CN1155722C - 孕前基因报警诊断试剂盒及其检测方法 - Google Patents

孕前基因报警诊断试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明为孕前基因报警诊断试剂盒及其检测方法，包括提取受检者DNA模板的DNA提取液，用来扩增受检者基因组DNA上特异片段的PCR混合液，DNA聚合酶，PCR产物酶切混合液，限制性内切酶，以及纯合突变的阳性对照模板和用以PCR反应的联管。所说的报警基因包括N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶和甲硫氨酸合酶还原酶基因，其突变位点分别为677胞嘧啶→胸腺嘧啶和66腺嘌呤→鸟嘌呤，其引物序列分别为5’-TGA AGG AGA AGG TGT CTG CGG GA-3’，5’-AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG-3’，5’-GCA AAG GCCATC GCA GAA GAC AT-3’，5’-GTG AAG ATC TGC AGA AAA TCCATG TA-3’。可在孕前诊断子代是否发生神经管畸形。

Description

孕前基因报警诊断试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及一种通过怀孕前检测亲代双方多种基因突变位点而预报/诊断子代是否发生神经管畸形(neurae tube defects，缩写NTDs)的基因报警试剂盒及其检测方法。
背景技术
神经管畸形(neurae tube defects，缩写NTDs)是一组主要包括无脑儿和脊柱裂等表现型的严重出生缺陷疾病，是我国和全世界出生婴儿中发病多且临床后果最严重的出生缺陷病之一。在我国神经管畸形的发病率为3.0‰，部分北方地区的神经管畸形发病率高达10～20‰，是目前已知世界上神经管畸形最高发的地区。我国每年至少有10万名神经管畸形儿出生(占全世界每年发生神经管畸形患儿总数的1/4～1/3)，是世界上神经管畸形的高发国之一，也是严重影响我国优生优育、提高人口质量的一个最突出的卫生问题。国内外目前的有关神经管畸形诊断/报警技术中，主要使用的是产前诊断(又称宫内诊断或出生前诊断)方法，这些方法包括羊水甲胎蛋白测定、染色体异常检测、孕早期取绒毛活检、胎儿镜观察、B超或彩超观察和X线照射观察等。上述方法虽然可以诊断神经管畸形，但有一严重缺陷，即必须是在胎儿至少发育到一定程度上(妊娠14～20周)，脑和脊柱成形以后，神经管畸形才可诊断。因此，达不到怀孕前预警/诊断神经管畸形的目的；并且，上述方法对胚胎生长发育有一定的副作用，因此必须寻求能够更加早期、安全和灵敏的检测方法。
本发明的目的就是提供一种早期、安全、方便、快速且灵敏的预报子代是否发生神经管畸形的孕前基因报警诊断试剂盒和用该试剂盒检测的方法。
发明内容
本发明孕前基因报警诊断试剂盒，包括提取受检者DNA模板的DNA模板提取液，用来扩增受检者基因组DNA上特异片段的PCR反应混合液，DNA聚合酶，PCR产物酶切反应混合液，限制性内切酶以及纯合突变的阳性对照模板和用以PCR反应的联管，报警基因包括N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶mthfr和甲硫氨酸合酶还原酶mtrr，上述报警基因的突变位点分别为677胞嘧啶→胸腺嘧啶和66腺嘌呤→鸟嘌呤，其引物序列分别为5’-TGA AGG AGA AGG TGT CTG CGGGA-3’，5’-AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG-3’和5’-GCA AAGGCC ATC GCA GAA GAC AT-3’，5’-GTG AAG ATC TGC AGAAAA TCC ATG TA-3’。
本发明受检者DNA模板从受检者外周微量全血中提取。
本发明包括由回收和纯化了mthfr和mtrr纯合突变者的PCR产物作为阳性对照模板或直接序列合成阳性对照模板。
本发明由DNA模板提取液，酶切反应混合液，PCR反应混合液，DNA聚合酶，限制性内切酶，纯合突变阳性对照模板分别分装于25ml螺口瓶、1.5ml微量离心管和0.5ml微量离心管中，组装成的试剂盒在-20℃下保存。
