿、约200,000道尔顿、约300,000道尔顿、约400,000道尔顿、约500,000道尔顿、约600,000道尔顿、约700,000道尔顿、约800,000道尔顿、约900,000道尔顿、约1,000,000道尔顿、约1,100,000道尔顿、约1,200,000道尔顿、约1,300,000道尔顿、约1,400,000道尔顿、约1,500,000道尔顿、约1,600,000道尔顿、约1,700,000道尔顿、约1,800,000道尔顿、约1,900,000道尔顿、约2,000,000道尔顿、约2,100,000道尔顿、约2,200,000道尔顿、约2,300,000道尔顿、约2,400,000道尔顿、约2,500,000道尔顿、约2,600,000道尔顿、约2,700,000道尔顿、约2,800,000道尔顿、约2,900,000道尔顿、约3,000,000道尔顿、约3,100,000道尔顿、约3,200,000道尔顿、约3,300,000道尔顿、约3,400,000道尔顿、约3,500,000道尔顿、约3,600,000道尔顿、约3,700,000道尔顿、约3,800,000道尔顿、约3,900,000道尔顿、约4,000,000道尔顿、约4,100,000道尔顿、约4,200,000道尔顿、约4,300,000道尔顿、约4,400,000道尔顿、约4,500,000道尔顿、约4,600,000道尔顿、约4,700,000道尔顿、约4,800,000道尔顿、约4,900,000道尔顿、约5,000,000道尔顿、约5,100,000道尔顿、约5,200,000道尔顿、约5,300,000道尔顿、约5,400,000道尔顿、约5,500,000道尔顿、约5,600,000道尔顿、约5,700,000道尔顿、约5,800,000道尔顿、约5,900,000道尔顿、约6,000,000道尔顿、约6,100,000道尔顿、约6,200,000道尔顿、约6,300,000道尔顿、约6,400,000道尔顿、约6,500,000道尔顿、约6,600,000道尔顿、约6,700,000道尔顿、约6,800,000道尔顿、约6,900,000道尔顿、约7,000,000道尔顿、约7,100,000道尔顿、约7,200,000道尔顿、约7,300,000道尔顿、约7,400,000道尔顿、约7,500,000道尔顿、约7,600,000道尔顿、约7,700,000道尔顿、约7,800,000道尔顿、约7,900,000道尔顿、约8,000,000道尔顿、约8,100,000道尔顿、约8,200,000道尔顿、约8,300,000道尔顿、约8,400,000道尔顿、约8,500,000道尔顿、约8,600,000道尔顿、约8,700,000道尔顿、约8,800,000道尔顿、约8,900,000道尔顿、约9,000,000道尔顿、约9,100,000道尔顿、约9,200,000道尔顿、约9,300,000道尔顿、约9,400,000道尔顿、约9,500,000道尔顿、约9,600,000道尔顿、约9,700,000道尔顿、约9,800,000道尔顿、约9,900,000道尔顿或约10,000,000道尔顿、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意重量。

162.根据权利要求150至161中任一项所述的方法，其中所述交联透明质酸中的所述透明质酸包括具有至少两种不同分子量的透明质酸组分的混合物。

163.根据权利要求150至162中任一项所述的方法，其中所述胶原蛋白包括I型胶原蛋白和/或III型胶原蛋白。

164.根据权利要求150至163中任一项所述的方法，其中所述方法不会在注射部位引起蓝色变色。

165.根据权利要求150至164中任一项所述的方法，其中所述组合物具有增强的通过针的可挤出性，其中所述针包括27G、28G、29G、30G、31G或32G的计量尺寸。

