CN115598242A - 法匹拉韦及其关键中间体含量的hplc检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种法匹拉韦及其关键中间体含量的HPLC检测方法，涉及高效液相色谱分析技术领域，本发明采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的反相色谱柱，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，采用紫外检测器对法匹拉韦原料药中的关键中间体进行检测；本发明检测方法的分离度好，专属性强，灵敏度高且准确，能同时有效分离法匹拉韦及其关键中间体3,6‑二氯吡嗪‑2‑甲腈和3,6‑二氟吡嗪‑2‑甲腈，对匹拉韦原料药的质量控制具有重要的现实意义。

Description

法匹拉韦及其关键中间体含量的HPLC检测方法
技术领域：
本发明涉及高效液相色谱分析技术领域，具体涉及一种法匹拉韦及其关键中间体含量的HPLC检测方法。
背景技术：
法匹拉韦，由日本富士胶卷富山化学研制，该药物于2014年3月在日本批准上市，用于甲型、乙型流感的抗病毒治疗。法匹拉韦是一种流感治疗药物，与很多抗流感药物具有不同的作用机制。达菲等药物是通过阻止增殖的病毒钻到细胞外以防止感染加重，而法匹拉韦是通过阻碍细胞内的基因复制从而遏制病毒本身增殖。由于流感病毒和埃博拉病毒类似，都是RNA病毒，所以法匹拉韦有可能阻碍埃博拉病毒在细胞内增殖，从而遏制感染。
法匹拉韦的分子式为C5H4FN3O2，化学名称为6-氟-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺，结构式如下：
Figure BDA0003864453890000011
专利CN106866553B公开了一种法匹拉韦的合成方法，以3-氨基吡嗪-2-羧酸为起始原料，经8步反应合成法匹拉韦，总收率为26％。合成路线如下：
Figure BDA0003864453890000012
该专利中的最后三步反应采用一锅法完成，简化了操作，提高了收率，绿色环保，但法匹拉韦产品中不可避免地含有中间体6(3,6-二氯吡嗪-2-甲腈)和中间体6-1(3,6-二氟吡嗪-2-甲腈)，且由于这两种中间体的结构接近而无法对其进行有效分离。
目前尚没有公开报道可有效分离法匹拉韦产品中中间体3,6-二氯吡嗪-2-甲腈和3,6-二氟吡嗪-2-甲腈并定量测定这两种中间体存在水平的分析方法，因此开发一种采用HPLC分离测定法匹拉韦纯度及含量的方法，对法匹拉韦的质量控制具有极其重要的意义。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题在于提供一种法匹拉韦及其关键中间体含量的HPLC检测方法，能有效分离法匹拉韦及其关键中间体3,6-二氯吡嗪-2-甲腈和3,6-二氟吡嗪-2-甲腈，并定量测定其存在水平，该方法分离度好，专属性强，灵敏度高且准确，对法匹拉韦原料药的质量控制具有重要意义。
本发明所要解决的技术问题采用以下的技术方案来实现：
本发明的目的在于提供一种法匹拉韦及其关键中间体含量的HPLC检测方法，采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的反相色谱柱，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，采用紫外检测器对法匹拉韦原料药中的关键中间体进行检测。
所述关键中间体为3,6-二氯吡嗪-2-甲腈和3,6-二氟吡嗪-2-甲腈。
所述梯度洗脱的程序如下：
Figure BDA0003864453890000021
所述流动相A为0.05％磷酸水溶液，流动相B为乙腈。
所述紫外检测器的检测波长在210～280nm。
所述流动相的流速为0.5～1.5mL/min。
所述色谱柱的温度为20～60℃。
所述反相色谱柱的柱长为150～250mm，直径为2.0～4.6mm，填料粒径为3.0～5.0μm。
所述法匹拉韦原料药的进样浓度为0.1～5.0mg/mL，进样体积为1～100μL。
所述法匹拉韦原料药的稀释溶剂为甲醇水溶液，优选50％甲醇水溶液。
本发明的有益效果是：
(1)本发明填补了同时分离法匹拉韦及其关键中间体3,6-二氯吡嗪-2-甲腈和3,6-二氟吡嗪-2-甲腈并定量测定其存在水平的空白，能够快速检测法匹拉韦原料药中是否含有中间体3,6-二氯吡嗪-2-甲腈和3,6-二氟吡嗪-2-甲腈，以及准确测定出法匹拉韦与中间体3,6-二氯吡嗪-2-甲腈和3,6-二氟吡嗪-2-甲腈的含量。
(2)本发明检测方法的分离度好，专属性强，灵敏度高且准确，能同时有效分离法匹拉韦及其关键中间体3,6-二氯吡嗪-2-甲腈和3,6-二氟吡嗪-2-甲腈，对匹拉韦原料药的质量控制具有重要的现实意义。
附图说明：
图1为实施例1中空白溶液的色谱图；