本发明DNA模板提取液是由红细胞裂解液和含有或不含有非离子去污剂和蛋白酶K的聚合酶链反应(PCR)缓冲液组成，PCR反应混合液包括N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶PCR混合液和甲硫氨酸合酶还原酶PCR混合液，分别由去离子水，聚合酶链反应缓冲液、腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、氯化镁和上下游引物配制而成，酶切反应混合液包括N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶酶切混合液，甲硫氨酸合酶还原酶酶切混合液，分别由酶切缓冲液，乙酰化牛血清白蛋白和去离子水配制而成。
本发明检测神经管畸形的方法，包括(a)从取自受检者耳血或指尖微量血样品中提取DNA模板；(b)分别用两对PCR引物扩增mthfr和mtrr基因组DNA上的特异片段；(c)分别用限制性内切酶对PCR产物进行酶切；(d)电泳分离酶切产物并用溴化乙啶染色，在紫外透射仪下读取并记录结果。
本发明同时用阳性对照模板进行(b)、(c)、(d)步骤，电泳后根据mthfr阳性模板两条带和mtrr阳性模板一条带出现与否及其位置来判定PCR反应体系和酶切反应体系的效率。
本发明优点和效果如下：
神经管畸形是一种多病因多基因遗传病，遗传因素和营养因素、环境因素在发病中起重要作用。大量的国内外研究报道证明，叶酸可有效预防神经管畸形的发生，例如：在我国北方(河北、山西)地区，孕前后期服用叶酸可防治85％神经管畸形的发生，说明叶酸缺乏是神经管畸形发生的一个重要环境营养因素；进一步的分子遗传学研究发现，N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶和甲硫氨酸合酶还原酶是叶酸代谢的关键酶，其基因结构改变，导致酶功能降低会直接或间接影响核酸的生物合成，进而引起遗传缺陷，尤其是引起早胚(妊娠第3周)神经管发育异常，从而产生神经管畸形；因此，建立与神经管畸形发生相关的基因诊断技术是该病早期诊断的一条必由之路。本发明的神经管畸形孕前基因报警诊断试剂盒中具有检测上述2种酶基因结构变异(基因突变)的引物序列：
1、N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶及突变位点N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因定位于人类1号常染色体短臂上(1p36.3)，有1个与神经管畸形发生相关的基因突变位点，即N5，N10-亚甲四氢叶酸还原酶基因的第677位点碱基上发生胞嘧啶(C)→胸腺嘧啶(T)突变。
C677T(丙氨Ala→缬氨酸Val)的引物序列是：
5’-TGA AGG AGA AGG TGT CTG CGG GA-3。
5’-AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG-3’
1、甲硫氨酸合酶还原酶及突变位点
甲硫氨酸合酶还原酶基因定位于人类5号常染色体的短臂上(5p15.2-15.3)，有1个与神经管畸形发生相关的基因突变位点，即甲硫氨酸合酶还原酶基因的第66位点碱基上发生腺嘌呤(A)→鸟嘌呤(G)突变。
A66G(异亮氨酸Ile→蛋氨酸Met)的引物序列是：
5’-GCA AAG GCC ATC GCA GAA GAC AT-3’
5’-GTG AAG ATC TGC AGA AAA TCC ATG TA-3’
本发明提出的上述2种引物序列在神经管畸形孕前基因报警中具有重要价值，故是本发明最重要的组成成分。在此基础上增加报警基因及其引物序列仍在本发明的范围内。
本发明发现和证明：神经管畸形父母双方N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)和甲硫氨酸合酶还原酶(MTRR)的纯合突变率都明显高于对照人群，而且父母双方同时具有mthfr和mtrr纯合突变基因型比单独具有一个突变基因型者，生育NTDs(神经管畸形)儿的危险性更大。因此，本发明决定选择mthfr和mtrr作为试剂盒中的NTDs相关基因，进行其基因的多态性检测。