166.一种通过将组合物注射到人体组织中以改善人体外观的方法，由此所述组合物促进从周围组织到注射的组合物中的细胞浸润和胶原蛋白沉积，该方法包括：

将组合物注射到人体组织中，由此提高解剖特征的美学质量；

其中所述组合物包含交联的大分子基质，该大分子基质包含：

透明质酸；

赖氨酸；和

胶原蛋白；

其中所述透明质酸包括与胶原蛋白物理混合的交联透明质酸；和

其中注射有所述组合物的组织显示出具有组织整合性。

167.根据权利要求166所述的方法，其中所述组合物还包含利多卡因。

168.根据权利要求166或167所述的方法、其中所述透明质酸组分的平均分子量为约10,000道尔顿、约20,000道尔顿、约30,000道尔顿、40,000道尔顿、约50,000道尔顿、约60,000道尔顿、约70,000道尔顿、约80,000道尔顿、约100,000道尔顿、约200,000道尔顿、约300,000道尔顿、约400,000道尔顿、约500,000道尔顿、约600,000道尔顿、约700,000道尔顿、约800,000道尔顿、约900,000道尔顿、约1,000,000道尔顿、约1,100,000道尔顿、约1,200,000道尔顿、约1,300,000道尔顿、约1,400,000道尔顿、约1,500,000道尔顿、约1,600,000道尔顿、约1,700,000道尔顿、约1,800,000道尔顿、约1,900,000道尔顿、约2,000,000道尔顿、约2,100,000道尔顿、约2,200,000道尔顿、约2,300,000道尔顿、约2,400,000道尔顿、约2,500,000道尔顿、约2,600,000道尔顿、约2,700,000道尔顿、约2,800,000道尔顿、约2,900,000道尔顿、约3,000,000道尔顿、约3,100,000道尔顿、约3,200,000道尔顿、约3,300,000道尔顿、约3,400,000道尔顿、约3,500,000道尔顿、约3,600,000道尔顿、约3,700,000道尔顿、约3,800,000道尔顿、约3,900,000道尔顿、约4,000,000道尔顿、约4,100,000道尔顿、约4,200,000道尔顿、约4,300,000道尔顿、约4,400,000道尔顿、约4,500,000道尔顿、约4,600,000道尔顿、约4,700,000道尔顿、约4,800,000道尔顿、约4,900,000道尔顿、约5,000,000道尔顿、约5,100,000道尔顿、约5,200,000道尔顿、约5,300,000道尔顿、约5,400,000道尔顿、约5,500,000道尔顿、约5,600,000道尔顿、约5,700,000道尔顿、约5,800,000道尔顿、约5,900,000道尔顿、约6,000,000道尔顿、约6,100,000道尔顿、约6,200,000道尔顿、约6,300,000道尔顿、约6,400,000道尔顿、约6,500,000道尔顿、约6,600,000道尔顿、约6,700,000道尔顿、约6,800,000道尔顿、约6,900,000道尔顿、约7,000,000道尔顿、约7,100,000道尔顿、约7,200,000道尔顿、约7,300,000道尔顿、约7,400,000道尔顿、约7,500,000道尔顿、约7,600,000道尔顿、约7,700,000道尔顿、约7,800,000道尔顿、约7,900,000道尔顿、约8,000,000道尔顿、约8,100,000道尔顿、约8,200,000道尔顿、约8,300,000道尔顿、约8,400,000道尔顿、约8,500,000道尔顿、约8,600,000道尔顿、约8,700,000道尔顿、约8,800,000道尔顿、约8,900,000道尔顿、约9,000,000道尔顿、约9,100,000道尔顿、约9,200,000道尔顿、约9,300,000道尔顿、约9,400,000道尔顿、约9,500,000道尔顿、约9,600,000道尔顿、约9,700,000道尔顿、约9,800,000道尔顿、约9,900,000道尔顿或约10,000,000道尔顿、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意重量。

169.根据权利要求166至168中任一项所述的方法，其中所述交联透明质酸中的所述透明质酸包括具有至少两种不同分子量的透明质酸组分的混合物。

170.根据权利要求166至169中任一项所述的方法，其中所述胶原蛋白包括I型胶原蛋白和/或III型胶原蛋白。

171.根据权利要求166至170中任一项所述的方法，其中注射有所述组合物的组织显示出具有进入组合物中的组织整合性，并且通过来自周围组织的细胞浸润而在所述组合物中沉积胶原蛋白。

172.根据权利要求166至171中任一项所述的方法，其中注射有所述组合物的组织显示出具有进入组合物中的组织整合性，并且在注射所述组合物后在所述组合物中沉积胶原蛋白。

173.根据权利要求166至172中任一项所述的方法，其中所述组合物具有增强的通过针的可挤出性，其中所述针包括27G、28G、29G、30G、31G或32G的计量尺寸。