图2为实施例1中供试品溶液的色谱图；
图3为实施例1中系统适用性溶液的色谱图。
具体实施方式：
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例和图示，进一步阐述本发明。
实施例1
1、色谱条件
仪器：岛津LC-20A液相色谱仪；
色谱柱：C18，4.6×250mm，5μm；
检测器：UV检测器，检测波长210nm；
流速：1.0mL/min；
柱温：35℃；
溶剂：50％甲醇水；
流动相A：0.05％磷酸水溶液；
流动相B：乙腈。
梯度洗脱的程序如下：
Figure BDA0003864453890000041
2、溶液配制
(1)空白溶液：溶剂。
(2)供试品溶液：精密称取20mg法匹拉韦供试品至50mL容量瓶中，加溶剂溶解并定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
(3)对照品溶液：精密称取20mg法匹拉韦对照品至50mL容量瓶中，加溶剂溶解并定容至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
(4)中间体A母液：精密称取10mg 3,6-二氯吡嗪-2-甲腈对照品至25mL容量瓶中，用溶剂定容至刻度，摇匀，作为中间体A母液。
(5)中间体B母液：精密称取10mg 3,6-二氟吡嗪-2-甲腈对照品至25mL容量瓶中，用溶剂定容至刻度，摇匀，作为中间体B母液。
(6)系统适用性溶液：精密称取20mg法匹拉韦对照品及中间体A母液和中间体B母液各0.5mL至50mL容量瓶中，用溶剂定容至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液。
3、进样分析
以初始条件平衡仪器，待基线平衡后，分别取空白溶液、供试品溶液、系统适用性溶液、对照品溶液各10μL，采用上述色谱条件进样检测，记录扣除空白峰的样品溶液图谱，以面积归一法计算纯度或杂质含量，以外标法计算目标物质的含量，检测结果如表1。
表1
Figure BDA0003864453890000051
从图1-3可以看出，由本发明方法获得的法匹拉韦主峰及杂质峰均能有效分离，分离度R大于1.5；主要峰的峰形良好，理论塔板数均大于2000。说明采用本发明方法检测法匹拉韦及中间体稳定可靠，重现性好，结果灵敏且准确，可以有效地对法匹拉韦产品质量进行控制。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (9)

1.法匹拉韦及其关键中间体含量的HPLC检测方法，其特征在于：采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的反相色谱柱，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，采用紫外检测器对法匹拉韦原料药中的关键中间体进行检测；
所述梯度洗脱的程序如下：
Figure FDA0003864453880000011
所述流动相A为0.05％磷酸水溶液，流动相B为乙腈。
2.根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于：所述关键中间体为3,6-二氯吡嗪-2-甲腈和3,6-二氟吡嗪-2-甲腈。
3.根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于：所述紫外检测器的检测波长在210～280nm。
4.根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于：所述流动相的流速为0.5～1.5mL/min。
5.根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于：所述色谱柱的温度为20～60℃。
6.根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于：所述反相色谱柱的柱长为150～250mm，直径为2.0～4.6mm，填料粒径为3.0～5.0μm。
7.根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于：所述法匹拉韦的进样浓度为0.1～5.0mg/mL，进样体积为1～100μL。
8.根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于：所述法匹拉韦的稀释溶剂为甲醇水溶液。
9.根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于：所述法匹拉韦的稀释溶剂为50％甲醇水溶液。
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