采用病例—对照(1∶2)研究方法并应用小试生产的试剂盒，对38名NTDs父母(76例)和76名正常儿父母(152例)的mthfr和mtrr基因型进行了检测，结果见下表：
     表    病例组与对照组mthfr和mtrr联合突变基因型构成比的比较
           4个位点     3个位点      2个位点      2个以上位点     总人数
           纯合突变    纯合突变     纯合突变     纯合突变总计    (对)
           n(％)       n(％)        n(％)        n(％)
NTDs父母  4(10.53)    13(34.21)    19(50.0)     36(94.74)        38
对照父母   0(0.0)      3(3.95)      11(14.47)    14(18.42)        76
由表中可见，NTDs父母具有2个以上纯合突变位点者占94.74％，而对照父母只有18.42％。可以认为：父母双方mthfr和mtrr基因的联合突变是NTDs重要的遗传病因。
因此，本发明选择MTHFR和MTRR作为NTDs的孕前检测报警基因。
试剂盒设计采用多聚酶链式反应—限制性片段长度多态性分析方法(PCR-RFLP)。多聚酶链式反应简称PCR技术，是近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。利用此法可在数小时内在试管中获得数百万个特异DNA序列的拷贝，因此虽然该技术问世时间仅数年，但它已迅速渗透到分子生物学的各个领域，尤其在遗传病(或遗传易感性疾病)的基因诊断等方面得到了广泛应用。在非缺失型疾病中，基因位点的突变往往会产生新的或消除原有的内切酶位点。而某一(些)酶位点的改变往往与不同的遗传性疾病有连锁关系。因此，分析基因组DNA上多态性位点及新酶切位点的产生或原有切点的消失引起的酶切片段长度变化是进行遗传病诊断的重要手段。PCR结合RFLP进行基因诊断的方法具有简便、快速、灵敏度高及读取结果直观等特点，尤其是DNA用量极少(可仅为几个拷贝)，对被检测人无伤害，使这一方法更有可能得到普及。
从原理上说，设计一对适当的引物，使扩增片段包含一个或数个多态性的限制性内切酶识别序列，在适合的PCR反应条件下(包括模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸以及DNA聚合酶)进行扩增，PCR后，用该限制酶酶切PCR产物，根据电泳后酶切片段长度的变化，即可作出诊断。
如图2所示，mthfr基因突变后可产生一个HinfI酶切位点，其PCR产物(198bp)经HinfI酶切可以得到三种情况：一是酶切后，PCR产物长度没有变化，说明扩增片段不含此酶切位点，为正常状态(-/-)；二是酶切后，PCR产物部分被切开，为杂合突变型(+/-)，即一条染色体上有此酶切位点，而其等位基因上没有；三是酶切后，PCR产物全部被切开，为纯合突变型(+/+)。mtrr基因突变后可使一个Nde I酶切位点消失，其PCR产物(66bp)经Nde I酶切可以得到三种情况：一是酶切后，PCR产物长度没有变化，说明扩增片段不含此酶切位点，为纯合突变(+/+)；二是酶切后，PCR产物部分被切开，为杂合突变型(+/-)，即一条染色体上有此酶切位点，而其等位基因上没有；三是酶切后，PCR产物全部被切开，为正常状态(-/-)。
利用本发明对mthfr和mtrr进行基因多态性分析方法成熟、操作简便、结果稳定可靠，操作人员不需特殊培训，一般配备了PCR仪的分子生物学实验室均可完成。
从血液中分离纯化核酸的方法较多，也很成熟。但绝大多数方法都很繁琐，涉及CsCl离心和(或)酚/氯仿抽提，而且需要至少抽取2毫升静脉血，对被检测者的伤害较大；用这些方法提取的DNA都是高度纯化核酸，这种纯化核酸可用于PCR，但PCR扩增对模板的要求并不很高，采用一些对被检测者损伤小、更简单的方法就可以获得较理想的PCR扩增结果。
因此，本发明选择了从外周微量全血细胞中制备DNA的方法。该方法只需要吸取耳血(或指尖微量血)10～20微升，操作步骤简单，不需要特殊仪器和(或)试剂，而且对被检测者几无伤害。该方法的基本原理是：首先用红细胞裂解液使红细胞溶解，离心后即可去除大部分红细胞碎片；然后用含非离子去污剂和蛋白酶K的PCR缓冲液处理白细胞，使待扩增DNA暴露，以便与引物复性；最后煮沸5分钟灭活蛋白酶K。微量全血经上述简单处理后即可用于PCR扩增反应。
对整个PCR扩增体系而言，引物的设计占有十分重要的地位。针对本试剂盒的检测目的，有若干对引物可供选择。本发明的两对引物遵循引物设计的总体原则，且对模板基因组DNA无过高要求，并具有扩增效率高，特异性好的优点。
PCR类试剂盒的检测效果不仅与试剂盒本身的生产工艺、储存条件和时间等有关，还受检测者的操作影响。为了确保检测的质量，本发明在每一个试剂盒中都放有阳性对照模板，以保证在每次检测时都有阳性对照。
本发明分别用回收和纯化了mthfr和mtrr纯合突变者的PCR产物作为阳性对照模板或直接序列合成阳性对照模板。在用本试剂盒进行检测时，同时对阳性对照模板进行PCR扩增和PCR产物的酶切反应。电泳后判断结果时，mthfr阳性模板出现两条带(175bp和23bp)，mtrr阳性模板出现一条带(66bp)，如无条带出现，则表明检测无效。
综上所述，本发明的基本反应模式为PCR和RFLP方法的结合。选用的报警基因为mthfr和mtrr选用的DNA模板提取方法为外周微量全血DNA提取法，选用的阳性对照模板分别为mthfr和mtrr纯合突变者的PCR扩增产物或直接序列合成阳性对照模板。检测快速、安全、方便、灵敏，可提供早期基因报警而对受检者无副作用。
附图说明
图1为本发明基因报警试剂盒组成示意图。
图2为mthfr和mtrr基因多态性分析图。
图3为本发明的检测流程图。
具体实施方式
如下是本发明的实施例：
附图1中DNA提取液是由红细胞裂解液和聚合酶链反应(PCR)缓冲液/非离子去污剂/蛋白酶K组成。其中，红细胞裂解液为灭菌三蒸水，聚合酶链反应(PCR)缓冲液/非离子去污剂/蛋白酶K由三羟甲基氨基甲烷(Tris)、氯化镁(MgCl2)、曲拉通X-100(TritonX-100)、吐温-20(Tween-20)、润湿剂p-40(NP-40)以及蛋白酶K(proteinase K)配制而成；其他成分由聚合酶链反应(PCR)混合液、酶切混合液、DNA聚合酶(Taq酶)溶液以及限制性内切酶溶液组成。其中，聚合酶链反应(PCR)混合液包括N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶聚合酶链反应(PCR)混合液、甲硫氨酸合酶还原酶聚合酶链反应(PCR)混合液，分别由去离子水、聚合酶链反应(PCR)缓冲液(由氯化钾、硫酸铵、氯化镁、三羟甲基氨基甲烷及润湿剂p-40组成)、脱氧核苷酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)、氯化镁和上下游引物配制而成，酶切混合液包括N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶酶切混合液、甲硫氨酸合酶还原酶酶切混合液，分别由酶切缓冲液(由三羟甲基氨基甲烷、氯化镁、氯化钠、二硫苏糖醇组成)、乙酰化牛血清白蛋白(BSA)和去离子水配制而成，DNA聚合酶(Taq酶)溶液由DNA聚合酶溶于储存液而成，储存液成分为三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)、乙二胺四乙酸(EDTA)、吐温-20(Tween-20)、润湿剂p-40(NP-40)、二硫苏糖醇(DTT)以及甘油，限制性内切酶溶液为HinfI和Nde I内切酶分别溶于储存液而成，储存液成分为三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)、氯化钠(NaCl)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二硫苏糖醇(DTT)、乙酰化牛血清白蛋白(BSA)以及甘油。
附图3中最终检测结果的判定如下：
1、N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因
C677T突变扩增产物为198个碱基对(198bp)，该位点的突变产生一个Hinf I酶切识别位点，经HinfI酶切后结果判定如下：
纯合突变型       杂合突变型          正常野生型
175bp+23bp         198bp+175bp+23bp    198bp
2、甲硫氨酸合酶还原酶基因
A66G突变扩增产物为66个碱基对(66bp)，该基因突变去除一个Nde I酶切识别位点，经Nde I酶切后结果判定如下：
纯合突变型          杂合突变型        正常野生型
66bp                66bp+44bp+22bp    44bp+22bp
本发明的最大特点是：通过提取亲代(未怀孕的夫妇双方)外周微量血中的基因组DNA，检测与神经管畸形发生有关的2种关键基因突变(如前所述)，就可达到预警该夫妇未来子代是否有发生神经管畸形的可能性。

Claims (7)

1、一种孕前基因报警诊断试剂盒，包括提取受检者DNA模板的DNA模板提取液，用来扩增受检者基因组DNA上特异片段的PCR反应混合液，DNA聚合酶，PCR产物酶切反应混合液，限制性内切酶以及纯合突变的阳性对照模板和用以进行PCR反应的联管，其特征在于报警基因包括N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶mthfr和甲硫氨酸合酶还原酶mtrr，N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶mthfr基因的突变位点是677胞嘧啶→胸腺嘧啶和甲硫氨酸合酶还原酶mtrr基因的突变位点是66腺嘌呤→鸟嘌呤，其引物序列分别为5’-TGA AGG AGA AGG TGT CTGCGG GA-3’，5’-AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG-3’和5’-GCAAAG GCC ATC GCA GAA GAC AT-3’，5’-GTG AAG ATC TGCAGA AAA TCC ATG TA-3’。
2、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于受检者DNA模板从受检者外周微量全血中提取。
3、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于包括由回收和纯化了mthfr和mtrr纯合突变者的PCR产物作为阳性对照模板或直接序列合成阳性对照模板。
4、根据权利要求1或2或3所述的试剂盒，其特征在于DNA模板提取液，酶切反应混合液，PCR反应混合液，DNA聚合酶，限制性内切酶，纯合突变阳性对照模板分别分装于25ml螺口瓶、1.5ml微量离心管和0.5ml微量离心管中，组装成的试剂盒在-20℃下保存。
5、根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于DNA模板提取液是由红细胞裂解液和含有或不含有非离子去污剂和蛋白酶K的聚合酶链反应PCR缓冲液组成，PCR反应混合液包括N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶聚合酶链反应PCR混合液和甲硫氨酸合酶还原酶聚合酶链反应PCR混合液，分别由去离子水，聚合酶链反应缓冲液，腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶，氯化镁和上下游引物配制而成，酶切反应混合液包括N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶酶切混合液、甲硫氨酸合酶还原酶酶切混合液，分别由酶切缓冲液、乙酰化牛血清白蛋白和去离子水配制而成。
6、根据权利要求1所述的试剂盒报警诊断神经管畸形的方法，包括(a)从取自受检者耳血或指尖微量血样品中提取DNA模板；(b)分别用两对PCR引物扩增mthfr和mtrr基因组DNA上的特异片段，(c)分别用限制性内切酶对PCR产物进行酶切；(d)电泳分离酶切产物并用溴化乙啶染色，在紫外透射仪下读取并记录结果。
7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于同时用阳性对照模板进行(b)、(c)、(d)步骤，电泳后根据mthfr阳性模板两条带和mtrr阳性模板一条带出现与否及其位置来判定PCR反应体系和酶切反应体系的效率。
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